CN109022536A - 溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法，配制适于食醋中产气菌生长繁殖的培养基，在培养基中加入溴甲酚紫指示剂，另配制含量接近13.5％的葡萄糖溶液，培养基与葡萄糖溶液分开灭菌后再组合用于产气菌的培养，待测醋液的pH调至6.5‑7.0后接种到培养基上，33±1℃培养48±2h后观察，若培养液为黄色或者杜氏小管中有气泡或者培养液浑浊，则说明被测原样中有产气菌；若培养液为紫色且杜氏小管内无气泡，则说明被测原样中无产气菌。本方法能够准确区分被测醋液中产气菌的含量级别，并且对于产气菌含量较低的醋液也能够准确判断其含有产气菌，检测结果准确。

Description

溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法

技术领域

本发明涉及食醋质量检测领域，更具体地，本发明涉及一种利用溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法。

背景技术

醋是中国各大菜系中传统的调味品，据有文献记载的酿醋历史约有三千多年。食醋不仅有酸味，还有一定的鲜味、甜味和香气，它能增进食欲，帮助消化并且具有良好的保健功能，防治多种疾病。食醋是以大米为原料，经蒸煮、制曲、糖化、酒精发酵等工艺生产出来的调味品，营养极其丰富，主要成分为醋酸，还含有琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸等多种有机酸，同时还含有氨基酸类、糖类、脂类、无机盐类、维生素等，因此为微生物的繁殖提供了良好的碳源、氮源、无机盐等丰富的营养物质，在食醋灭菌工艺中，仍然有耐高温、厌氧的产气菌存活下来，而产气菌的繁殖会导致食品包装瓶涨瓶，引起食醋生产过程中涨罐等问题，因此需建立一种快速检测食醋中产气菌的检测方法，使企业的食醋质量风险降到最低。

现有的行业技术是MRS法用作培养基检测产气菌，这是一种通用方法，但不适用于食醋，通过这种方法，无法检测出食醋的产气菌，无法及时发现生产上的不合格品，导致市面上出现涨瓶、涨袋等现象。

中国专利申请文件CN104313112A公开了一种用于检测食醋中产气、产膜菌的培养基及检测方法，以土豆、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏和硫酸铵等原料制成液体培养基，以装有杜氏小管的试管接种待测食醋样品后培养72小时进行观察，可在一定程度上检测食醋中的产气、产膜菌，但是培养时间较长，效率不够高，且不能全面检测产气菌，当食醋中的产气菌含量较低时检测不出来，因此检测结果不够准确。

中国专利申请文件CN105002260A公开了一种用于检测引起酱油变质的微生物的培养基及检测方法，以蛋白胨、酪蛋白、酵母膏、牛肉膏、葡萄糖和氯化钠为原料制成液体培养基，调节pH至5.0±0.2，灭菌后接种待测酱油样品，培养后观察结果，利用甲基红指示剂检测培养液颜色是否变黄从而确定被测酱油样品中是否具有产气菌。该方法能够在较快的时间内准确地检测酱油中是否含有产气菌，但是将该方法用于食醋中产气菌的检测，发现其检测限较高，当酸性调味品中的产气菌含量较低时，检测不出来，影响对食醋质量的准确判断，基于此，需要建立一种能够快速检测食醋中产气菌的方法。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，利用溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌，全面检测食醋中的产气菌种类，并且降低检出限，提高检测结果的准确性。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法，包括以下步骤：

(1)配制培养基

称取溴甲酚紫0.1g，加入95％酒精定容至100mL，制成溴甲酚紫溶液；

称取牛肉膏2-3g、蛋白胨3-5g、硫酸镁0.55-0.60g、硫酸铵1.60-1.65g和磷酸氢二钾0.2-0.3g，用蒸馏水搅拌溶解并定容至1000mL，待液体均匀后加入2mL所述溴甲酚紫溶液，置于烧杯中，即成目的培养基；

另称取13.5g葡萄糖，用蒸馏水溶解后定容至100mL，制成质量含量接近13.5％的葡萄糖溶液并置于锥形瓶中；

(2)培养基分装与灭菌

将所述目的培养基分装到装有杜氏小管的试管中，每管8mL，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，另将装有所述质量含量接近13.5％的葡萄糖溶液的锥形瓶瓶口包扎密封，然后一同放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌时，葡萄糖溶液和目的培养基必须是分开的；

(3)接种与培养

取10mL醋液于烧杯中，将其pH调至6.5-7.0后作为待测原样备用；取步骤(2)中的3根培养基试管，各加入所述待测原样1mL及步骤(2)灭菌后的葡萄糖溶液1mL，作为检测样，同时取1根培养基试管仅加入步骤(2)灭菌后的葡萄糖溶液1mL，作为空白样；将检测样和空白样摇匀后于33±1℃培养48±2h；

(4)结果观察

培养完成后，取出各试管，注意不能摇动试管，仔细观察培养液：若培养液为黄色或者杜氏小管中有气泡或者培养液浑浊，则说明被测原样中有产气菌；若培养液为紫色且杜氏小管内无气泡，则说明被测原样中无产气菌。

所述的溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法的步骤(2)中灭菌的条件是：0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。

所述的溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法的步骤(3)调节醋液pH值采用的方法是：用饱和碳酸钠溶液调节。

下面对本发明的技术方案进行进一步的说明。

本发明优化适合食醋产气菌生长的选择性培养基，基于微生物产气的同时也会有产酸的风险的原理，所以在培养基中加入一定范围的指示剂，通过产酸来判断食醋被测原样中是否含有产气菌，具体做法是，利用杜氏小管中有无气泡的存在以及溴甲酚紫溶液在一定pH范围中变色的特异性，从而判断被测原样是否有产气的风险。

微生物生长的需要营养物质，包括水、能源、氮源、维生素、生长因子、矿物质等，本发明优选培养基，其中牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨提供氮源和维生素，硫酸镁提供了无机盐，硫酸铵则提供氮源，磷酸氢二钾作为缓冲剂，各个原料按以上比例配制，满足食醋中特有的产气菌生长、繁殖及完成各种生理活动所需的物质。该培养基原料物质成本低且常见，使各营养物质得到充分的应用。

溴甲酚紫为酸碱指示剂，其变色范围为pH值为5.2(黄)-6.8(紫)，若将待测原液的pH值调至中性的环境下，产气菌在生长的过程中就会产酸，在指示剂的作用下，溶液将从紫色变成黄色，变化明显，易于区分。因葡萄糖灭菌温度过高会产生5－羟甲基糠醛，使培养基颜色变深，且糠醛对菌体生长有一定的副作用。所以在利用指示剂的变色范围来判断产气菌的存在时，需分别灭菌，便于结果的判断。

食醋中的有害微生物可能有多类，对于兼氧或厌氧微生物，以液体培养基进行培养，则在液体中或底部生长繁殖，若产生气体便会进入倒管，因此观察是否产气可在发酵培养基中倒置放入杜氏小管，培养后观察倒置小管中有无气泡。对于好氧微生物，培养过程在液体培养基的表面或上部生长繁殖，产生的气泡集中在菌膜里面或试管的液面上部而不能进入杜氏小管(因为杜氏小管在液体的底部)；这类微生物在糖代谢过程中，分解葡萄糖大量产酸，加入溴甲酚紫指示剂呈黄色，因此观察培养基的变色情况来作为判定异常菌的依据。

利用杜氏小管检测食醋中产气的兼氧或厌氧微生物，利用溴甲酚紫指示剂检测食醋中的好氧微生物，二者配合可在食醋产气菌检测过程中全面检测产气菌存在的风险，若只使用其中一种，比如只使用杜氏小管或者溴甲酚紫，不能全面检测食醋中的产气菌，可能导致结果不准确。

酸碱指示剂有很多种类，然而在食醋中产气菌检测时，目前仅发现溴甲酚紫在一定浓度下对食醋中产气菌具有很高的检测灵敏度，即便食醋中的产气菌很少也能够检测出来。

若检测样导管无气泡、浑浊产生，培养基的颜色为紫色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断无产气菌，本批次样品均为合格品；若检测样导管有气泡、浑浊或者培养基的颜色为黄色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断有产气菌，本批次样品存在引起浑浊、产气的微生物，该批次产品应禁止出厂，统计如表1所示。

表1结果统计表

异常管数	异常现象	报告结论
			0	无异常	-
1/3	导管有1/3出现产气、浑浊或培养基变为黄色	+
			2/3	导管有2/3出现产气、浑浊或培养基变为黄色	++
1	导管全部出现产气、浑浊或培养基变为黄色	+++

注：“-”为不存在产气菌；“+”为产气存在但轻微；“++”为产气存在且比较严重；“+++”为产气存在且十分严重。

报告中产气菌含量不同的醋液可采用不同的方法进一步处理，一是达到将醋液中产气菌含量降低到合格范围内的目的，二是尽可能针对产气菌含量选择高效节能的处理方法，因此准确定位醋液中产气菌含量也是很有必要的。尤其是当导管有至少2/3出现产气或者变为黄色或者浑浊时，必须灭菌处理后经过再次检测产气菌含量是否合格才能出厂。

与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：本发明采用了新的培养基是专为食醋中的产气微生物而配制的，它有利于这些微生物在较短的时间内繁殖和释放气体，能保证微生物不会死掉，又能在较快的时间内检出，本发明采用的检测方法，使食醋的检测时间由72h缩短至48h，并且由于检测方法能够检测出含量很低的产气菌，因此检测结果的准确性得到极大的提高，避免了不合格产品流入市场。

采用该检测方法获得的检测结果与产品涨瓶、涨袋、渗漏等有良好的相关性，本发明为检测食醋是否存在产气菌，成品是否涨瓶、涨袋、渗漏等提供了快速方便的检测方法，为生产上严格控制产品质量提供了依据。在生产中，对前期食醋在灌装入库时进行抽检，可以较好的预测食醋的货架期，减少经济损失，防止不合格产品流入市场。本方法检测时间短，操作步骤简单，成本低，原料及设备均易得，可以较好的应用于调味品企业。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

溴甲酚紫溶液的配制：称取溴甲酚紫0.1g，加入95％酒精定容至100mL，制成溴甲酚紫溶液，在各实施例中用作指示剂。本发明所指的95％酒精是指体积分数为95％的酒精溶液。

实施例1

一、培养基的原料及制备

称取牛肉膏2g、蛋白胨4g、硫酸镁0.58g、硫酸铵1.60g、磷酸氢二钾0.25g，将这些原料加入烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解后定容到1000mL，加入2mL溴甲酚紫指示剂，即得目的培养基。另称取13.5g的葡萄糖用蒸馏水定容至100mL，制成质量含量约为13.5％葡萄糖溶液并置于锥形瓶中，备用。

二、检测方法

将配制好的目的培养基分装到有杜氏小管的试管中，每管8mL，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。同时，将锥形瓶中的葡萄糖溶液也在相同条件下进行灭菌得到无菌葡萄糖溶液。葡萄糖与其他营养成分必须分开灭菌。

从装了目的培养基的试管中取4支试管，其中空白样一根试管，每个检测样3根试管，另取10ml醋液于烧杯中，用饱和碳酸钠溶液将其pH调至6.5-7.0得到待测原样，向检测样试管中加入1ml待测原样，再加入1ml无菌葡萄糖溶液，摇匀后于33℃恒温培养48h。空白样试管中加入1mL无菌葡萄糖溶液，在相同条件下培养。培养足够时间后，拿出培养基，仔细观察培养液，注意不要摇动试管。

若检测样导管无气泡、浑浊产生，培养基的颜色为紫色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断无产气菌，本批次样品均为合格品；若检测样导管气泡、浑浊出现或者培养基的颜色为黄色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断有产气菌，本批次样品存在引起浑浊、产气的微生物，该批次产品应禁止出厂。

表2结果统计表

如表2所示，空白对照没有出现任何气泡现象且颜色仍为紫色，而其它3支试管中的杜氏小管内全都颜色变黄且两支试管出现了气体，因此该批食醋产品中存在产气菌情况严重，在产品出厂后有可能引发涨袋、涨瓶现象发生，应当立即通知相应人员，禁止该批产品出厂，严格控制产品质量，并将不合格批次食醋再重新进行灭菌检测，直至合格为止。

实施例2

一、培养基的原料及制备

称取牛肉膏2g、蛋白胨4g、硫酸镁0.58g、硫酸铵1.60g、磷酸氢二钾0.25g，13.5g葡萄糖加入烧杯中，将这些原料用蒸馏水搅拌溶解后定容到1000mL，加入2mL溴甲酚紫指示剂，即得培养基。

二、检测方法

将配制好的培养基分装到有杜氏小管的试管中，每管8mL，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。葡萄糖和其他营养成分是混合在一起进行灭菌的。

从装了目的培养基的试管中取4支试管，其中空白样一根试管，每个检测样3根试管，向检测样的3根试管中各加入实施例1中所制备的1mL待测原样，空白样不加，摇匀后于33℃恒温培养48h。培养足够时间后，拿出培养基，仔细观察培养液，注意不要摇动试管。

若检测样导管无气泡、浑浊产生，培养基的颜色为紫色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断无产气菌，本批次样品均为合格品；若检测样导管有气泡、浑浊或培养基的颜色为黄色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断有产气菌，本批次样品存在引起浑浊、产气的微生物，该批次产品应禁止出厂。

表3结果统计表

如表3所示，空白对照没有出现任何气泡现象且颜色仍为紫色，而检测样只有2支试管中的杜氏小管内有气泡，且只有一支试管的颜色显示黄色，其他两支颜色仍为紫色，报告结论为该批食醋有产气菌。

采用实施例2和实施例1所述的培养基，对同一待测原样进行检测，实施例1的检测结果是“+++”，而实施例2的检测结果却是“++”，产生这种区别的原因是，实施例1和实施例2对于葡萄糖灭菌的方式不同，培养后，培养基的颜色显示不同。

重新采用实施例1所述的方式对该批待测原样进行再次检测，发现结果与实施例1相同。

上述对同一批食醋的三次检验显示，葡萄糖是否与培养基其他营养成分混合灭菌，对检测结果影响很大。第二次检验因预先将葡萄糖和指示剂混合在一起，在高温下葡萄糖颜色会变深，不利于培养基颜色的观察，影响结果的判断，特别是产气菌含量存在但不严重的情况下，易导致不合格产品可能因视觉的误判而使不合格产品出厂，出厂后由于产气菌的繁殖，将导致食醋产品出现质量事故。

实施例3

一、培养基的原料及制备

称取牛肉膏2g、蛋白胨4g、硫酸镁0.58g、硫酸铵1.60g、磷酸氢二钾0.25g和13.5g葡萄糖加入烧杯中，将这些原料用蒸馏水搅拌溶解后定容到1000mL，加入2mL溴甲酚紫指示剂，即得培养基。

二、检测方法

将配制好的培养基分装到有杜氏小管的试管中，每管8mL，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。葡萄糖和其他营养成分是混合在一起进行灭菌的。

取10ml醋液(与实施例1不同批次)于烧杯中，用饱和碳酸钠溶液将其pH调至6.5-7.0得到待测原样。

从装了目的培养基的试管中取4支试管，其中空白样一根试管，每个检测样3根试管，向检测样的3根试管中各加入1mL待测原样，空白样不加，摇匀后于33℃恒温培养48h。培养足够时间后，拿出培养基，仔细观察培养液，注意不要摇动试管。

若检测样导管无气泡、浑浊产生，且培养基的颜色为紫色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断无产气菌，本批次样品均为合格品；若检测样导管出现气泡、浑浊或者培养基的颜色为黄色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断有产气菌，本批次样品存在引起浑浊、产气的微生物，该批次产品应禁止出厂。

表4结果统计表

如表4所示，空白对照没有出现任何气泡现象且颜色仍为紫色，而检测样的3支试管中的杜氏小管也无气泡，并且培养基颜色都为紫色，报告结论为该批食醋无产气菌。但由于培养基中葡萄糖和其他营养成分是混合在一起进行灭菌的。采用实施例1的检验方法对本实施例的待测原样进行检测，测得结果见表5。

表5结果统计表

从表5可以看出，实际上该被测原样中是含有轻微产气菌的，并且这些产气菌是好氧菌，在培养过程中产酸导致培养基变色，但是由于第一次检测时将培养基中葡萄糖和其他营养成分是混合在一起进行灭菌，影响了对检验结果的判断，使结果不够准确。

实施例4

一、培养基的原料及制备

称取牛肉膏1g、蛋白胨2g、硫酸镁0.68g、硫酸铵1.50g、磷酸氢二钾0.35g，将这些原料加入蒸馏水中搅拌，加入2mL溴甲酚紫指示剂，溶解后在烧杯中定容到1000mL，即得目标培养基。另称取13.5g的葡萄糖用蒸馏水定容至100mL，制成溶质质量含量接近13.5％的葡萄糖溶液并置于锥形瓶中，备用。

二、检测方法

将配制好的培养基分装到有杜氏小管的试管中，每管8ml，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。同时，将锥形瓶中的葡萄糖溶液也在相同条件下进行灭菌得到无菌葡萄糖溶液。葡萄糖与其他营养成分必须分开灭菌。

取4支试管，其中空白样一根试管，每个检测样3根试管，向空白样试管中加入1mL无菌葡萄糖溶液，向3根检测样试管中各加入实施例1中所制备的1mL待测原样，再加入1mL无菌葡萄糖溶液，摇匀后于33℃培养48h。培养足够时间后，拿出培养基，仔细观察培养液，注意不要摇动试管。

若检测样导管无气泡、浑浊产生，培养基的颜色为紫色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断无产气菌，本批次样品均为合格品；若检测样导管有气泡、浑浊，或培养基的颜色为黄色，且空白对照试管无任何染菌现象，则该批样品判断有产气菌，本批次样品存在引起浑浊、产气的微生物，该批次产品应禁止出厂。

本实施例采用了不同于实施例1的培养基配方来检测实施例1所述的待测原样，结果如表6所示。

表6结果统计表

从表6可以看出，空白对照没有出现任何气泡现象且颜色仍为紫色，而其它3支试管中全都是无气泡，仅一支试管中培养基的颜色变为黄色，但实施例1检测出食醋中含有较多的产气菌，说明本次培养基的配料比不适合产气菌的生长，虽然检测出食醋中有微量产气菌，但是由于对产气菌含量定位不准确，选用了不适宜的后处理方法灭菌，处理后的食醋依然可能含有较多产气菌，导致问题产品有可能流入市场，产生食醋涨瓶、涨袋的风险，发生质量事故。

对比实施例1

检测对象：实施例3所检测的醋液

称取土豆200g、葡萄糖25g、酵母膏5g、牛肉膏7.5g、硫酸铵1.5g；将土豆去皮切块，加蒸馏水煮沸15min，纱布过滤，将葡萄糖、酵母膏、牛肉膏和硫酸铵加入滤液中，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，即得培养基。

取10支洁净试管，内置杜氏小管，分别装入上述培养基各18mL，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，于0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。

无菌操作下，取装有5颗玻璃珠的无菌三角瓶，加入适量与实施例3相同的醋液(不调节pH)，充分震荡摇匀，取1支试管无菌培养基作为空白对照，3支试管无菌培养基各接种2mL所述醋液作为检测样，震荡摇匀；空白对照和检测样在34℃恒温箱中培养72h。观察管中有无气泡、浑浊、菌膜或色彩变化，结果见表7。

表7结果统计表

从表5可以看出，实际上该被测原样中是含有轻微的产气菌的，但是表7却显示被测醋液中无产气菌，由于本对比实施例采用了现有技术的检测方法，检测限高，尤其是对好氧的产气菌的检测效果差，影响了对检验结果的判断，使结果不够准确。

对比实施例2

检测对象：实施例1所检测的醋液

称量蛋白胨15g、酪蛋白8g、酵母膏5g、葡萄糖26g、氯化钠6g，将这些原料加入蒸馏水中搅拌、溶解后定容到1000mL，调节pH值至5.0±0.2，即得培养基。

取3支内置杜氏小管的试管，各装入27mL培养基，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，于0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。

无菌操作下，取装有5颗玻璃珠的无菌三角瓶，加入待测醋液(不调节pH)，震荡摇匀，取4支试管，1支作为空白对照，3支作为检测样，检测样试管中各接种3mL醋液，震荡摇匀，4支试管在37℃恒温培养48h，观察试管中有无气泡，沿试管壁缓慢加入甲基红指示剂，禁止摇动试管，观察培养液上层颜色变化，结果见表8。

表8结果统计表

从表2可以看出，实际上该被测原样中产气菌的含量是相当严重的，但是表8却显示检测结果为该被测原样中只含有微量的产气菌，与实施例1检测结果差距非常明显。并且无论有无气泡，培养基的颜色都显示红色，无法从培养基的颜色变化来判断结果。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (3)

1.溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)配制培养基

称取溴甲酚紫0.1g，加入95％酒精定容至100mL，制成溴甲酚紫溶液；

称取牛肉膏2-3g、蛋白胨3-5g、硫酸镁0.55-0.60g、硫酸铵1.60-1.65g和磷酸氢二钾0.2-0.3g，用蒸馏水搅拌溶解并定容至1000mL，待液体均匀后加入2mL所述溴甲酚紫溶液，置于烧杯中，即成目的培养基；

另称取13.5g葡萄糖，用蒸馏水溶解后定容至100mL，制成质量含量接近13.5％的葡萄糖溶液并置于锥形瓶中；

(2)培养基分装与灭菌

将所述目的培养基分装到装有杜氏小管的试管中，每管8mL，排除杜氏小管中的气泡后擦拭管口边缘并包扎密封，另将装有所述质量含量接近13.5％的葡萄糖溶液的锥形瓶瓶口包扎密封，然后一同放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌时，葡萄糖溶液和目的培养基必须是分开的；

(3)接种与培养

取10mL醋液于烧杯中，将其pH调至6.5-7.0后作为待测原样备用；取步骤(2)中的3根培养基试管，各加入所述待测原样1mL及步骤(2)灭菌后的葡萄糖溶液1mL，作为检测样，同时取1根培养基试管仅加入步骤(2)灭菌后的葡萄糖溶液1mL，作为空白样；将检测样和空白样摇匀后于33±1℃培养48±2h；

(4)结果观察

培养完成后，取出各试管，注意不能摇动试管，仔细观察培养液：若培养液为黄色或者杜氏小管中有气泡或者培养液浑浊，则说明被测原样中有产气菌；若培养液为紫色且杜氏小管内无气泡，则说明被测原样中无产气菌。

2.根据权利要求1所述的溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法，其特征在于步骤(2)中灭菌的条件是：0.1MPa，121℃恒温灭菌25min。

3.根据权利要求1所述的溴甲酚紫与杜氏小管联合高效检测食醋中产气菌的方法，其特征在于步骤(3)调节醋液pH值采用的方法是：用饱和碳酸钠溶液调节。