CN102893809B - 一种蛹虫草液体菌种的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种蛹虫草液体菌种的制备方法，具体步骤为：将蛹虫草液体种培养基装入玻璃瓶中，每瓶装入的液量占瓶总容积30-50%，封口灭菌，冷却后在无菌条件下接入蛹虫草斜面菌种，21±2℃下先静置24-36小时再人工间歇摇瓶培养5-10天，待静置2小时以上观察絮状菌丝自然堆积体占整个液体体积一半以上时，经剔除检验不合格的样品即得到蛹虫草液体菌种可直接用于蛹虫草栽培。本发明提供的方法不需要传统方法中所用的摇床等设备，液体种配制成份不需添加消泡剂，液体种使用前菌丝无需打碎，无需稀释；并且提供了一种实用的液体菌种简易检测方法以及接种后有效降低污染率的暗光培养条件；本发明设施简易，操作方便易于普及推广。

Description

一种蛹虫草液体菌种的制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌液体制种领域，特别是一种有利于促进实现蛹虫草普及栽培的液体种最简易的制备方法。

背景技术

冬虫夏草是一种传统的名贵中药材，与天然人参、鹿茸并列为三大滋补品。它药性温和，一年四季均可食用，老弱病虚皆宜，比其它种类的滋补品有更为广泛的药用价值。

虫草具有极高的价值，虫其功能不断被开发利用，如制备虫草酒，提取虫草菌素、虫草多糖等。尽管虫草、虫草酒、虫草菌素和虫草多糖等产品的市场增长潜力巨大，但因受虫草野生资源限制，单纯利用极其有限的天然虫草资源来生产加工成大量的虫草酒、虫草菌素、虫草多糖等产品来满足人们日益增长的需要是不现实的。

蛹虫草又称北虫草，是虫草属的模式种，是与冬虫夏草同为虫草属的同属异种真菌，二者化学成分、营养成分和药用功能都非常相似，其主要药用成分虫草素等含量远高于野生冬虫夏草，又由于蛹虫草较之冬虫夏草更易于人工栽培，因此自然而然被作为冬虫夏草的最佳替代品而渐渐走入人们视野并受到极大关注，蛹虫草产业目前已进入工厂化大面积栽培的充分发展时期。

蛹虫草人工栽培起步相对较晚，栽培技术一般是借鉴或引用常规食用菌栽培技术而改进创新。采用液体种因为具有灭菌时间短、培养周期短、菌龄短且活力强等优点而倍受推崇，实践也证明蛹虫草栽培采用液体种方式更易获得成功和高产，明显优于固体种栽培的效果。公开报道的常规液体种制备需要投资摇床、搅拌器（如电磁搅拌、气动搅拌或者机械搅拌等）或发酵罐等设备，在摇床上培养的液体种菌丝体后期浓度高容易形成菌丝团或球不便于肉眼检查清亮度，为便于喷雾接种使用时还需要使用高速搅拌器等机械方式把菌丝球打散成菌丝小片段，再进行一定倍数的稀释，这样虽能一定程度上提高效率但势必增加设备投资、加大操作难度、增加污染几率同时会使菌丝体本身的生物活性受到一定伤害。使用摇床或电磁搅拌器等不间断振荡培养方式为避免液体溅到瓶口造成污染，液体盛装量不宜超过容器容积总量的35%，一般还要求加适量消泡剂来防止形成的泡沫溢到瓶口导致污染。

液体种制备是蛹虫草栽培步骤中最关键技术之一，由于受技术和设备条件限制使蛹虫草栽培发展还只是局限在小范围的少数人群中，这不利于蛹虫草产业的广泛全面推广普及。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种蛹虫草液体菌种的制备方法，该方法基于蛹虫草菌丝体易于形成分生孢子从而在液体中具有较好的自然分散性的生物特性来简化生产蛹虫草液体种的步骤和程序，制备方法极其简单、易于推广。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种蛹虫草液体菌种的制备方法，具体步骤为：

将蛹虫草液体种培养基装入玻璃瓶中，每瓶装液量占瓶总容积的30-50%，封口灭菌，冷却后在无菌条件下接入蛹虫草斜面菌种，21±2℃下先静置24-36小时再人工间歇摇瓶培养5-10天，待观察静置2小时以上的瓶中絮状菌丝自然堆积体占整个液体体积一半以上，剔除检验不合格的样品，即得到蛹虫草液体菌种，可直接用于蛹虫草栽培。

所述的蛹虫草液体种培养基由以重量份计的以下组分组成，硫酸镁3份、磷酸二氢钾6份、蛋白胨16份、葡萄糖32份、维生素B₁净含量0.02份，水2000份。

所述的玻璃瓶为广口瓶、三角瓶或菌种瓶，瓶体的容积≤1000毫升，要便于人工摇瓶和接种操作。

所述玻璃瓶要求透明度高，能耐高温蒸煮，具有便于固定封口薄膜或纸的突出边线，使用棉塞或硅氟透气塞时瓶口大小要配套适中。

所述封口步骤采用棉花塞、硅氟透气塞、耐高温无毒薄膜或无菌封口膜。

采用耐高温无毒薄膜或无菌封口膜封口时，还需用耐高温橡皮圈或者细绳扎口密封。

采用棉花塞或者硅氟透气塞进行封口时，用牛皮纸或多层报纸将塞齐瓶口一起包裹起来，然后用耐高温橡皮筋或棉线索扎紧。

所述人工间歇摇瓶方式为白天每2-3个小时摇瓶一次，晚上到第二天早上可间隔6-10小时再摇，摇瓶时用右手或左手持瓶身由慢到快旋转摇动，使瓶内液体随之旋转起来保持30秒以上即可，达到增氧和分散菌丝体的作用。摇瓶时注意不要用手直接抓拿瓶口封口处以免瓶口松动进入杂菌，而且不要使瓶内液体溅起到封口膜或塞上。

所述检验时，需待瓶静止2小时以上再通过光照肉眼检查，剔除雾状浑浊的样品，同时可辅以显微镜观察微观状况和鼻闻、口尝菌液味道判断其是否合格。

光照检验，即在每次摇瓶前先用手电筒等明亮集中光源对着瓶壁透过瓶身从对面用肉眼迎光观察液体是否清亮透明，如果出现雾状浑浊表明样品被细菌污染，则将该样品剔除；如果观察菌液表面出现绿色、黑色等真菌孢子时证明受到真菌感染也应该剔除；光照检验合格时，有条件的还可进行镜检，即通过无菌制片显微镜下观察是否有少量非培养蛹虫草菌株外的其它真菌孢子或细菌存在，如发现异常该样品也需剔除；另外还可通过嗅觉和味觉判断其气和味是否正常，遇不正常的样品，亦剔除。

当瓶体静止2小时以上观察瓶中菌液自然悬浮堆积的絮状菌丝量达到液体体积一半以上时，培养即完成，此时菌丝量合适无需稀释和机械打碎，菌丝生理活性也是最高，萌发最快。

所述蛹虫草栽培时接种后5-10天的暗光培养期温度需控制在18±1℃。

蛹虫草液体菌种进行栽培接种时，先用来苏尔等消毒液对玻璃瓶外表及封口物作表面喷雾消毒，然后摇匀种液稍静置在无菌条件开启封口物，用75%的酒精棉球对瓶口作擦拭消毒，再在酒精灯火焰上过火烧烫杀菌，待瓶口冷却后直接将液体种倒入事先消毒或灭菌好的液体喷雾器中，注意缓慢倾倒，防止老接种块和表面菌皮进入喷雾器中堵塞喷雾头；以重量份计，取蚕蛹粉1份、大米35份和营养液50份置于培养瓶或盆中，混和封口后灭菌，冷却至18±1℃，在无菌条件下喷雾接入蛹虫草液体菌种；接种后的培养瓶或盆在18±1℃避光培养10天左右，待蛹虫草菌丝完全封面吃料后再进行光照刺激培养出草，待蛹虫草子座生长成熟后采收，在残余培养基表面补喷清水或营养液盖好薄膜重复前述管理可以收获第二或三批蛹虫草子实体。

常用方法制备蛹虫草液体菌种时，需要添置摇床、搅拌机、甚至空气过滤系统及发酵等设备设施，培养基需要添加消泡剂，所培养的液体种后期还需要打碎菌丝团或球并稀释，这都势必增加投资成本、感染机率和操作难度。

本发明的有益效果为：

1）根据蛹虫草菌丝体易于形成分生孢子在液体中具有较好自然分散性的生物学特点，从而把蛹虫草液体菌种的制作方法简化。

2）通过本发明提供的方法制备的蛹虫草液体菌种，及时使用能保证菌丝的良好分散性及活性，生产过程中不需要摇床及其它机械搅拌设备，并且人工摇瓶频率低盛装液体量可从占瓶总容积30%增大到50%左右，无需使用消泡剂，样品中菌丝浓度适中便于肉眼迎光检查清亮度，亦无需搅拌打碎、稀释等繁琐操作，大大简化操作步骤。

3）本方法直接使用一级种转扩培养栽培用液体种，相比常规的方法减少了传代次数，大大缩短菌种培养时间同时有利于减少菌株变异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明不受其限制。

取硫酸镁3份、磷酸二氢钾6份、蛋白胨16份、葡萄糖32份、维生素B₁ 0.02份，水2000份，混合均匀，得蛹虫草液体菌种培养基。

实施例1：蛹虫草液体菌种的制备方法：

将保存在冰箱的引进斜面母种用PDA加富培养基24±2℃活化培养后挑选8支备用。

量取250ml蛹虫草液体种培养基注入750ml广口瓶中，共计分装60瓶，用耐高温无菌封口膜箍耐高温橡皮圈封口，通过高压锅按常规程序灭菌，冷却至21±2℃，在无菌条件下采用无菌操作接入蛹虫草斜面菌种，每支斜面菌种接液体种7-8瓶，21±2℃先静置24小时，然后每天白天间隔2-3小时将广口瓶旋摇30秒，晚上可隔6-10小时旋摇一次，剔除检验不合格的样品，随着时间推移液体中菌丝不断增加，5-10天后絮状菌丝占整个液体量一半以上时得蛹虫草液体菌种，可直接用于蛹虫草栽培，本批培养的液体种可以用于接种3000瓶（500毫升罐头瓶）以上蛹虫草，接种后于温度18±1℃的暗室培养，可有效降低污染率。

实施例2

将组织分离的蛹虫草菌株在PDA加富培养基上24±2℃左右活化培养后挑选8支合格斜面菌株备用。

量取300ml蛹虫草液体种培养基装到750ml三角瓶中，共计分装50瓶，用耐高温无菌封口膜箍耐高温橡皮圈封口通过高压锅按常规程序灭菌，冷却至21±2℃，在无菌条件下采用无菌操作接入蛹虫草斜面菌种，每支接液体种6-7瓶，21±2℃先静置30小时，然后每天白天隔2-3小时将广口瓶旋摇30秒，晚上可间隔6-10小时摇一次，及时剔除检验不合格的样品，随着时间推移液体中菌丝不断增加，5-10天后絮状菌丝占整个液体量一半或以上时得蛹虫草液体菌种，可直接用于蛹虫草栽培，本批培养的液体种可以用于接种500毫升罐头瓶3000瓶左右蛹虫草，接种后至于温度18±1℃的暗室培养，可有效减少污染率。

实施例3

将孢子分离纯化菌株在PDA加富培养基上24±2℃左右活化后挑选8支优质合格斜面备用。

量取300ml蛹虫草液体菌种培养基装到750ml菌种瓶（或广口瓶）中，共计分装50瓶，用裁切好的聚丙烯膜盖口箍上橡皮圈扎紧，通过高压锅按程序灭菌，冷却至21±2℃，在无菌条件下采用无菌操作接入蛹虫草斜面菌种，每支接液体种6-7瓶21±2℃温度条件下先静置24小时，然后每天白天隔2-3小时将广口瓶旋摇30秒，晚上可隔6-10小时摇一次，剔除检验不合格的样品，随着时间推移液体中菌丝不断增加，5-10天后絮状菌丝占整个液体量一半或以上时得蛹虫草液体菌种，可直接用于蛹虫草栽培，本批培养的液体种可以用于接种500ml罐头瓶3000瓶左右的蛹虫草，接种后至于温度18±1℃的暗室培养，大大降低污染率。

实施例4

将组织分离的蛹虫草菌株在PDA加富培养基上24±2℃左右活化培养好后挑选8支优质合格试管斜面备用。

量取300ml蛹虫草液体种培养基装到1000毫升三角瓶中，共计分装50瓶，用耐高温硅氟透气塞塞口后盖4层报纸包住瓶口和瓶塞，橡皮圈扎紧后通过高压锅按程序灭菌，冷却至21±2℃在无菌条件下采用无菌操作接入蛹虫草斜面菌种，每支接液体种6-7瓶，21±2℃静止36小时，然后每天白天隔2-3小时将三角瓶旋摇30秒，晚上可隔6-10小时摇一次，剔除检验不合格的样品，随着时间推移液体中菌丝不断增加，5-10天后絮状菌丝占整个液体量一半或以上时得蛹虫草液体菌种，可直接用于蛹虫草栽培，本批培养的液体种可以用于接种蛹虫草500ml罐头瓶3000瓶左右，接种后至于温度18±1℃的暗室培养，可有效降低污染率。

蛹虫草栽培的具体步骤为：

1）以重量份计，将蚕蛹粉1份、大米35份和蛹虫草营养液50份置于培养瓶或盆中，混和后封口，常规程序灭菌并冷却至18±1℃备用；

2）事先将手持喷雾器进行消毒液浸泡消毒或整体密封后用高压锅灭菌备用，在无菌条件下将蛹虫草液体菌种旋摇后稍静置，缓慢将液体菌丝片段倒入喷雾器储液瓶中，注意将老接种块和表面菌膜剔除，必要时还需将菌液用15目塑料网无菌过滤以免大菌丝团阻塞喷雾头，将种瓶中残留少量液体种迅速进行无菌取样镜检若无可疑杂菌并且鼻闻口尝菌丝气味正常进一步印证菌种合格可用，舍弃不合格的菌种，然后将菌液振摇均匀后喷雾接入步骤1）中的栽培瓶或盆中；

3）接种后的培养瓶或盆在18±1℃左右避光培养10天左右，再进行增氧和光照刺激培养出草，待蛹虫草生长成熟第一批采收完毕后可补水或营养液再出第二批甚至第三批。

本发明对普及蛹虫草大面积栽培具有极大的意义，对蛹虫草栽培过程中的液体种关键制作技术极大简化，一方面减少生产设施投入降低能耗和起步点，一方面简化操作步骤提高实用性并有效降低污染率，使蛹虫草大面积栽培技术广泛推广更加容易。

Claims (2)

1.一种蛹虫草液体菌种的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

1）取硫酸镁3份、磷酸二氢钾6份、蛋白胨16份、葡萄糖32份、维生素B₁ 0.02份，水2000份，混合均匀，得蛹虫草液体菌种培养基；

2）将孢子分离纯化菌株在PDA加富培养基上24±2℃活化后挑选8支优质合格斜面备用，量取250ml蛹虫草液体种培养基注入750ml广口瓶中，用耐高温硅氟透气塞塞口后盖4层报纸包住瓶口和瓶塞，橡皮圈扎紧后进行封口通过高压锅按程序灭菌，冷却至21±2℃在无菌条件下采用无菌操作接入蛹虫草斜面菌种，21±2℃静置36小时，然后每天白天隔2-3小时将瓶体旋摇30秒，晚上隔6-10小时摇一次，剔除检验不合格的样品，随着时间推移液体中菌丝不断增加，5-10天后絮状菌丝占整个液体量一半或以上时得蛹虫草液体菌种，可直接用于蛹虫草栽培；

摇瓶时用右手或左手持瓶身由慢到快旋转摇动，使瓶内液体随之旋转起来保持30秒以上即可；

所述检验时，通过迎光肉眼观测静止2小时以上的菌瓶内菌液柱的上层液清亮度及菌液表面状况，菌柱雾状浑浊或表面有杂菌孢子的的样品为不合格需剔除，同时可辅以显微镜观察菌液微观状况和鼻闻、口尝菌液的气味来判断其是否合格。

2.根据权利要求1所述的蛹虫草液体菌种的制备方法，其特征在于：所述蛹虫草栽培时接种后5-10天的暗光培养期温度需控制在18±1℃。