CN101633948B

CN101633948B - 牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法

Info

Publication number: CN101633948B
Application number: CN2009100419851A
Authority: CN
Inventors: 刘冬梅; 余以刚; 梁洁英; 吴晖; 吴祖星; 陈子剑; 李晓凤; 唐语谦
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong Yantang Dairy Co ltd
Priority date: 2009-08-20
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2029-08-20
Also published as: CN101633948A

Abstract

本发明公开了牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法。该方法将嗜热脂肪芽孢杆菌经过一次活化后在生产培养基中，于50～65℃和搅拌转速为100～150rpm的条件下培养24～36h，离心后收集菌泥，加入琼脂溴甲酚紫溶液，混合均匀，使每个试剂盒的芽孢达到1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu，于60～70℃分装入多孔反应容器，盖上铝塑膜，倒置、封口，并装入铝塑袋，防止吸潮和避光保存。该试剂盒简单易用，灵敏度高、重复性、低成本和高通量，在4～8℃条件下保存12～18个月，能检测牛奶中β-内酰胺类抗生素残留。

Description

牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法

技术领域

本发明涉及抗生素残留检测，具体是指牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法。

背景技术

在奶牛养殖业中β-内酰胺环类的抗生素常用于医治奶牛的乳腺炎，尤其是青霉素G由于其广谱并廉价因此被大量地使用，因此导致了牛奶中含有高浓度的残留。且青霉素类还会使一些个体产生十分剧烈的过敏反应。如果长期摄入含有该类抗生素的牛奶会使人体肠道内正常菌群受到抑制并使人产生抗药性。许多国家对牛奶中的β-内酰胺类药物尤其是青霉素G残留的管理十分严格，世界卫生组织推荐的青霉素G在牛奶中的限量由1976年的0.05μg/ml(50ppb)提高到目前的0.004μg/ml(4ppb)，美国为0.005μg/ml(5ppb)。目前按国家标准GB4789.27-2003鲜乳中抗生素残留量检测方法进行检测，检测限仅为0.04μg/ml(40ppb)，该法灵敏度低，与欧美国家检测方法差一个数量级，已不适应国际需要。

中国发明专利200410019478.5(CN 1584046A)公开“检测牛乳中抗生素残留量的微生物制剂制备方法及其应用”，该方法的检验时间长约需要5小时左右，用的菌株是嗜热乳酸链球菌，发酵温度为40～45℃。王志强等人“微生物抑制法快速检测鲜奶中多种抗生素残留”(中国食品卫生杂志，2008，20(2)：139-141)没有制成试剂盒，检测时间长达24h以上，操作步骤复杂。

上述的检测方法都是采用微生物检测法，普遍存在由于检测活菌量低(10⁵～10⁶cfu/ml)且热稳定性差，灵敏度低，检测时间长，没有制成试剂盒，使得检测操作繁琐，无法进行标准化检测。而酶联免疫检测法和放射免疫分析法(也叫Charm II)需要昂贵的检测仪器，费用高，每个样品的检测成本为100～300元，不适合乳品企业的低成本的检测需要。牛奶中抗生素残留的检测不仅仅涉及到乳品企业的经济效益，更大地涉及到人类健康的公共卫生问题，因此，为了提高牛奶的安全性，开发低成本、高通量、快速检测和灵敏度高的检测试剂盒势在必行。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种低成本、高通量、检测速度快和灵敏度高的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法。

本发明利用嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearothermophilus)对β-内酰胺类抗生素敏感的特点，检测β-内酰胺类抗生素的残留。首先将嗜热脂肪芽孢杆菌进行高密度培养，然后浓缩菌体，与培养基、指示剂和反应助剂在高温条件下灌注，制成凝固的试剂盒。被检奶样中可能存在的抗生素小分子向培养基内扩散，而样品中干扰芽孢繁殖的其它大分子被隔离在琼脂培养基的表层。当含有检出限以上浓度的β-内酰胺类抗生素时，嗜热脂肪芽孢杆菌的生长被抑制，培养基保持原有色泽(蓝色)，为阳性；当无抗生素或抗生素含量很低时，嗜热脂肪芽孢杆菌就会生长繁殖利用培养基里的营养物质产酸，使指示剂变色(黄色)，为阴性。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，包括如下步骤和工艺条件：

第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌冻干粉置于肉汤液体培养基，于45～55℃，100～150rpm下培养24～36h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基原料配方为：蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水94.4～96.1份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至45～55℃备用；

第二步以体积比为2～5∶100的比例，将母发酵剂接入生产培养基中，于50～65℃的发酵罐中进行培养，在培养过程用NaOH溶液调整pH为7.0～8.0，搅拌转速为100～150rpm，培养24h～36h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基原料配方组成为：蛋白胨1.5～3.0份，牛肉膏为2.5～3.5份，葡萄糖为1.0～2.0份，磷酸氢二钾0.010～0.030份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水91.37～93.59份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至50～65℃备用；

第三步将所述发酵菌悬液于5000～8000rpm条件下，离心20～25min，舍弃上清液，收集菌泥A；

第四步在菌泥A中，按生理盐水与菌泥的体积比为1～5∶1加入生理盐水，混合均匀后于5000～8000rpm条件下，离心20～25min，舍弃上清液，收集菌泥；清洗2～3次，于5000～8000rpm条件下，离心20～25min，舍弃上清液，收集菌泥，放置4～10℃条件下48～120h，得菌泥B；

第五步按琼脂指示剂溶液与所述菌泥B的体积比为1～5∶1加入琼脂指示剂溶液，于60～70℃下混合均匀，得反应液，将所述反应液0.1～0.3mL分别装入孔板的每一孔或微量反应器中，每孔或微量反应器中的芽孢菌达到1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu(1.00×10⁸～5.00×10⁸cfu/ml)，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60～70℃倒置0.5h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒；以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液原料配方组成为：琼脂1.5～3.0份，溴甲酚紫0.0008～0.0015份，NaOH 0.015～0.020份，蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水91.38～94.58份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至60～70℃备用；所述每孔或微量反应器中的配方组成为：琼脂1.5～15.0mg，溴甲酚紫0.8～7.5μg，NaOH 15～100μg，蛋白胨1.0～7.5mg，牛肉膏粉2.5～17.5mg，氯化钠0.4～3.0mg，蒸馏水94.38～472.90mg，芽孢菌数为1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu；

第六步在所述第五步的试剂盒每孔或微量反应器中加入牛奶样品0.05～0.25mL，用铝塑膜仔细密封，于60～65℃的水浴或恒温箱中恒温反应2小时15分～2小时45分，阴性样品的试剂盒每孔或微量反应器中溶液由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2(黄色)～6.8(蓝色)，表示抗生素残留呈阴性；阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。

所述第二步母发酵剂与生产培养基的体积比优选为3～4∶100。

所述第二步中NaOH溶液的浓度优选为1～2mol/L。

所述第一步的培养温度优选为50℃，优选培养24h。

所述第二步的培养温度优选为55℃，优选培养24h。

所述第五步琼脂指示剂溶液与菌泥B的体积比优选为4-5∶1。

所述第五步琼脂指示剂溶液原料配方组成优选为：琼脂1.5份、溴甲酚紫0.001份、NaOH 0.015份、蛋白胨1.0份、牛肉膏粉2.5份、氯化钠0.5份和蒸馏水94.50份。

所述第六步60～65℃的水浴或恒温箱中恒温反应时间优选为2小时15分～2小时30分。

所述第五步孔板的每一孔体积优选为0.3～1.5ml。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)成本低至1～2元，快速检测，高通量检测，不需要昂贵的检测设备。

(2)试剂盒菌中90％为芽孢，能耐受加工过程中的热，在粗放的保存条件下也不易失活。

(3)灵敏度高，检测限低，对牛奶中β-内酰胺类抗生素残留检测限分别为：青霉素G(检测限2～4ppb)、氨比西林(检测限3～5ppb)、阿莫西林(检测限3～5ppb)、苯甲异噁唑青霉素(检测限≤5～25ppb)、氯唑西林(检测限25～40ppb)、头孢氨苄(25～75ppb)和头孢匹林(检测限5～8ppb)。

附图说明

图1为实施例1中培养温度对BS 10208细菌总数的影响曲线；

图2为实施例1中接种量对BS 10208细菌总数的影响曲线；

图3为实施例1中初始pH对BS 10208细菌总数的影响曲线。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10208(Bacillus Stearothermophilus 10208，简称BS10208，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区霄云路32号，邮编：100027)(也可以为嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10143)置于肉汤液体培养基，于50℃，150rpm下培养30h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏粉25g，氯化钠5.0g，蒸馏水960g，搅拌溶解均匀后用0.08MPa灭菌20min，冷却至50℃备用；

第二步以体积比为3∶100的比例，将母发酵剂接入生产培养基中，于55℃的发酵罐中进行培养，在培养过程用1.0mol/L的NaOH溶液调整pH为7.5，搅拌转速为120rpm，培养30h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基配方组成为：蛋白胨20g，，牛肉膏为30g，葡萄糖为15g，磷酸氢二钾0.20g，氯化钠5.0g，蒸馏水929.8g；搅拌溶解均匀后用0.08MPa灭菌20min，冷却至55℃备用；

第三步将发酵菌悬液于8000rpm，离心20min，舍弃上清液，收集菌泥，为菌泥A。

第四步在菌泥A中，按生理盐水与菌泥的体积比为3∶1加入生理盐水，混合均匀后于8000rpm，离心20min，舍弃上清液，收集菌泥；清洗的操作重复3次，于5000rpm，离心25min，舍弃上清液，收集菌泥，4℃条件下放置120h，得菌泥B。

第五步按琼脂指示剂溶液与菌泥B的体积比为3∶1加入琼脂指示剂溶液，于60℃下混合均匀为反应液，将反应液分装入0.3ml的8×12的96孔板，每个孔中装反应液为0.1ml，每个孔中的芽孢菌达到2.50×10⁷cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60℃倒置0.5h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒。以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液配方组成为：琼脂15g，溴甲酚紫0.010g，NaOH 0.16g，蛋白胨10g，牛肉膏粉25g，氯化钠5.0g，蒸馏水945.0g，搅拌溶解均匀后用0.08MPa灭菌20min，冷却至60℃备用。所述每个孔中的配方组成为：琼脂1.5mg，溴甲酚紫1.0μg，NaOH 16μg，蛋白胨1.0mg，牛肉膏粉2.5mg，氯化钠0.5mg，蒸馏水94.5mg，芽孢菌数为2.50×10⁷cfu。

第六步按照第一至第五的生产工艺，制备得到0.3ml的96孔的试剂盒，在试剂盒中的一个孔中加入牛奶样品0.05mL(阳性样品中含有2ppb的青霉素钠，阴性样品中不含青霉素钠)，用铝塑膜仔细密封检测试剂盒的孔，于60℃的水浴或恒温箱中恒温2小时45分，操作过程中必须确保不能让任何异物滴落到孔中，以免产生假阳性结果，阴性样品的检测试剂盒的孔内溶液由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2(黄色)～6.8(蓝色)，表示抗生素残留呈阴性；而阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。与国家标准GB4789.27-2003及现有方法相比，有快速、方便、灵敏、检测限低和高通量检测的优点。

根据嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10208的特性，通过严格控制发酵剂的发酵培养温度、接种量和初始pH，选择一次扩大发酵培养，尽量使所有的细胞处于同步生长时期，再在生产培养基中进行扩大培养，在线控制发酵pH和严格控制收获时间，高密度培养后活菌数达到4×10⁷cfu/mL。图1为不同培养温度对细菌总数的影响，用平板计数法测得细菌总数，从图1中可以看出，温度是影响嗜热脂肪芽孢杆菌生长是一个重要的因素，虽然嗜热芽孢杆菌在28℃都可以生长，但在温度高的环境生长能力更强，基于扩大培养的需要，选择55℃左右的温度为培养温度。图2为不同接种对细菌总数的影响，测定细菌总数的方法同图1，从图2中可以看出，接种量为5％左右较佳，过少的接种量在培养基中都不能充分生长，但7％接种量会抑制细菌的生长，可能是各种营养素不足以供给细菌的扩大生长的需要。图3为不同初始pH对细菌总数的影响，测定细菌总数的方法同图1，嗜热脂肪芽孢杆菌属于中性偏碱环境中生长，由图3可以看出，初始pH越高，生长菌量越多，从实验的数据看初始pH越高对细菌培养更有利，但是参考相关文献，在pH超过8.0以后，就呈现下降的趋势。表1为该菌接种量对培养后pH的影响，从中可以看出，培养后pH都有不同程度的下降，在6.00～6.27之间，处于指示剂溴甲酚紫的变色范围中。

表1

实施例2

第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10208(Bacillus Stearothermophilus 10208，简称BS10208，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区霄云路32号，邮编：100027)置于肉汤液体培养基，于45℃，100rpm下培养24h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基配方为：蛋白胨13g，牛肉膏粉25g，氯化钠4.0g，蒸馏水958g；搅拌溶解均匀后用0.10MPa灭菌15min，冷却至45℃备用；

第二步以体积比为1∶100的比例，将母发酵剂接入生产培养基中，于50℃的发酵罐中进行培养，在培养过程用1.5mol/L的NaOH溶液调整pH为8.0，搅拌转速为100rpm，培养24h h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基配方组成为：蛋白胨15g，牛肉膏为25g，葡萄糖为10g，磷酸氢二钾0.10g，氯化钠4.0g，蒸馏水945.9g；搅拌溶解均匀后用0.10MPa灭菌15min，冷却至50℃备用；

第三步将发酵菌悬液于5000rpm，离心25min，舍弃上清液，收集菌泥，为菌泥A。

第四步在菌泥A中，按生理盐水与菌泥的体积比为3∶1加入生理盐水，混合均匀后于5000rpm，离心25min，舍弃上清液，收集菌泥；清洗2次，于8000rpm，离心20min，舍弃上清液，收集菌泥，放置10℃条件下48h，为菌泥B。

第五步按琼脂指示剂溶液与菌泥B的体积比为1∶1加入琼脂指示剂溶液，于70℃下混合均匀为反应液，将反应液分装入0.6ml的8×12的96孔板，每个反应器中装反应液为0.2ml，每个反应器中的芽孢数达到1.00×10⁹cfu/ml，盖上铝塑膜并进行热合封口，于70℃倒置0.5h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，成检测试剂盒。以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液配方组成为：琼脂20g，溴甲酚紫0.008g，NaOH 0.15g，蛋白胨13g，牛肉膏粉25g，氯化钠4.0g，蒸馏水938.0g，搅拌溶解均匀后用0.10MPa灭菌15min，冷却至70℃备用。所述每个反应器中的配方组成为：琼脂4.0mg，溴甲酚紫1.6μg，NaOH 30μg，蛋白胨2.6mg，牛肉膏粉5.0mg，氯化钠0.8mg，蒸馏水187.6mg，芽孢菌数为2.00×10⁸cfu。

第六步按照第一至第五的生产工艺，制备得到0.6ml的96孔的试剂盒，在试剂盒中的一个反应器)中加入牛奶样品0.1mL(阳性样品中含有4ppb的青霉素钠，阴性样品中不含青霉素钠)，用铝塑膜仔细密封反应器(孔)，于65℃的水浴或恒温箱中恒温2小时15分，操作过程中必须确保不能让任何异物滴落到孔中，以免产生假阳性结果，阴性样品的反应器中溶液由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2(黄色)～6.8(蓝色)，表示抗生素残留呈阴性；而阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。与国家标准GB4789.27-2003及现有方法相比，有快速、方便、灵敏、检测限低和高通量检测的优点。

实施例3

第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10208(Bacillus Stearothermophilus 10208，简称BS10208，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区霄云路32号，邮编：100027)置于肉汤液体培养基，于55℃，125rpm下培养36h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基配方为：蛋白胨15g，牛肉膏粉35g，氯化钠6.0g，蒸馏水944g；搅拌溶解均匀后用0.09MPa灭菌18min，冷却至55℃备用；

第二步以体积比为5∶100的比例，将母发酵剂接入生产培养基中，于65℃的发酵罐中进行培养，在培养过程用2.0mol/L的NaOH溶液调整pH为7.0，搅拌转速为150rpm，培养36h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基配方组成为：蛋白胨30g，牛肉膏为35g，葡萄糖为20g，磷酸氢二钾0.30g，氯化钠6.0g，蒸馏水908.7g；搅拌溶解均匀后用0.09MPa灭菌18min，冷却至65℃备用；

第三步将发酵菌悬液于7000rpm，离心23min，舍弃上清液，收集菌泥，为菌泥A。

第四步在菌泥A中，按生理盐水与菌泥的体积比为5∶1加入生理盐水，混合均匀后于7000rpm，离心23min，舍弃上清液，收集菌泥；这样清洗残留的酸性代谢物重复3次，于7000rpm，离心23min，舍弃上清液，收集菌泥，放置7℃条件下84h，为菌泥B。

第五步按琼脂指示剂溶液与菌泥B的体积比为5∶1加入琼脂指示剂溶液，于65℃下混合均匀为反应液，将反应液分装入1.0ml的8×12的96孔板，每个反应器中装反应液为0.3ml，每个反应器中的芽孢菌达到1.50×10⁷cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于65℃倒置0.5h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒。以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液配方组成为：琼脂30g，溴甲酚紫0.015g，NaOH 0.20g，蛋白胨15g，牛肉膏粉35g，氯化钠6.0g，蒸馏水914.0g，搅拌溶解均匀后用0.09MPa灭菌17.5min，冷却至65℃备用。所述每个反应器中的配方组成为：琼脂9.0mg，溴甲酚紫4.5μg，NaOH 60μg，蛋白胨4.5mg，牛肉膏粉10.5mg，氯化钠1.8mg，蒸馏水274.2mg，芽孢菌数为1.50×10⁷cfu。

第六步按照第一至第五的生产工艺，制备得到1.0ml的96孔的试剂盒，在试剂盒中的一个反应器中加入牛奶样品0.15mL(阳性样品中含有8ppb的青霉素钠，阴性样品中不含青霉素钠)，用铝塑膜仔细密封反应器，于62℃的水浴或恒温箱中恒温2小时30分，操作过程中必须确保不能让任何异物滴落到孔中，以免产生假阳性结果，阴性样品的反应器中溶液由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2(黄色)～6.8(蓝色)，表示抗生素残留呈阴性；而阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。与国家标准GB4789.27-2003及现有方法相比，有快速、方便、灵敏、检测限低和高通量检测的优点。

实施例4

第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 10143(Bacillus Stearothermophilus 10208，简称BS10208，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区霄云路32号，邮编：100027)置于肉汤液体培养基，于50℃，150rpm下培养30h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏粉25g，氯化钠5.0g，蒸馏水960.0g，搅拌溶解均匀后用0.08MPa灭菌20min，冷却至50℃备用；

第四步在菌泥A中，按生理盐水与菌泥的体积比为3∶1加入生理盐水，混合均匀后于8000rpm，离心20min，舍弃上清液，收集菌泥；清洗的操作重复3次，于5000rpm，离心25min，舍弃上清液，收集菌泥，放置4℃条件下120h，为菌泥B。

第五步按琼脂指示剂溶液与菌泥B的体积比为3∶1加入琼脂指示剂溶液，于62.5℃下混合均匀为反应液，将反应液分装入1.5ml的8×12的96孔板，每个孔中装反应液为0.5ml，使每个孔中的芽孢菌达到2.5×10⁸cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60℃倒置0.5h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，成检测试剂盒。以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液配方组成为：琼脂15g，溴甲酚紫0.010g，NaOH 0.16g，蛋白胨10g，牛肉膏粉25g，氯化钠5.0g，蒸馏水945.0g，搅拌溶解均匀后用0.08MPa灭菌20min，冷却至60℃备用。所述每个孔中的原料配方组成为：琼脂7.5mg，溴甲酚紫5.0μg，NaOH80μg，蛋白胨5.0mg，牛肉膏粉12.5mg，氯化钠2.5mg，蒸馏水472.5mg，芽孢菌数为2.50×10⁸cfu。

第六步按照第一至第五的生产工艺，制备得到1.5ml的96孔的试剂盒，在试剂盒中的一个孔中加入牛奶样品0.25mL(阳性样品中含有8ppb的青霉素钠，阴性样品中不含青霉素钠)，用铝塑膜仔细密封检测试剂盒的孔，于64℃的水浴或恒温箱中恒温2小时30分，操作过程中必须确保不能让任何异物滴落到孔中，以免产生假阳性结果，阴性样品的孔中溶液由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2(黄色)～6.8(蓝色)，表示抗生素残留呈阴性；而阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。与国家标准GB4789.27-2003及现有方法相比，有快速、方便、灵敏、检测限低和高通量检测的优点。

Claims

1.一种牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件：

第五步按琼脂指示剂溶液与所述菌泥B的体积比为1～5∶1加入琼脂指示剂溶液，于60～70℃下混合均匀，得反应液，将所述反应液0.1～0.3mL分别装入孔板的每一孔或微量反应器中，每孔或微量反应器中的芽孢菌达到1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60～70℃倒置0.5h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒；以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液原料配方组成为：琼脂1.5～3.0份，溴甲酚紫0.0008～0.0015份，NaOH 0.015～0.020份，蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水91.38～94.58份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至60～70℃备用；所述每孔或微量反应器中的反应液配方组成为：琼脂1.5～15.0mg，溴甲酚紫0.8～7.5μg，NaOH 15～100μg，蛋白胨1.0～7.5mg，牛肉膏粉2.5～17.5mg，氯化钠0.4～3.0mg，蒸馏水94.38～472.90mg，芽孢菌数为1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu；

第六步在所述第五步的试剂盒每孔或微量反应器中加入牛奶样品0.05～0.25mL，用铝塑膜仔细密封，于60～65℃的水浴或恒温箱中恒温反应2小时15分～2小时45分，阴性样品的试剂盒每孔或微量反应器中由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2～6.8，表示抗生素残留呈阴性；阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。

2.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：第二步母发酵剂与生产培养基的体积比为3～4∶100。

3.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：所述第二步中NaOH溶液的浓度为1～2mol/L。

4.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：所述第一步的培养温度为50℃，培养24h。

5.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：所述第二步的培养温度为55℃，培养24h。

6.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：所述第五步琼脂指示剂溶液与菌泥B的体积比为4-5∶1。

7.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：所述第五步琼脂指示剂溶液原料配方组成为：琼脂1.5份、溴甲酚紫0.001份、NaOH0.015份、蛋白胨1.0份、牛肉膏粉2.5份、氯化钠0.5份和蒸馏水94.50份。

8.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于：所述第六步60～65℃的水浴或恒温箱中恒温反应时间为2小时15分～2小时30分。

9.根据权利要求1所述的牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于第五步孔板的每一孔体积为0.3～1.5ml。