CN100532533C - 微生物快速检测显色碟片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物快速检测显色碟片及其制备方法，与传统的琼脂培养基相比，其以快速酶触反应显色培养基作为基础，用无纺布和瓜尔胶体系代替了传统培养基中的琼脂作为载体。其使用方便快捷，且其保质期长(至少为1年)。
Description
发明领域
本发明涉及微生物的检测，更特别的涉及一种用于检测微生物的碟片及其制备方法。
技术背景
“食品安全”是12个“十五”国家重大科技专项之一，它关系到国计民生和人民生命安全与健康，是当前国民经济和社会发展急需解决的问题。而食品中病源微生物引起的危害一直是食品安全中最大的威胁之一。近几年，全球不断爆发食源性疾病事件如：欧洲的“口蹄疫事件”、“疯牛病事件”，美国李斯特氏菌食物中毒事件，日本大肠杆菌O157:H7事件，美国奶粉的坂崎肠杆菌事件等，“食品安全”问题已成为全球关注的焦点。
目前，我国进出口食品微生物检测均采用传统方法，其通常使用琼脂糖培养基，虽然准确性强，但存在检测时间长、检测步骤烦琐、对检测人员技术水平要求高等缺点。随着经济全球化进程的加快，国际食品贸易的迅速增加，传统微生物检测方法费时费力的缺点越来越突出，检测速度是除贸易壁垒以外影响出口的主要因素，因此，快速检测方法越来越受到重视，快速检测产品应用也越来越广泛。
目前国内外已有多种基于快速酶触反应方法的产品，其中大部分是显色(或荧光)培养基，目标微生物在其上生长后具有特异的颜色，易于判别，但是由于其通常仍使用琼脂，因此干粉显色培养基仍需要进行配制、高压灭菌和铺制平板等，耗费一定的人力和时间。
显而易见，一种能够利用显色培养基高特异性、高灵敏度、易于判别的优点，又能避免繁琐和较长时间操作的一次性新产品成为开发的热点。本发明正是基于此点，致力于开发一种能够适应快速检测微生物的新产品。
发明内容
为了克服现有微生物检测中的缺陷，实现对微生物的快速大批量检测，发明人进行了研究，并开发了一种新型的微生物快速检测显色碟片及其制备方法。该产品集和了显色培养基和便携式一次性平板的优点，采用快速酶促反应显色培养基作为基础，用无纺布和瓜尔胶体系代替了传统培养基中的琼脂作为载体，将它们制备在便携式一次性平皿内，即时可用，方便快捷，且其保质期长(至少为1年)。
该产品可以应用于食品、饮料、化妆品、药品和饮用水等方面的微生物卫生质量检测，环境微生物污染的监测，医学临床的疾病诊断、流行病学研究。
在本发明的一个方面中，提供了一种微生物快速检测显色碟片，其由以下几个部分构成：主体是一次性培养皿，其由培养皿底和培养皿盖组成，其材料可以是从由聚苯乙烯、聚苯丙稀、聚碳或其类似的所组成的组中选择的高分子塑料；培养皿内底部粘附有一层与培养皿底内径一致的具有通透性的无纺布，无纺布上均匀吸附有一层水溶性胶粘剂和水溶性可供微生物生长的基质，其中，该基质包括可供微生物生长的各种营养物质、生长因子、调解基质pH值的碳酸钠、抑制非目标菌生长的抑制剂以及使微生物菌落着色的化学物质或酶底物，其均为水溶性物质，且不含有凝固剂。
本发明的一个实施方式中，一次性培养皿是无色透明的，其由培养皿底和培养皿盖组成，培养皿底主要部分包括圆形培养皿，直径为60mm，以及长方形的可以用于标记的突起部分，培养皿盖为圆形，其可以与培养皿底圆形部分紧密吻合。
在本发明的另一个实施方式中，无纺布为白色，材料为从聚酯纤维、木浆短纤维、粘胶纤维、涤纶、棉及其类似的所组成的组中选择的，其外观为细小网格状，具有通透性，平方米克重为20～40g/m2，酸碱度为中性，断裂强力纵向为至少35N/5cm，横向为至少7N/5cm，吸水量为10～15g/g。
在本发明的另一个实施方式中，胶粘剂为瓜尔胶，其为水溶性天然植物胶。
基于该产品的特征，其优势是显而易见的。由于无纺布和瓜尔胶体具有良好的通透性、疏松的网状结构及较大的表面积，因此更有利于微生物的生长。该产品无须配制和高压灭菌，为一次性即时可用产品，因此用户可以不用购置大量昂贵的微生物检测仪器设备，不用投入大量的人力制备培养基和清洗培养器皿等。该产品经过真空冷冻干燥，去除了95～99％的水分，克服了制备好的琼脂平板易脱水、易染菌、不能长期保存的缺点。
在本发明的另一个方面中，提供了一种制备微生物快速检测显色碟片的方法，其主要包括下列步骤：
a)将无纺布和培养皿进行无菌处理；
b)用激光切割的方法将上述无纺布裁剪成φ50mm的圆形，激光切割法可保证无纺布的横向及纵向拉伸强度不发生改变，保证了无纺布的平均孔径在0.4-1.2μm之间，因此可满足微生物生长的需要；
c)通过机械装置采用负压吸附及正压放置实现将切割后的无纺布平整地贴附在培养皿底部；
d)用冷水配制浓度范围0.8-1.2％的瓜尔胶溶液，并采用湿热灭菌的方法对胶溶液进行无菌处理；
e)采用步进式多点点胶法将1ml d)中的瓜尔胶溶液均匀分散在c)中的无纺布上；
f)采用电热烘干法50±2℃烘干上述装置，采用此法可以充分去除水分并保证无纺布与皿底的牢固粘合，倒置培养皿无纺布不脱落；
g)将湿热灭菌的基质溶液1ml加入到步骤f)的装置中，采用真空冷冻干燥法进行干燥处理，其中所述基质包括可供微生物生长的各种营养物质、生长因子、碳酸钠、抑制非目标菌生长的抑制剂以及使微生物菌落着色的化学物质或酶底物，其均为水溶性物质，采用真空冷冻干燥法可以保证干燥后无纺布体系的吸水性、通透性及更大的表面积，从而使得微生物与无纺布体系的接合更充分。采用这种干燥方法还可排除95～99％以上的水份，微生物的生长和酶的作用无法进行，可保证干燥后的产品能长期保存；
h)使用铝箔袋包装产品，且袋内装有干燥剂。
在发明的一个实施方式中，在步骤a)中采用γ射线进行灭菌处理。
在发明的另一个实施方式中，在步骤b)中被裁剪后无纺布的平均孔径在0.4～1.2μm之间。
在发明的另一个实施方式中，在步骤d)中加入1％的无水乙醇，其会有助于瓜尔胶在冷水中的分散和溶解。
在发明的另一个实施方式中，在步骤e)中采用机械不锈钢压胶装置90度交叉按压两次，保证胶溶液与无纺布的充分均匀浸润。
参考下面优选的实施方案，本发明其它的目的和优点对于本领域技术人员来说是显而易见的。
具体实施方式
除非特别限定，本发明中所使用的所有的科技名词与本领域技术人员所理解的术语是一样的。需要说明的是这里所使用的材料、方法和实例仅是用来对发明进行说明而不是为了对其进行限制(除非作特别说明)。
在本发明中所使用的可供微生物生长的营养物质、生长因子是不受限制的，本领域中技术人员可以根据具体情况进行选择，而这并不需要付出创造性劳动。
在本发明中所使用的微生物菌落着色的化学物质或酶底物不受限制的，本领域中技术人员可以根据具体情况进行选择，而这并不需要付出创造性劳动，例如但不限于TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α吡喃葡萄糖苷及其类似物。
实施例1 微生物快速检测显色碟片的制备
按照下列步骤制备微生物快速检测显色碟片并对微生物样品进行快速检测：
1.利用γ射线对微生物培养皿进行无菌处理；
2.配制浓度0.8％的瓜尔胶溶液，利用湿热蒸汽灭菌；
3.使用激光器将无纺布片切割成直径50mm的圆片，并通过机械系统放入培养皿中；
4.利用机械点胶系统将1ml瓜尔胶溶液按照19点分布法均匀分散于微生物培养皿内；
5.在50±2℃下烘干上述培养装置；
6.按照下面的配方配制营养基质溶液，并进行湿热灭菌处理：
蛋白胨 10.0g
牛肉粉 3.0g
NaCl 5.0g
葡萄糖 1.0g
TTC 0.2g
水补足 1000ml；
7.将1ml无菌处理后的营养基质溶液加入到烘干后的培养皿中，进行真空冷冻干燥后得到了微生物快速检测显色碟片。
实施例2 使用微生物快速检测显色碟片检测微生物
将几株不同标准菌活化培养后的菌悬液进行连续10倍稀释，选择合适的稀释度的稀释液1ml接种于上面制备的微生物快速检测显色碟片中，35±1℃培养24h后，记录红色菌落数。将标准菌株的稀释液同时接种营养琼脂(NA)，按照GB/T4789.2-2003标准方法，35±1℃培养48h后，记录结果。比对试验结果见表1。
表1 标准菌检测结果
| 细菌名称 | 本发明的计数结果CFU/ml | NA计数结果CFU/ml |
| 金黄色葡萄球菌 | 5.7*10<sup>7</sup> | 5.2*10<sup>7</sup> |
| 大肠杆菌 | 6.9*10<sup>7</sup> | 8.3*10<sup>7</sup> |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | 7.9*10<sup>7</sup> | 6.7*10<sup>7</sup> |
| 福氏志贺氏菌 | 8.3*10<sup>7</sup> | 7.1*10<sup>7</sup> |
| 粪链球菌 | 1.1*10<sup>8</sup> | 1.15*10<sup>8</sup> |
将表2中所列的样品按照标准方法进行连续10倍稀释，选择合适的稀释度的稀释液1ml接种于上面制备的微生物快速检测显色碟片中，35℃培养24h后计数红色菌落，同时接种营养琼脂(NA)，按照GB/T4789.2-2003标准方法，35±1℃培养48h后，记录结果。对照试验结果见表2。
表2 不同样品检测结果
| 样品名称 | 本发明的计数结果CFU/ml | NA计数结果CFU/ml |
| 鸡肉 | 3.9*10<sup>3</sup> | 4.0*10<sup>3</sup> |
| 鱼 | 7.1*10<sup>4</sup> | 6.7*10<sup>4</sup> |
| 菠菜 | 2.6*10<sup>4</sup> | 2.8*10<sup>4</sup> |
| 奶粉 | <10 | <10 |
| 巧克力 | 3.3*10<sup>2</sup> | 3.2*10<sup>2</sup> |
由以上实验结果可见，使用本发明的微生物显色碟片易于检测样品的试验、接种及培养。而且由于能够简便、快速、准确的反应试验结果，因此此装置易于对各种微生物进行检测。
前面的说明在这里是本发明的优选实施方式。然而，可以预期，本领域技术人员根据本发明可以做出改变和修饰，而不离开本发明的范围。因此，前面的描述是为了覆盖所有包括这些等价的变化和修饰，这都在本发明的主旨和范围内。
Claims (10)
1.一种微生物快速检测显色碟片，其由以下几个部分构成：主体是一次性培养皿，其由培养皿底和培养皿盖组成，其材料是从由聚苯乙烯、聚苯丙稀或聚碳的所组成的组中选择的高分子塑料；培养皿内底部粘附有一层与培养皿底内径一致的具有通透性的无纺布，无纺布上均匀吸附有一层水溶性胶粘剂和水溶性可供微生物生长的基质，其中，该基质包括可供微生物生长的各种营养物质、生长因子、调解基质pH值的碳酸钠、抑制非目标菌生长的抑制剂以及使微生物菌落着色的化学物质或酶底物，其均为水溶性物质，且不含有凝固剂。
2.根据权利要求1所述的微生物快速检测显色碟片，其中无纺布的材料为从聚酯纤维、木浆短纤维、粘胶纤维、涤纶和棉所组成的组中选择的，其外观为细小网格状，具有通透性，平方米克重为20～40g/m2，酸碱度为中性，断裂强力纵向为至少35N/5cm，横向为至少7N/5cm，吸水量为10～15g/g。
3.根据权利要求1所述的微生物快速检测显色碟片，其中胶粘剂为瓜尔胶。
4.根据权利要求1所述的微生物快速检测显色碟片，其中基质中含有TTC。
5.一种制备根据权利要求1～4任何一项所述微生物快速检测显色碟片的方法，其主要由以下步骤组成：
a)将无纺布和培养皿进行无菌处理；
b)用激光切割的方法将上述无纺布裁剪成φ50mm的圆形；
c)通过机械装置采用负压吸附及正压放置实现将切割后的无纺布平整地贴附在培养皿底部；
d)用冷水配制浓度范围0.8-1.2％的瓜尔胶溶液，并采用湿热灭菌的方法对胶溶液进行无菌处理；
e)采用步进式多点点胶法将1ml d)中的瓜尔胶溶液均匀分散在c)中的无纺布上；
f)采用电热烘干法50±2℃烘干上述装置；
g)将湿热灭菌的基质溶液1ml加入到步骤f)的装置中，采用真空冷冻干燥法进行干燥处理，其中该基质包括可供微生物生长的各种营养物质、生长因子、调解基质pH值的碳酸钠、抑制非目标菌生长的抑制剂以及使微生物菌落着色的化学物质或酶底物，其均为水溶性物质，且不含有凝固剂；
h)使用铝箔袋包装产品，且袋内装有干燥剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中在步骤a)中采用γ射线进行灭菌处理。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其中在步骤b)中被裁剪后无纺布的平均孔径在0.4～1.2μm之间。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其中在步骤d)中加入1％的无水乙醇以助于瓜尔胶在冷水中的分散和溶解。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其中在步骤e)中采用机械不锈钢压胶装置90度交叉按压两次，以保证胶溶液与无纺布的充分均匀浸润。
10.根据权利要求5所述的的制备方法，其中在步骤g)的基质中含有TTC。
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