JP7009137B2 - レジオネラ属菌の検査方法 - Google Patents
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Description
<検水>
本発明のレジオネラ属菌の検査方法において、検査対象となる検水は特に限定されないが、検査方法のベースとなるフィルター貼付法自体に、メンブレンフィルター上にレジオネラ属菌以外の夾雑微生物が発育しやすいと云う性質があるため、たとえば給湯・給水系等の比較的微生物汚染度の低い検水であることが好ましい。
レジオネラ属菌の発育に必要な成分としては、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、L-システインまたはその塩、および、α-ケトグルタル酸が挙げられ、本発明では、これらから選択される少なくとも1つをレジオネラ属菌の発育に必要な成分として用いる。なお、必要に応じてpH緩衝成分やその他の栄養素等を併用してもよい。
レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分としては、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンB、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンB、ナタマイシン等が知られており、本発明では、これらから選択される少なくとも1つをレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分として用いることができる。なお、必要に応じて他の抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質等を併用してもよい。
本発明で用いるレジオネラ属菌用の選択培地としては、レジオネラ属菌の発育に必要な成分のうち、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、L-システインまたはその塩、の3成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分の少なくとも1つを必須成分として含有する選択培地を用いる。さらに、必要に応じて、レジオネラ属菌の発育阻害物質を吸着・除去する成分、たとえば粉末活性炭や、pH緩衝成分、その他の栄養素等を含んでいてもよい。
検水の前処理は、たとえば、以下の方法で行う。即ち、20~100mLの検水に対して等量の酸性緩衝液、たとえば塩酸-塩化カリウム緩衝液(pH2.2)や酸性リン酸緩衝液(pH2.2、たとえば、0.2mol/Lリン酸水溶液と0.2mol/Lリン酸二水素カリウム水溶液とを適宜混合して調製)を同量混合した後、10~20分間室温下に置く。
レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、接触させた粉末活性炭は、たとえばレジオネラ属菌用の選択培地の調整方法と同様の方法で調製することができる。
レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、接触させた粉末活性炭の重層方法としては、たとえばろ過による重層、塗布による重層などが挙げられる。以下、ろ過および塗布による重層について具体的に説明する。
まず、ろ過により各成分と接触した粉末活性炭を重層する方法について説明する。この方法では、レジオネラ属菌の発育に必要な成分とレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と粉末活性炭とを含む混合液を、検水をろ過したメンブレンフィルターで吸引ろ過することで、これら各成分と接触させた粉末活性炭をメンブレンフィルターのろ過面に捕捉させたのち、ろ過面とは反対の面を選択培地に貼付する。ろ過する混合液の量はあらかじめ検討して決定するが、メンブレンフィルターのろ過面全体を粉末活性炭が覆う程度とすることが好ましい。なお、この重層方法は次に説明する、塗布による粉末活性炭の重層方法よりもより容易にかつ均一に粉末活性炭を重層することができるので好ましい。
塗布による重層方法では、各成分と接触した粉末活性炭を検水のろ過面に塗布し、乾燥する。塗布は検水をろ過したメンブレンフィルターの培地への貼付前に行ってもよく、あるいは、貼付後に行ってもよい。
検水をろ過したろ過面に、各成分と接触させた粉末活性炭を重層したメンブレンフィルターが貼付された選択培地を、ろ過面(各成分と接触させた粉末活性炭層側)が下となるようにシャーレを裏返しした状態で36±1℃で5~10日間程度培養する。培養終了後、従来のフィルター貼付法と同様にして判定を行う。具体的にはメンブレンフィルター上に発育したレジオネラ属菌が疑われる淡黄灰色湿潤コロニーを数える。これらコロニーに対してL-システイン要求性確認試験を実施し、L-システイン要求性のあるコロニーをレジオネラ属菌とする。
各地の浴槽水26試料を検水とした。それぞれの検水20mLに酸性リン酸緩衝液(pH2.2)を等量加えて、室温で10分間酸処理した後に、ミックスドセルロースエステル製(アドバンテック社製)、直径47mm、孔径0.45μmのメンブレンフィルターでろ過し、50mLの滅菌脱イオン水でろ過ファネル内を洗浄したのち、吸引ろ過してメンブレンフィルターに残存する酸性緩衝液成分を除去した。
上記の26の検水について、酸性緩衝液成分の除去後にレジオネラ属菌の発育に必要な成分とレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と粉末活性炭とを含む混合液のろ過を行わないこと以外は上記実施例と同様にして培養後、判定を行った。
上記の26の検水について塗抹培養法による検討を行った。各検水400mLを遠心沈殿(6400×g、30分間)して上清を除去した後、4mLの滅菌脱イオン水で再懸濁して100倍濃縮液を調製した。調製したそれぞれの濃縮液0.5mLに酸性リン酸緩衝液(pH2.2)を等量加えて、室温で10分間酸処理した後に、n数を2とするために、2枚のGVPC寒天培地(培地Aおよび培地B)にそれぞれ0.2mLずつ、酸処理を行った濃縮液を塗抹した。その後、実施例と同様に培養したのち、判定を行った。なお、この手法の検出下限は5CFU/100mLである。
実施例、比較例1および比較例2でのレジオネラ属菌の検査結果を表2に示す。
なお、表2中、「R」はレジオネラ属菌の検出数、「O」はレジオネラ属菌以外の夾雑微生物の検出数、「OG」はレジオネラ属菌以外の夾雑微生物のコロニーにより検出不能となったことを、それぞれ表す。
Claims (1)
- 検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、
前記メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層する工程、
前記メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、
前記レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、
を有し、
前記レジオネラ属菌の発育に必要な成分がα-ケトグルタル酸、L-システイン塩酸塩、可溶性ピロリン酸鉄、および、酵母エキスであるとともに、
前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分がシクロヘキシミド、バンコマイシン、および、ポリミキシンBであり、かつ、
前記レジオネラ属菌用の選択培地がGVPC培地であることを特徴とするレジオネラ属菌の検査方法。
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