CN104293880A - 一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基及其鉴定计数方法 - Google Patents

一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基及其鉴定计数方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用海水选择性显色培养基对海洋环境中副溶血弧菌进行快速的分离、鉴定和计数分析的方法。所涉及的步骤具体包括：a、配制副溶血弧菌的海水选择性显色培养平板；b、取一定量海水样品，0.22μm滤膜过滤；c、将滤膜用无菌镊子平移贴于步骤a中制备好的海水选择性显色培养平板中，在28℃下进行培养；d、将出现紫红色的菌落进行计数统计。该方法解决了目前海洋环境中病原菌副溶血弧菌在快速鉴定、计数中的空白，该方法无需进行增菌培养，检测时间短、结果准确可靠。

Description

一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基及其鉴定计数方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基及其鉴定计数方法。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)，是一种常见的病原菌。具体来说，它是一种革兰氏阴性菌，属于弧菌属，广泛存在于河口、海水、海底沉积物等海洋环境以及鱼贝类等海产品中，可以以水和水生动物为媒介感染。它不仅严重危害海水养殖业，还能引发人类胃肠炎等食物中毒病，是一种重要的病原菌。近年来，由于误食受副溶血弧菌污染或加工不当的海产品而的食物中毒事件层出不穷，在我国部分沿海地区细菌性食物中毒中毒居首位。副溶血弧菌感染的症状主要有恶心、呕吐、腹泻以及发热等，严重时甚至会出现脱水、休克昏迷甚至死亡。此外，副溶血弧菌还可能引发伤口感染，严重的可导致败血症进而导致或者死亡。
副溶血弧菌可以以水为媒介感染进而感染人，当伤口接触含有该菌的海水，可能会引发伤口感染，严重时可以引起败血症甚至死亡，严重威胁人类的健康和安全，是海洋环境安全的一个潜在的威胁。因此，在海洋环境特别是浴场环境中关于副溶血弧菌的检测和计数统计，对于浴场安全风险评价评估具有重要的意义。目前，在副溶血弧菌的鉴定方面主要有传统的检测方法、分子生物学检测方法、色谱法、免疫学检测方法等，然而这些方法均不能够进行计数的统计分析。此外，在浴场环境下副溶血弧菌的鉴定和计数方面，属空白领域。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基，同时还提供了应用该海水选择性显色培养基对副溶血弧菌进行鉴定计数方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基，其特征在于，海水选择性显色培养基中每1000mL含有牛肉膏3-10g、蛋白胨5-15g、硫代硫酸钠5-15g、柠檬酸钠3-10g、胆碱3-10g、β-葡萄糖苷0.1-1g、蔗糖10-20g和琼脂15-22g，余量为海水，自然pH。
优选的，上述海水选择性显色培养基中每1000mL含有牛肉膏3g、蛋白胨6g、硫代硫酸钠8g、柠檬酸钠10g、胆碱8g、β-葡萄糖苷0.3g、蔗糖20g和琼脂20g，余量为海水，自然pH。
应用上述海水选择性显色培养基对副溶血弧菌进行鉴定计数的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备海水选择性显色培养平板：将海水选择性显色培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50～60℃，倒平板，备用；
(2)海水水样的过滤：采用无菌取样瓶采集新鲜海水水样10～100mL，用0.22μm的滤膜对海水水样进行过滤；
(3)贴膜培养：采用无菌镊子将步骤(2)中过滤后的滤膜取下，平移贴至步骤(1)中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
(4)将步骤(3)中贴膜后的培养基置于28℃条件下进行培养，培养时间为18-20h；
(5)对步骤(4)培养后的平板上出现的紫红色菌落进行统计计数，得到每百毫升海水样中副溶血弧菌的个数。
所述步骤(1)海水选择性显色培养基的每1000mL中含有牛肉膏3-10g、蛋白胨5-15g、硫代硫酸钠5-15g、柠檬酸钠3-10g、胆碱3-10g、β-葡萄糖苷0.1-1g、蔗糖10-20g和琼脂15-22g，余量为海水，自然pH。
优选的，所述步骤(1)海水选择性显色培养基的每1000mL中含有牛肉膏3g、蛋白胨6g、硫代硫酸钠8g、柠檬酸钠10g、胆碱8g、β-葡萄糖苷0.3g、蔗糖20g和琼脂20g，余量为海水，自然pH。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)以显色培养基代替传统的分离鉴定方法，通过显色反应可以直接对副溶血弧菌进行鉴定，方便快捷；
(2)以海水进行培养基的配制，可以促进海水中弧菌的快速的生长；
(3)鉴定和计数步骤简单，从取样到结果只需20-24小时即可完成，节省了大量的时间和操作步骤，不需要使用复杂的仪器，鉴定和计数成本底，有利于在基层检测部门进行推广和应用，大幅提高检测的准确度和效率。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
特异性实验：海洋环境中副溶血弧菌的海水选择性显色培养基的配制：每1000mL培养基含有牛肉膏10g、蛋白胨5g、硫代硫酸钠15g、柠檬酸钠3g、胆碱10g、β-葡萄糖苷0.1g、蔗糖20g、琼脂15g，海水1000mL，自然pH，将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用。
接种：将副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌混合后进行梯度稀释，取102-105不同浓度的菌液涂布于步骤1中所制备的平板上，恒温28℃培养18h后观察。
结果及分析：副溶血弧菌在培养基中呈现紫红色菌落，其余菌呈现蓝色、绿色、白色菌落或者不生长，表明该培养基对副溶血弧菌具有特异性，不受其它菌的影响。
实施例2：
1、一种海洋环境中中副溶血弧菌的海水选择性显色培养基的配制：每1000mL培养基含有牛肉膏10g、蛋白胨5g、硫代硫酸钠15g、柠檬酸钠3g、胆碱10g、β-葡萄糖苷0.1g、蔗糖20g、琼脂15g，海水1000mL，自然pH；将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用。
2、水样的滤膜过滤：2014年8月用无菌取样瓶采集秦皇岛北戴河老虎石浴场水面以下0.5m新鲜海水100mL，0.22μm滤膜对水样进行过滤；
3、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
4、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下进行培养，培养时间为18-20h；
5、对步骤4培养后的平板上出现的紫红色菌落进行结果进行统计计数，得到海水样中副溶血弧菌的个数。
实施例2的鉴定和计数结果：通过鉴定发现培养平板上出现紫红色、绿色、黄色、白色菌落，统计紫红色菌落个数为123个，因此得到每升浴场海水中副溶血弧菌个数为1230个。本实施例由于气候、浴场人数以及海水水质的不同最终结果可能存在差异。
实施例3:
1、一种海洋环境中副溶血弧菌的海水选择性显色培养基的配制：每1000mL培养基含有牛肉膏5g、蛋白胨10g、硫代硫酸钠6g、柠檬酸钠5g、胆碱5g、β-葡萄糖苷0.3g、蔗糖15g、琼脂20g，海水1000mL，自然pH，将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、水样的滤膜过滤：2014年8月用无菌取样瓶采集秦皇岛北戴河老虎石浴场水面以下0.5m新鲜海水10mL，用0.22μm的滤膜对海水水样进行过滤；
3、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
4、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下进行培养，培养时间为18-20h；
5、对步骤4培养后的平板上出现的紫红色菌落进行结果进行统计计数，得到海水样中副溶血弧菌的个数。
本实施例3的鉴定和计数结果：通过鉴定发现培养平板上出现紫红色、绿色、黄色、白色菌落，统计紫红色菌落个数为15个，因此得到每升浴场海水中副溶血弧菌个数为1500个。本实施例由于气候、浴场人数以及海水水质的不同最终结果可能存在差异。
实施例4:
1、一种海洋环境中副溶血弧菌的海水选择性显色培养基的配制：每1000mL培养基含有牛肉膏3g、蛋白胨5g、硫代硫酸钠8g、柠檬酸钠10g、胆碱8g、β-葡萄糖苷0.6g、蔗糖20g、琼脂18g，海水1000mL，自然pH，将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、水样的滤膜过滤：2014年8月用无菌取样瓶采集秦皇岛北戴河老虎石浴场水面以下0.5m新鲜海水100mL，用0.22μm的滤膜对海水水样进行过滤；
3、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
4、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下进行培养，培养时间为18-20h；
5、对步骤4培养后的平板上出现的紫红色菌落进行结果进行统计计数，得到海水样中副溶血弧菌的个数。
本实施例4的鉴定和计数结果：通过鉴定发现培养平板上出现紫红色、绿色、黄色、白色菌落，统计紫红色菌落个数为131个，因此得到每升浴场海水中副溶血弧菌个数为1310个。本实施例由于气候、浴场人数以及海水水质的不同最终结果可能存在差异。
实施例5：
作为最优实施例，实施例5浴场水样中副溶血弧菌的鉴定和计数统计具体实施方案为：
海洋环境中副溶血弧菌的海水选择性显色培养基，每1000mL培养基含有牛肉膏3g、蛋白胨6g、硫代硫酸钠8g、柠檬酸钠10g、胆碱8g、β-葡萄糖苷0.3g、蔗糖20g、琼脂20g，海水1000mL，自然pH。
海洋环境中副溶血弧菌的快速鉴定和计数方法包括以下步骤：
1、制备海水选择性显色培养平板：将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、水样的滤膜过滤：2014年8月用无菌取样瓶采集秦皇岛北戴河老虎石浴场水面以下0.5m新鲜海水100mL，0.22μm的滤膜对海水水样进行过滤；
3、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
4、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下进行培养，培养时间为18h；
5、培养后平板中出现不同颜色的菌落，对其中出现的紫红色菌落进行结果进行统计计数，得到每百毫升海水样中副溶血弧菌的个数。
本实施例5的鉴定和计数结果：通过鉴定发现培养平板上出现紫红色、绿色、黄色、白色菌落，统计紫红色菌落个数为128个，因此得到每升浴场海水中副溶血弧菌个数为1280个。本实施例由于气候、浴场人数以及海水水质的不同最终结果可能存在差异。
实施例6：
对海水养殖区中的副溶血弧菌进行鉴定和计数统计
1、制备海水选择性显色培养平板：将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、取样：2014年8月，无菌取样瓶采集秦皇岛近岸海域养殖区新鲜海水1L，立即送回实验室备用；
3、水样的滤膜过滤：在无菌条件下取海水10mL，0.22μm滤膜过滤；
4、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
5、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下培养18h；
6、结果及分析：培养后平板中出现不同颜色的菌落，其中副溶血弧菌呈现紫红色，表明在所检测的海水养殖区环境中存在副溶血弧菌，统计其中出现的紫红色菌落，得到每升近岸海域养殖区水样中副溶血弧菌的个数为4300个。
实施例7：
近岸海域副溶血弧菌的鉴定和计数统计
1、制备海水选择性显色培养平板：将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、取样：2014年8月，秦皇岛近岸海域设置8个取样站位，用无菌取样瓶采集近岸海域每个站位新鲜海水1L，立即送回实验室备用；
3、水样的滤膜过滤：在无菌条件下取海水100mL，0.22μm滤膜过滤；
4、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
5、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下培养18h；
6、结果及分析：培养后所有平板中均出现不同颜色的菌落，其中副溶血弧菌呈现紫红色，表明在所检测的近岸海域环境中存在副溶血弧菌，统计其中出现的紫红色菌落，得到每升近岸海域水样中副溶血弧菌的个数为1450个。
对比例1：
自来水中副溶血弧菌的鉴定和计数统计
1、制备海水选择性显色培养平板：将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、取样：2014年8月，用无菌取样瓶采集天津大学自来水1L，立即送回实验室备用；
3、水样的滤膜过滤：在无菌条件下取天津大学自来水100mL，用0.22μm滤膜过滤；
4、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
5、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下培养18h；
6、结果及分析：培养后所有平板中未有紫红色菌落出现，表明自来水中不存在副溶血弧菌。
对比例2：
浴场中副溶血弧菌的鉴定和计数统计
1、制备海水选择性显色培养平板：将培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50-60℃，倒平板，备用；
2、取样：2014年8月，在天津海河中用无菌取样瓶采集水样1L，立即送回实验室备用；
3、水样的滤膜过滤：在无菌条件下取天津海河水100mL，用0.22μm的滤膜过滤；
4、贴膜培养：采用无菌镊子将步骤2中过滤后滤膜取下，平移贴至步骤1中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上使滤膜与平板之间紧贴无气泡；
5、将步骤3中贴膜后的培养基置于28℃条件下培养18h；
6、结果及分析：培养后所有平板中未有紫红色菌落出现，表明自来水中不存在副溶血弧菌。
需要说明的是，实施例中所过滤的水样量可根据具体水质情况酌情增减，其目的是为了便于对副溶血弧菌进行鉴定计数。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基，其特征在于：海水选择性显色培养基中每1000mL含有牛肉膏3-10g、蛋白胨5-15g、硫代硫酸钠5-15g、柠檬酸钠3-10g、胆碱3-10g、β-葡萄糖苷0.1-1g、蔗糖10-20g和琼脂15-22g，余量为海水，自然pH。
2.根据权利要求1所述的一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基，其特征在于：
3.应用权利要求1或2所述的一种副溶血弧菌的海水选择性显色培养基对副溶血弧菌进行鉴定计数的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备海水选择性显色培养平板：将海水选择性显色培养基加热煮沸灭菌，待冷却至50～60℃，倒平板，备用；
(2)海水水样的过滤：采用无菌取样瓶采集新鲜海水水样10～100mL，用0.22μm的滤膜对海水水样进行过滤；
(3)贴膜培养：采用无菌镊子将步骤(2)中过滤后的滤膜取下，平移贴至步骤(1)中制备好的海水选择性显色培养平板的表面上，使滤膜与海水选择性显色培养平板之间紧贴无气泡；
(4)将步骤(3)中贴膜后的培养基置于28℃条件下进行培养，培养时间为18-20h；
(5)对步骤(4)培养后的平板上出现的紫红色菌落进行统计计数，得到每百毫升海水样中副溶血弧菌的个数。
4.根据权利要求3所述的对副溶血弧菌进行鉴定计数的方法，其特征在于：所述步骤(1)海水选择性显色培养基的每1000mL中含有牛肉膏3-10g、蛋白胨5-15g、硫代硫酸钠5-15g、柠檬酸钠3-10g、胆碱3-10g、β-葡萄糖苷0.1-1g、蔗糖10-20g和琼脂15-22g，余量为海水，自然pH。
5.根据权利要求3所述的对副溶血弧菌进行鉴定计数的方法，其特征在于：所述步骤(1)海水选择性显色培养基的每1000mL中含有牛肉膏3g、蛋白胨6g、硫代硫酸钠8g、柠檬酸钠10g、胆碱8g、β-葡萄糖苷0.3g、蔗糖20g和琼脂20g，余量为海水，自然pH。
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