CN110272937B - 一种包装饮用水中微生物的灵敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及饮用水中微生物的检测技术领域，具体为一种包装饮用水中微生物的灵敏检测法，尤其适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测。本发明通过滤膜分离法、离心分离法等方式将检测样品中的潜在微生物有效分离并接种于液体培养基中，结合恒温振荡培养方式，增加了检测的灵敏性，培养8‑24h后即可使用光学检测方法客观地辨别培养液的浊度差异，从而做出初筛结果的判定，由此评估产品的微生物污染风险，生产企业可更高效地利用产品微生物检测结果的反馈指导实际生产。
Description
技术领域
本发明涉及饮用水中微生物的检测技术领域，尤其涉及包装饮用水中铜绿假单胞菌灵敏检测方法。
背景技术
微生物污染是影响食品安全的重要因素，也是造成包装饮用水产品不合格的主要原因，对生产过程及成品进行微生物检测是风险控制的必要手段。
铜绿假单胞菌是包装饮用水生产过程中质量控制的关键指标菌，铜绿假单胞菌的检测能力直接关系产品质量的保证。GB 8538-2016《饮用天然矿泉水检验方法》中的“铜绿假单胞菌的检测方法”是针对包装水铜绿假单胞菌检测的现行国家标准方法，该方法是基于滤膜法，以琼脂培养基的方式进行培养，初筛培养24-48h后，对可疑菌落进行鉴定。由于包装饮用水的成品一般无铜绿假单胞菌污染，初筛培养基上一般无法检测到菌落生长，但按照该方法要求，需48h后才能依据初筛培养基的菌落情况做出铜绿假单胞菌的初筛结果判定，时间过长，生产企业无法及时利用微生物的检测结果指导生产。
发明内容
本发明针对现有包装饮用水微生物如铜绿假单胞菌检测方法初筛判定耗时长、检测结果无法实时反馈并指导生产等问题，提供一种应用范围广、检测灵敏度高、初筛判定耗时短的微生物(尤其是铜绿假单胞菌)检测方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种包装饮用水中微生物的灵敏检测方法，包括以下步骤：
S1、微生物的分离采集。对于污染程度较低、采样体积要求较大的检测样品，通过离心分离法、滤膜分离法等方式处理100-1000mL检测样品，使得检测样品中含量较少的潜在微生物和较大体积的样液分离，以缩小关注范围，有效捕获、采集检测样品中的潜在微生物，避免因有限的接种量而影响检测样品的代表性，提高检测结果的准确性。对于污染程度较高、采样体积要求较小的检测样品，亦可通过直接接种等方式，采集检测样品中的潜在微生物。同时，以无菌水作为样品，采用相同的方法处理，作为阴性对照样。
S2、接种培养。将采集到的微生物转移接种至50-200mL液体培养基中，与培养液完全充分接触。将接种后的液体培养基于100-360rpm振荡培养装置中，恒定温度培养。若目标微生物为细菌，则培养温度为30-42℃；若目标微生物为真菌，则培养温度为25-30℃。培养条件(培养液、培养温度、培养转速、培养时长等)由检测的目标微生物的特性决定，选择目标微生物的最适生长条件作为培养条件。阴性对照样随同检测样品一起，以相同的方式接种和培养。
S3、培养液浊度辨别。将经培养后的阴性对照样及检测样品取出，通过肉眼透过光源直接观察培养液、使用光学仪器测量培养液浊度值等方式，辨别阴性对照样及检测样品之间的浊度差异，由此判断检测样品是否有微生物繁殖，从而判断检测样品是否受到微生物污染。若确定阴性对照样无微生物繁殖，则该阴性对照样有效(称为有效阴性对照样)并将其作为参比样，再比较检测样品和阴性对照样两者间培养液的浊度差异。若检测样品的浊度大于有效阴性对照样的浊度，则判定该检测样品为初筛可疑样，否则判定该检测样品无微生物检出。
S4、菌落分离纯化及鉴定。将初筛可疑样划线至琼脂培养基上，分离培养出单个菌落，通过菌落特征、显微镜检、生化反应等方式鉴定菌落。根据菌落鉴定情况，报告微生物检出结果。
优选地，所述S1步骤中，离心分离法所用的转速为2000-8000rpm，时间为2-10min，温度为4-30℃。
优选地，所述S1步骤中，滤膜分离法所用滤膜为孔径≤0.45μm的无菌滤膜。
优选地，所述S2步骤所指的液体培养基，可以是促进目标微生物生长繁殖的液体培养基，或抑制除目标微生物外的其他微生物生长繁殖的选择性培养基。
优选地，所述S3步骤中，由于部分液体培养基其成分中含有特别物质，即便不存在微生物繁殖情况，其本身即存在一定本底浊度，导致透光率稍差，仅通过肉眼观察难以区分其是否受到微生物污染。对于存在本底浊度的液体培养基，使用光学仪器测量若干该液体培养基的本体浊度值并计算平均浊度值，通过建立液体培养基的本底浊度质控表等方式，确定其本底浊度范围值，阴性对照样的浊度值与平均浊度值比较以判断该阴性对照样是否为有效阴性对照样。优选的，步骤S3中，若阴性对照样的浊度值小于或等于2倍平均浊度值，则该阴性对照样为有效阴性对照样。
优选地，所述S3步骤中，检测样品的浊度值大于2倍有效阴性对照样的浊度值，可判定该检测样品为初筛可疑样。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过滤膜分离法、离心分离法等方式将检测样品中的潜在微生物有效分离出来，可避免因有限的接种量而影响样品的代表性，提高了检测结果的准确性，特别适用于包装饮用水等微生物污染程度较低、而体积较大的液体产品。
2、本发明将液体培养基和振荡培养方式相结合，能提供更为丰富的营养环境和更为充分的氧气，有利于为大多包装饮用水微生物(特别是包装饮用水中经臭氧消毒后受损的铜绿假单胞菌)的生长提供更为适宜的生长环境，增加了检测的灵敏性，使微生物，特别是铜绿假单胞菌，能生长得更快，8-24h后即可进行初筛结果的判定，大大缩短了检测所用的培养时间，对于生产企业而言，即可以更高效地利用反馈的检测结果指导生产。
3、本发明采用光学检测方法对检测样品与阴性对照样的浊度进行比较，不仅可客观、快速、准确地筛查出符合标准的样品，对于部分本身存在本底浊度的、不适合用肉眼观察浊度差异的培养液，此方法可避免因人为主观因素的不确定性造成对结果判定的影响。
综上所述，对于包装饮用水的生产，由于包装饮用水的成品一般无微生物污染，更少见铜绿假单胞菌污染，完成产品的初筛检测即可初步评估微生物安全风险。因此应用本发明方法对包装饮用水产品进行微生物检测初筛判定以指导生产，相比现有的检测方法可至少缩短24h以上，显著缩减了微生物检测初筛判定所需时长，提高了检测效率，保证食品安全风险监控的同时，也为企业生产效率的提升提供了可能。此外，完成初筛检测后，对初筛可疑样可作进一步分离纯化和菌落鉴定，可获得准确的检测分析结果。
附图说明
图1为有微生物繁殖的CN液体培养基(阳性)与无微生物繁殖的CN液体培养基(阴性)的对比图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实验过程对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例1
包装饮用水中铜绿假单胞菌的灵敏检测
采用滤膜分离法，将250mL水样用0.45μm滤膜过滤，并将滤膜转移至50mL CN液体培养基中，36±1℃恒温振荡培养8-24h，设置转速150rpm。所述水样包括检测样品及用于作为阴性对照样的无菌水。
由于CN液体培养基中含有使其具有一定本底浊度的物质成分，因此先使用浊度计测量若干CN液体培养基的本体浊度值并计算平均浊度值，建立CN液体培养基的培养液本底浊度质控表(例如下表1所示)，确定其本底浊度范围值，用于将阴性对照样的浊度值与平均浊度值比较，以判断该阴性对照样是否为有效阴性对照样。
将经培养后的阴性对照样及检测样品取出，通过肉眼观察及使用浊度计检测阴性对照样和检测样品的浊度值；若阴性对照样的浊度呈现出无微生物繁殖，符合CN液体培养基本底浊度范围值(阴性对照样的浊度值小于或等于2倍平均浊度值)，则判定该阴性对照样为有效阴性对照样。CN液体培养基有微生物繁殖(阳性)与无微生物繁殖(阴性)的对比如图1所示。
比较检测样品与有效阴性对照样的浊度；若检测样品的浊度值大于2倍有效阴性对照样的浊度值，则判定该检测样品为铜绿假单胞菌的初筛可疑样，否则判定为铜绿假单胞菌未检出。
对初筛可疑样进行纯化鉴定；将初筛可疑样于CN琼脂平板上进行划线接种并将划线接种后的CN琼脂平板倒置于36±1℃恒温培养箱培养24h；若CN琼脂平板出现蓝色或绿色的菌落，则判定该初筛可疑样为铜绿假单胞菌检出。若CN琼脂平板未出现蓝色或绿色的菌落，则在360±20nm紫外线下检查该CN琼脂平板，若观测到荧光且为非蓝色或非绿色的菌落，则将菌落划线接种至营养琼脂平板并于36±1℃培养20-24h，然后用纯化后的培养物进行乙酰胺肉汤确证试验；若乙酰胺肉汤确证试验的结果为阳性，则判定该初筛可疑样为铜绿假单胞菌检出。若观测到红褐色但无荧光的菌落，则将菌落划线接种至营养琼脂平板并于36±1℃培养20-24h，然后用纯化后的培养物进行氧化酶确证试验；若氧化酶确证试验的结果为阳性，则用纯化后的培养物继续分别进行乙酰胺肉汤确证实验和金氏B培养基确证试验；若氧化酶确证试验、乙酰胺肉汤确证实验、金氏B培养基确证试验的结果均为阳性，则判定该初筛可疑样为铜绿假单胞菌检出。
表1 CN液体培养基的本底浊度质控表
上述实施例以检测包装饮用水中铜绿假单胞菌为例对本发明技术作进一步的详细介绍，以便于对本发明技术的理解，本发明技术并不局限于检测包装饮用水中铜绿假单胞菌。
实施例2
包装饮用水中细菌的灵敏检测
采用滤膜分离法，将250mL水样用0.45μm滤膜过滤，并将滤膜转移至50mL TSB液体培养基中，36±1℃恒温振荡培养8-24h，设置转速150rpm。所述水样包括检测样品及用于作为阴性对照样的无菌水。
将培养后的阴性对照及检测样品取出，通过肉眼直接观察阴性对照样和检测样品的浊度。若阴性对照样澄清不浑浊，呈现出无微生物繁殖，则判定该阴性对照样为有效阴性对照样。
通过肉眼直接观察并比较检测样品与有效阴性对照样的浊度。若检测样品的浊度明显大于有效阴性对照样的浊度，则判定该检测样品为细菌的初筛可疑样，否则判定为细菌未检出。
也可通过浊度计测量并比较检测样品与有效阴性对照样的浊度值。若检测样品的浊度值大于2倍有效阴性对照样的浊度值，则判定该检测样品为细菌的初筛可疑样，否则判定为细菌未检出。
在其他具体实施方案中，还可以通过离心分离法采集检测样品中的潜在微生物，离心分离的条件可设为：转速2000-8000rpm，时间2-10min，温度4-30℃；通过滤膜分离法采集检测样品中的潜在微生物时，所用滤膜还可选择孔径≤0.45μm的其他无菌滤膜；进行振荡培养时，转速一般设为100-360rpm。
以上所述仅通过举例的方式以具体的实验方法过程来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
Claims (5)
1.一种包装饮用水中微生物的初筛检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采集检测样品中的微生物；同时，以无菌水作为样品以相同的方法进行处理，作为阴性对照样；
S2、将采集到的微生物转移接种至CN液体培养基中，并将接种后的CN液体培养基于振荡培养装置中，恒定温度培养24h，以目标微生物的最适生长条件为培养条件；
所述阴性对照样随同检测样品一起，以相同的方式接种和培养；
S3、将经培养后的阴性对照样及检测样品取出，辨别阴性对照样与检测样品两者间培养液的浊度差异；
使用浊度计测量若干CN液体培养基的本体浊度值并计算平均浊度值，依此建立CN液体培养基的本底浊度质控表；若阴性对照样的浊度值小于或等于1.5倍CN液体培养基平均浊度值，则该阴性对照样为有效阴性对照样；比较检测样品与有效阴性对照样两者间培养液的浊度差异，若检测样品的浊度值大于1.5倍有效阴性对照样的浊度值，则判定该检测样品为初筛可疑样；否则判定该检测样品无微生物检出；
所述的微生物为铜绿假单胞菌。
2.根据权利要求1所述的包装饮用水中微生物的初筛检测方法，其特征在于，步骤S3后还包括步骤S4，将初筛可疑样划线至琼脂培养基上，分离培养出单个菌落并对菌落进行鉴定，根据菌落鉴定情况报告微生物检出结果。
3.根据权利要求1所述的包装饮用水中微生物的初筛检测方法，其特征在于，步骤S1中，通过离心分离法或滤膜分离法处理100-1000mL检测样品，使检测样品中潜在的微生物与样液分离以采集潜在的微生物，或通过直接接种的方式采集检测样品中潜在的微生物。
4.根据权利要求3所述的包装饮用水中微生物的初筛检测方法，其特征在于，步骤S1中，离心分离法所用的转速为2000-8000rpm，时间为2-10min，温度为4-30℃。
5.根据权利要求3所述的包装饮用水中微生物的初筛检测方法，其特征在于，步骤S1中，滤膜分离法所用滤膜为孔径≤0.45μm的无菌滤膜。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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