JP4373947B2 - 微生物を計数し特定するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、膜によるろ過、標的の増幅と、蛍光検出または比色検出などによる標的の検出を利用する、液体における微生物を検出し、計数し、および特定するための方法に関する。本方法の鍵となる特質は、存在する生物の迅速な検出、計数および特定を可能とする増幅工程である。増幅は、そのDNAまたはRNAなどの、生物における精選された分子を標的とし、標的分子が存在することを確認するために、いくつもの利用可能な検出技術によって検出が可能なレベルにまで、存在する分子を増加させる。増幅試薬には、単数(または複数)の標的分子の存在を示すための一種以上の検出試薬が含まれ、増幅試薬によって、種のレベルまたは属のレベルで、さらには門や界のレベルで選択された標的間の区別が可能となる。
a)微生物の保持に適する膜によって液体サンプルをろ過すること、
b)一種以上の検出試薬を含む一種以上の試薬を用いる増幅工程で、その膜上の微生物を処理すること、および
c)一種以上の保持された微生物の存在/非存在を求め、検出された数を計数し、および選択された検出試薬が存在することによって、存在する微生物のタイプを特定することを含む方法を提供することである。
本発明は、液体または粉末、塩、クリーム、錠剤などの可溶性の固体における微生物を迅速に検出し、計数しおよび特定するための方法に関する。このような液体としては、飲料水またはその他の水、牛乳などの乳製品、ビール、ワイン、ソフトドリンク、果汁、医薬品、輸液、バクテリアルエアーカウントなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
Claims (10)
- 水、食品および医薬品から選択される液体サンプル中の汚染微生物を検出し、計数し且つ特定するための方法であり、
a)液体サンプルをPVDF膜を通してろ過して微生物を膜上に保持し、
b)膜上に保持された微生物を1〜8時間培養し、d)一種以上の微生物の存在/非存在、検出数を検出し、タイプを特定することより成る一連の工程を含む前記方法において、
c)工程b)と工程d)の間で、膜を核酸の増幅工程に付し、増幅工程が、一種以上の検出試薬を含み、且つ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸配列に基づいた増幅(NASBA)、ストランド置換増幅(SDA)およびリンクドリニア増幅(LLA)からなる群より選択されることを特徴とする、前記方法。 - 液体サンプルが、50から1000ミリリットルである、請求項1に記載の方法。
- 膜が、疎水性の区画で隔てられた親水性の領域を有するPVDF膜である、請求項1または2に記載の方法。
- 増幅工程が、30から90分間の期間に実施される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅が、核酸に基づいた増幅システムである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- a)検出試薬が、蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、且つデジタル画像化システムによって読み取られ、または
b)増幅が、核酸に基づいたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の形式の増幅システムであり、検出試薬が、蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、且つデジタル画像化システムによって読み取られ、または
c)試薬が、標的DNAおよび標的RNAからなる群より選択され、検出試薬が、蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、且つデジタル画像化システムによって読み取られ、または
d)増幅が、核酸に基づいたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の形式の増幅システムであり、試薬が、標的DNAおよび標的RNAからなる群より選択され、検出試薬が、蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、且つデジタル画像化システムによって読み取られる、請求項5に記載の方法。 - 検出試薬が、X線フィルム、膜上の比色反応の視覚的検出および蛍光性タグにより、またはデジタル画像により読み取られる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 膜が、温度制御装置中で30から90分間、増幅工程に付される、請求項1に記載の方法。
- 膜が、1から4時間培養される、請求項1に記載の方法。
- 検出試薬が、蛍光性タグ、放射性タグ、比色用タグまたは酵素タグから選択される、請求項1に記載の方法。
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