KR20200062321A - 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법 - Google Patents

샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200062321A
KR20200062321A KR1020207013325A KR20207013325A KR20200062321A KR 20200062321 A KR20200062321 A KR 20200062321A KR 1020207013325 A KR1020207013325 A KR 1020207013325A KR 20207013325 A KR20207013325 A KR 20207013325A KR 20200062321 A KR20200062321 A KR 20200062321A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
dye
microorganisms
concentration
aliquot
Prior art date
Application number
KR1020207013325A
Other languages
English (en)
Inventor
요나스 자비스
얀 그라베
마르쿠스 클린츠테트
Original Assignee
큐-리네아 에이비
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 큐-리네아 에이비 filed Critical 큐-리네아 에이비
Publication of KR20200062321A publication Critical patent/KR20200062321A/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06Quantitative determination
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/06Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of illumination
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48Automatic or computerized control
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06Lysis of microorganisms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18Testing for antimicrobial activity of a material
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31Apparatus therefor
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38Diluting, dispersing or mixing samples
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/302Stain compositions
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 선택적으로 희석 값으로 희석된 분취액을 제공하도록 샘플의 분취액을 희석하는 단계; 샘플 분취액의 적어도 일부, 또는 희석된 샘플 분취액의 적어도 일부를 DNA에 결합할 수 있는 제1 염색제 및 제2 염색제와 접촉시키는 단계이되, 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있는 것인 단계; 제1 방출 파장에서 분취액-염색제 혼합물을 영상화하고 영상화된 혼합물에서 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하는 단계; 및 상기 분취액에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하는 단계를 포함하는 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법, 및 이를 위한 장치, 소모품 및 키트에 관한 것이다.

Description

샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법
본 발명은 일반적으로 샘플에서의 미생물의 검출 및 특성규명에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 측정하기 위한 신속한 방법을 제공한다. 특히, 온전한 미생물은 생존 가능할 수 있다.
전통적으로, 샘플에서의 미생물 성장 및 미생물 농도는 샘플의 탁도와 같은 광학 매개변수를 측정하여 결정하였다. 예를 들어, 샘플 내의 미생물(일반적으로 박테리아)의 수가 주어진 탁도 범위 내에 있도록 샘플의 탁도에 대한 기준으로 McFarland 표준이 미생물학에 사용되고, 샘플에서 미생물의 농도를 결정하기 위해 탁도계(nephelometer)에 이 표준을 사용할 수 있다. 샘플에서 미생물의 농도를 결정하기 위해 분광광도법을 포함하는 대안적인 기법을 사용할 수 있다. 그러나, 이러한 기법은 신속하고 쉽게 실행될 수는 있지만 샘플에서 미생물의 수를 근사치화할 수 있을 뿐이다. 상이한 미생물 종에 대해 샘플에서의 미생물의 농도와 탁도 또는 특정 광 파장의 흡광도 사이의 관계 또한 달라 해당 미생물의 정체를 알지 못할 때에는 미생물의 농도를 추정하는 것이 어렵다. 더욱이, 이러한 기법은 샘플의 전체 탁도 또는 흡광도만을 측정할 수 있고, 그러므로 샘플에서의 생존 가능한 세포(viable cell)(즉, 살아 있는 세포)와 생존 불가능한 세포(즉, 죽은 세포)를 구별할 수 없거나, 실제로 샘플에서의 온전한 미생물, 세포 잔해 또는 다른 잔해를 구별할 수 없다. 샘플에서의 미생물의 농도의 탁도 측정은 또한 감도가 낮아 샘플에서의 미생물의 농도를 측정할 수 있기 위해서는 비교적 높은 농도의 미생물이 필요하다. 이는 낮은 농도가 이런 방식으로는 측정되지 못하게 하고, 측정될 수 있기 전에 확장된 배양 단계를 또한 필요로 할 수 있다.
샘플의 일부(또는 희석된 일부)를 고형 성장 배지에 플레이팅하고, 그 샘플을 항온처리하고, 형성된 콜로니의 수를 계수함으로써 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 수를 보다 정량적으로 또한 추정할 수 있다. 그러나, 이러한 기법의 단점은 미생물 성장이 발생하기에 충분한 시간을 허용하기 위해서 이 기법이 긴 항온처리 단계를 필요로 한다는 점이다. 따라서, 이러한 고전적인 기법은 특정 시점에 샘플에서의 미생물의 농도를 측정하기에는 유용하지만, 예를 들어 그 샘플에서의 미생물에 대한 시험 또는 분석을 수행하기 위해 생존 가능한 미생물의 농도가 빨리 요구되는 경우에는 제한적으로 사용되는데, 그 시험 또는 분석은 샘플에 존재하는 미생물의 수에 대한 사전 지식을 필요로 한다.
생존 가능한 세포(즉, 살아 있는 세포)가 죽은 세포와 구별될 수도 있고, 이 목적을 위해 다수의 기법이 이용 가능하다는 것이 미생물 검출 분야에서 잘 알려져 있다. 당업계에 공지된 방법은 핵산 염색, 막 전위, 산화환원 지시제 또는 리포터 유전자에 중점을 둔다. 일반적으로, 이 기법은 죽은 미생물의 막이 파괴되고/되거나 찢어지는 것에 반하여 생존 가능한 미생물의 막이 온전하다는 사실에 의존한다(문헌[Gregori et al. 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4662-4670]).
죽은 세포를 살아 있는 세포와 구별하게 하는 특정 기법은 사세포/생세포 염색(dead/live staining)의 기법이다. 막에 비투과성인 염료 또는 염색제를 사용함으로써 막이 온전한 세포는 염색되지 않는 반면에 막이 파괴된 세포만이 염색된다. 따라서 상기 염료/염색제는 죽은 세포에 대한 마커로 작용하는데, 이러한 염료를 사용하게 되면 막이 파괴된 세포(즉, 죽은 세포)만이 염색되기 때문이다. 이러한 방식으로, 죽은 세포를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 전체 죽은 세포의 비율을 계산할 수 있다. 이 분야의 더 나아간 발전으로 두 가지 별개의 염색제를 사용하는 기법을 개발하였는데, 첫 번째는 세포 투과성이며 살아 있는 세포와 죽은 세포 둘 모두에 들어갈 수 있고, 두 번째는 세포 불투과성이며 죽은 세포에만 들어갈 수 있다. 따라서 살아 있는 세포와 죽은 세포를 다르게 표지할 수 있고, 이에 따라 구별할 수 있다. 이 기법을 수행하기 위한 키트의 예는 SYTO9(세포 투과성) 염색제 및 프로피디움 요오다이드(PI)(세포 불투과성) 형광 염료를 포함하는 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit(Invitrogen)이다. 이 키트에 사용된 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두의 방출 파장에서 미생물 세포를 검출함으로써, 이 기법은 살아 있는 미생물 세포와 죽은 미생물 세포를 구별하여 샘플에 존재하는 생존 가능한 미생물의 비율을 결정하는 데 특히 유용할 수 있다. 샘플에서 다르게 염색된 살아 있는 미생물 세포와 죽은 미생물 세포를 구별하기 위해 다수의 상이한 검출 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미생물 세포가 예를 들어 현미경 시야에서 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포로 표시되어 샘플에서 이 세포의 수를 직접 계수할 수 있고, 이러한 방식으로 샘플에 존재하는 생존 가능한 미생물의 비율을 결정할 수 있다. 그러나, 이러한 기법은 노동 및 시간 집약적이고, 생존 가능한 미생물의 농도가 정확하게 결정되게 하지 않는다. 유세포 분석법과 같은 자동화 세포 계수 방법이 생세포/사세포 염색 기법과 조합될 때 샘플에서 생존 가능한 미생물의 비율을 측정하기 위해 사용될 수도 있지만(문헌[Berney et al. 2007. Applied and Environmental Microbiology 73, 3283-3290]), 복잡한 고도의 전문 기기장치 및 정기적인 보정(예를 들어, 각 샘플을 측정하기 전에 별개의 보정)이 유세포 분석 방법에 필요하다. 따라서, 이러한 기법은 일상적인 임상 실험실 사용에 필요한 것과 같은 강력한 검출 방법에 사용하기에는 일반적으로 적합하지 않고, 이러한 기법의 자동화가 어려울 수 있다. 따라서, 특히 임상 사용을 위해 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 측정하기 위한 간단하고 신속하고 강력한 방법 및 기구가 필요하다.
상기에 기재된 바와 같이, 적합한 염료를 사용할 때 세포막이 손상되거나 파괴된 미생물과 다르게 세포막이 온전한 미생물을 염색할 수 있다. 따라서, 생세포/사세포 염색에 의해 생존 가능한 세포를 검출하는 것은 일반적으로 세포막이 온전한 세포를 검출하는 것을 포함하므로, 세포막이 온전한 세포는, 샘플에서 생존 가능한 미생물 세포의 농도를 측정할 목적을 위해, 생존 가능한 세포를 나타내는 것으로 간주된다. 온전한 세포와 생존 가능한 세포 사이의 상관관계는 양호하고, 이에 따라 차등 염색의 이용은 긴 항온처리 단계를 대개 포함하는 직접적인 생존력 측정을 수행할 것을 요하지 않으면서 생존 가능한 세포의 농도를 결정하기 위한 간단하고 신속한 방식을 제공한다. 생세포/사세포 염색 분석에서 '생존 가능'으로 나타난 미생물 세포의 일부가 온전한 세포막을 포함할 수 있지만, 실제로는 이들이 대사적으로 비활성이거나 그렇지 않으면 배양 불가능할 수 있다고 일부 경우에서 보고된 바 있다(문헌[Trevors 2012. J Microbiol Meth 90, 25-8]). 더욱이, 생존 가능한 미생물 세포의 막 완전성은 영양소가 풍부한 환경에서 빠르게 기하급수적으로 성장하는 동안 감소할 수 있고, 이에 의해 제2 형광 염료가 세포 안으로 들어갈 수 있게 된다(문헌[Shi et al. 2007. Cytom Part A 71A, 592-298]). 따라서, 이러한 세포는 제2 방출 파장에서 광을 방출할 것이고, 제2 형광 염색제가 제1 형광 염색제의 형광을 소멸시키는 능력으로 인해, 이러한 세포의 제1 방출 파장에서의 형광이 감소할 수 있다. 또한, 제1(세포 투과성) 형광 염색제의 표백 작용 및 예상보다 높은 흡수와 같은 문제는 이러한 방법의 정확도에 영향을 미칠 수 있다(문헌[Stiefel et al. 2015. BMC Microbiology 15:36]). 그럼에도 불구하고, 이들 인자들은 샘플에서 생존 가능한 미생물의 양 또는 농도를 결정하는 방법의 결과에 영향을 미치는 것으로 중요하게 고려되지 않고 있고, 온전한 세포를 검출하는 것이 샘플에서의 생존 가능한 세포의 양 또는 농도를 결정하기 위한 효과적인 방식인 것으로 고려되고 있다. 실제로, 본 발명자들은 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도의 표시를 제공하기 위해 하기에 추가로 기술된 바와 같이 이러한 염색 방법을 사용할 수 있음을 밝혀냈다.
상기에 언급된 바와 같이, 미생물학에서 많은 경우에 미생물, 특히 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 것이 바람직하다. 이는 분석을 정확하게 수행할 수 있도록 미생물을 특성규명하기 위해 상기 분석에 적합한 농도 또는 수의 미생물을 제공하게 하기 위해 또는 실제로 샘플이 특정 분석에 사용하기에 적합하도록 보장하기 위해 바람직할 수 있다. 특히, 이는 표준 배양물(또는 표준화된 배양물) 또는 배양물의 접종원의 제조를 포함할 수 있다. 이는 특히 항생제 감수성 검사(AST: antibiotic susceptibility test)에 대한 표준화된 접종원의 제조를 포함하는데, 이는 미생물 감염의 검출 및 확인에서 임상 목적을 위해 알려지거나 미리 결정된 농도 또는 표준 농도의 접종원을 필요로 한다. 그러나, 샘플에서 미생물의 농도를 결정하거나, 하기에 보다 상세하게 기재된 다른 분석을 위한 표준 배양물을 제공하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
생물학 및 의약에서의 수많은 과정은 샘플에서의 미생물(특히 생존 가능한 미생물)의 수의 정확한 결정 및 이 결정에 기초한 접종원의 제조를 필요로 한다. 이것은 예를 들어 수질 및 식품 품질 관리 분석, 환경 샘플에서의 미생물의 모니터링, 의료 장비 내의 또는 상의 또는 환자에서의 생체막 형성, 및 실험실 미생물 조사를 포함한다. 특히, 샘플에서의 생존 가능한 미생물 세포의 농도의 정확한 결정 및 이로부터의 원하는 농도의 미생물을 함유하는 접종원의 제조는 미생물 감염의 진단에 사용될 수 있다.
미생물 감염은 중요한 임상적 및 경제적 영향을 갖는 주요 부류의 인간 및 동물 질병을 나타낸다. 미생물 감염을 치료하고/하거나 예방하기 위해 다양한 부류 및 유형의 항균제를 사용할 수 있지만, 항균제 내성은 현대 의학에서 크게 증가하고 있는 문제이다. 따라서, 미생물 감염의 치료와 관련하여, 효과적인 치료를 보장할 뿐만 아니라 불필요하거나 비효과적인 항생제의 사용을 감소시켜 항생제 내성 또는 더 일반적으로 항균제 내성의 확산을 조절하는 것을 돕기 위해 감염 미생물의 성질 및 이의 항균제 감수성 프로필에 관한 정보를 갖는 것이 바람직하고 실제로도 중요할 수 있다. 이는 신속하고 효과적인 치료가 필요한 심각하거나 생명을 위협하는 감염의 경우에 특히 그러하다.
심각한 감염에 의해 야기되는 잠재적으로 치명적인 전신 염증인 패혈증은 가장 돈이 많이 드는 질환이며 미국에서 총 국가 병원 비용의 5%를 차지하는 병원 비용의 원인이다. 중증 패혈증의 경우 제대로 치료하지 않으면 사망률이 매시간 7% 증가하고, 패혈증을 야기하는 항균제 내성 균주의 출현이 증가하면 패혈증에 대한 올바른 치료를 예측하기가 점점 어려워진다. 패혈증 또는 다른 감염을 야기하는 미생물을 진단하기 위한 현재의 황금기준(gold standard)은 감염 미생물의 순수한 배양물의 단리 및 배양을 요구하는 표현형적 및 생화학적 확인 기법에 기초한다. 감염을 확인하고 1종 이상의 항생제에 내성일 수 있는 미생물의 감수성 프로파일을 결정하기 위해 미생물 식별(ID: microbial identification) 및 항생제 감수성 검사(AST)를 수행하는 데 며칠이 걸릴 수 있다. AST 분석은 미생물에서 시험된 각각의 항균제에 대해 '최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration)' 또는 'MIC' 값을 제공하고, 따라서 미생물에 어떤 항균제가 효과적일 수 있는지의 정보를 제공할 수 있다. 이러한 정보가 더 빨리 제공될수록 더 좋을 수 있고, 그러므로 빠른 AST 방법이 바람직하며 개발되고 있다.
대체로 말해서, 임상 분야에서 AST 결정에 대해 얻은 결과는 다른 방법 및/또는 다른 임상 실험실에서 비교되어야 한다. 이를 위해 AST 시험에 대한 규정되고 승인된 조건을 사용하는 것이 관례이다. 이는 규정된 배지(예를 들어, 뮬러-힌턴(MH: Muller-Hinton) 배지) 및 배양 조건의 사용을 수반할 수 있다. 특히, 배양물에서의 박테리아의 수 또는 양이 설정된 값에 있도록 표준화된 미생물 역가(즉, 미생물 세포의 표준화된 수 또는 양(또는 표준 수 또는 양)(예를 들어, 농도))을 사용하여 AST 시험에서 수행되는(즉, 성장에 대해 모니터링되는) 배양을 설정하는 것이 또한 관습적이다. 예를 들어, 종래에 미생물 현탁액(특히 박테리아 현탁액)의 탁도를 조정하는 기준으로 McFarland 표준이 사용되어 AST 시험을 표준화하기 위해 배양을 설정하도록 사용된 배양 조제물에서 미생물의 수가 주어진 범위 내에 있을 것이다. 기준 현탁액의 탁도에 기초하여 McFarland 표준을 설정하고, 선택된 McFarland 표준의 탁도에 맞도록 미생물 현탁액을 농도(또는 박테리아 수) 조정한다.
종래에 (예를 들어, 항균제의 MIC를 결정하기 위한 EUCAST 표준 방법에 대해 기술된 바와 같이(유럽 임상 미생물 및 감염 질환 협회(ESCMID: European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases)의 유럽 항균제 감수성 시험 위원회(EUCAST: European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing)(2003)의 문헌[Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by broth dilution. Clinical Microbiology and Infection, 9: ix-xv.]), (예를 들어, 임상 샘플 배양으로부터의) AST에 대해 시험되는 미생물 세포를 플레이팅하고 항온처리하여 단리된 콜로니를 얻는다. 이어서 콜로니를 수집하여 AST 분석에 사용하기 위한 접종원으로서 사용하기 위한 미생물 세포 현탁액을 제조하는 데 사용할 수 있다. 일반적으로, 상기에 기술된 가이드라인에 기술된 바와 같이, 이렇게 제조된 현탁액 중의 미생물 농도는 표준 수준 및 미리 규정된 수준, 예를 들어 0.5 McFarland 단위로 설정되어 표준 농도의 미생물이 AST 분석에 사용되게 한다. 사용 전에 0.5 McFarland로 미생물 현탁액의 탁도를 조정할 수 있다. 대안적으로, 접종원을 제공하기 위해 배양될 수 있는 배양 배지를 접종하기 위해 단리된 개별 콜로니를 사용할 수 있다. 배양물을 접종원으로 사용하기 전에, 배양물을 원하는(0.5 McFarland) 표준으로 성장하게 할 수 있고/있거나, 필요한 경우에는, 이 표준으로 조정할 수 있다. 따라서, AST 전에 박테리아의 농도를 정규화하기 전에, 미생물 배양물은 일반적으로 성장이 0.5 McFarland 표준의 탁도이거나 이보다 높은 탁도에 도달할 때까지 성장이 가능하게 된다. 필요한 경우, 탁도가 0.5 McFarland 표준과 동등한 배양물을 생성하도록 배양을 조정할 수 있다. 이어서 AST 분석을 설정하도록 사용되는 접종원으로 이것을 사용할 수 있다. 이 시점에서 얻은 접종원(즉, 대략 0.5 McFarland 단위의 배양물 또는 현탁액)을 브로스에 희석하여 배양에 사용되는 원하는 표준화된 최종 세포 수 농도를 생성한다. 참고로, 0.5 McFarland 단위의 미생물 배양물/현탁액은 대략 1 x 108 CFU/ml의 미생물 농도를 포함한다. 이러한 미생물 배양물/현탁액은 일반적으로 AST 배양을 설정할 때 약 200의 인수로 브로스에 희석될 것이고, 즉 각각의 AST 배양 조건은 일반적으로 대략 5 x 105 CFU/ml의 출발 미생물 농도를 포함할 것이다.
패혈증과 같은 소정의 미생물 감염의 경우에, 일반적으로 혈액 배양 플라스크에 혈액 샘플을 수집하고, 배양 모니터링 시스템에서 양성 배양 결과가 얻어질 때까지 미생물 배양물(즉, 임상 샘플 배양물)은 성장이 가능하게 된다. 예를 들어 Bactec 또는 Bact/Alert 시스템과 같은 자동 배양 검출 시스템에서 양성으로 표시될 필요가 있는 박테리아의 농도는 (식염수 용액에서 측정되는 경우) 0.5 내지 3.5 McFarland 단위에 대응하는 108 내지 109 CFU/ml이다. (눈으로 또는 탁도 측정에 의해) 쉽게 검출 가능한 가장 낮은 McFarland 값은 대략 0.5 McFarland 단위이다.
일반적으로 양성 배양 결과가 얻어지면 이러한 임상 샘플 배양을 사용하여 ID 시험 및 AST 결정을 수행할 수 있다. AST 시험의 경우, 추가 배양물을 AST 시험 배양을 위한 접종원으로 사용하거나 이를 제조하기 위해 임상 샘플 배양물(예를 들어, 양성 배양물)로부터 이것을 제조하고, AST 시험 배양물을 접종하도록 이 접종원을 사용하기 전에 이것을 미리 설정된 미생물 농도 또는 McFarland 값(전형적으로 0.5 McFarland 단위)으로 표준화하는 것이 일반적이다. 따라서, 일반적으로 0.5 McFarland 단위인 배양물 또는 미생물 현탁액을 사용하거나 이로부터 출발하여 AST에 대한 접종원을 제조한다. 당업계의 방법에서 상기에 기술된 바와 같은 임상 샘플 배양물 또는 이 배양물로부터 단리된 미생물을 플레이팅하여 얻은 콜로니를 선택하여 일반적으로 제조를 수행한다.
샘플에서 미생물의 농도를 결정하기 위해 McFarland 표준과의 비교를 요하는 기법은 농도에 대한 근사치만 제공하고, 샘플에서의 생존 가능한 미생물 세포의 농도에 대한 정보는 구체적으로 제공하지 못한다. 더욱이, 이러한 기법은 농도를 측정하기 위해 샘플에서의 미생물의 농도가 비교적 높을 것(예를 들어, 0.5 McFarland 단위)을 필요로 한다.
따라서, AST 분석의 설정과 관련하여 샘플에서 미생물의 농도가 결정되는 속도 및 감도를 개선할 필요가 특별히 있다. 특히, 유세포 분석법을 포함하는 방법과 같은 복잡한 기기장치를 필요로 하지 않고 신속하고 정확하며 민감한 미생물 농도 결정이 수행되게 하는 강력하고 간단한 방법이 필요하다. 본 발명은 미생물 접종원의 제조에 사용될 수 있고, 더 나아가 AST 분석을 수행하기 위한 개선된 작업 흐름을 제공하며, 샘플 내의 미생물의 농도 및 보다 중요하게는 샘플 내의 온전한 미생물 또는 생존 가능한 미생물의 농도가 정확하고 신속하게 결정되게 하는, 미생물의 농도를 결정하기 위한 개선된 방법을 제공하여 이 필요성을 해결한다. 특히, 본 발명의 농도 결정 방법은 신속한 AST 분석이 수행되게 하는 데 있어서 가치가 있다. 따라서, 본 발명은 샘플에서의 미생물의 농도 및 보다 중요하게는 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한 신속하고 정확하며 정밀한 방법을 제공하고자 하는 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, 온전한 미생물의 농도를 생존 가능한 미생물의 신뢰할 수 있는 지표로 사용할 수 있고, 일 실시형태에서 본 발명의 방법은 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법은, 샘플에서의 미생물을 직접 계수하거나 미리 결정된 표준과 관련하여 탁도계로 미생물의 농도를 추정하거나 배양된 콜로니를 계수함으로써 존재하는 생존 가능한 미생물의 수를 계수하기보다는, 샘플에서의 온전한 미생물에 대응하는 객체(object)의 수에 대한 값을 결정하기 위해 (생세포/사세포 염색 원리에 기초한) 온전한 미생물의 염색과, 샘플 또는 희석된 샘플 분취액의 영상화에 기초한다. 미리 결정된 표준 곡선을 사용함으로써, 샘플에 존재하는 미생물의 농도와 영상화에 의해 검출된 객체의 수에 대해 결정된 값을 상관시킬 수 있다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은,
a. 미생물을 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
b. 선택적으로, 희석 값으로 희석된 분취액을 제공하도록 상기 샘플의 분취액을 희석하는 단계;
c. 샘플-염색제 혼합물을 제공하도록 단계 (a)의 샘플의 분취액의 적어도 일부 또는 희석 단계 (b) 동안의 또는 후의 샘플의 희석된 분취액의 적어도 일부를 DNA에 결합할 수 있는 제1 염색제(stain) 및 제2 염색제와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 제2 염색제는 공여체 분자(donor molecule)로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자(acceptor molecule)로서 작용할 수 있는 것인, 단계;
d. 제1 방출 파장에서 단계 (c)의 분취액-염색제 혼합물을 영상화하고, 영상화된 혼합물에서 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하는 단계; 및
e. 상기 분취액에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 상기 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함한다.
단계 (c)에서의 영상화에 의해 검출된 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교함으로써, 샘플 내의 온전한 미생물의 수의 보다 정확한 측정치를 얻을 수 있다. 이러한 방법은 샘플에서 생존 가능한 세포의 농도의 결정에 악영향을 줄 수 있는 상기에 기재된 인자가 고려되게 하여(즉, 어떤 이러한 결정에 '감안'되게 하여) 미생물 생존력을 보다 정확하게 측정하게 한다. 따라서, 온전한 미생물 세포의 농도는 상기에 기재된 바와 같이 생존 가능한 미생물 세포의 농도를 나타내거나, 이를 표시하거나 이에 대응하거나, 또는 이를 근사치화하도록 취해질 있다. 구체적으로, 단계 (c)에서 영상화된 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교함으로써, 샘플에 존재하는 온전한 미생물 및 보다 특히 생존 가능한 미생물의 농도를 계산하여 샘플에서 온전한 미생물 또는 생존 가능한 미생물의 농도가 보다 정확하게 결정되게 하도록 시도할 때 상기에 기재된 생존 가능한 미생물 세포와 생존 불가능한 미생물 세포의 부정확한 염색과 같은 인자들이 고려될 수 있다.
본 발명은 샘플에서 미생물의 농도를 결정하기 위한 신속하고 민감한 방법을 제공한다. 이는 다수의 유용성을 가질 수 있고, 다수의 상황에서 미생물 농도의 결정을 위한 강력하고 간단한 방법을 갖는 것이 유리할 수 있다. 본 방법은 필요할 경우에 정확하게 상세하게 또는 절대 농도로서 농도를 결정하는 것뿐만 아니라 샘플에서의 미생물 부하의 표시를 제공하는 데에도 유용할 수 있고, 그러므로 얼마나 많은 미생물 세포가 존재하는지 알거나 추정하거나, 또는 이에 대한 발상을 갖는 것이 원해지는 임의의 방법 또는 상황에서 사용될 수 있다. 따라서 이 방법이 사용될 수 있는 상황은 제한되지는 않는다. 실제로, 이 방법의 낮은 검출 한계를 고려할 때, 샘플이 미생물을 함유하는지 또는 아닌지를 결정하는 데 이 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 샘플에서 미생물의 존재를 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (a) 내지 단계 (e)를 수행하는 단계 및 미생물이 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 방법은 미생물 농도를 평가하거나 결정하는 것이 바람직할 수 있는 상이한 샘플과 관련하여 유용성을 가질 수 있다. 이는 하기에 추가로 기재된 바와 같은 임상 샘플 또는 미생물이 존재할 수 있는 임의의 샘플(식품, 환경 샘플 등)일 수 있다. 따라서, 추가 시험이 수행되게 하도록 충분하거나 적절한 농도의 세포가 샘플에 존재하는지를 결정하기 위해 본 방법을 사용할 수 있다. 이는 AST 분석과 관련하여 하기에 추가로 기술되지만, 샘플에서의 미생물의 후속 분석의 임의의 단계 전에 예비 단계로 본 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 질량 분광법 시험 및/또는 핵산 기반 시험 및/또는 미생물의 임의의 다른 평가, 예를 들어 성장 기반 연구를 수행하기 전에 샘플에서 온전한 미생물(또는 생존 가능한 미생물)의 농도를 결정하거나 평가하기 위해 본 방법을 사용할 수 있다.
샘플에서 온전한 미생물(또는 생존 가능한 미생물)의 농도가 결정되면, 알려지거나 원하는 수 또는 농도의 미생물을 함유하는 접종원을 정확하게 제조하기 위해 이 정보를 유리하게 사용할 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 미생물 접종원(또는 대안적으로 미생물 배양물의 제조에 사용되는 접종원으로 표현됨)을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에 정의된 바와 같은 농도 결정 방법을 사용하여 미생물 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 단계 및 이어서 적어도 샘플의 분취액 또는 샘플의 일부에서 미생물 세포의 농도를 원하는 농도로 조정하여 원하는 농도의 미생물을 포함하는 접종원을 제공하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 샘플에서 미생물의 농도가 결정되면 샘플에서 미생물을 특성규명하는 방법을 제공한다. 따라서, 미생물을 특성규명하기 위한 분석과 함께 본 발명의 농도 결정 방법을 사용할 수 있다. 특히, 이는 알려지거나 미리 결정된 농도 또는 수의 미생물을 필요로 하는 분석일 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 샘플에서 미생물을 특성규명하는 방법을 제공하는데, 이 방법은,
(i) 미생물을 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 상기 샘플에서 온전한 미생물 세포의 농도를 결정하도록 상기 샘플에서 상기에 정의되고 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (b) 내지 단계 (e)를 수행하는 단계;
(iii) 상기 샘플에서 미생물 세포의 농도를, 필요한 경우, 원하거나 미리 결정된 농도로 조정하는 단계; 및
(iv) 샘플에서 미생물을 특성규명하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명은 상기 미생물을 특성규명하기 위해 분석을 수행하기 전에, 특히 특정 농도 또는 수의 미생물을 필요로 하는 분석을 수행하기 전에 샘플에서 미생물의 농도가 결정되게 할 수 있다. 따라서, 이는 샘플이 주어진 분석에 사용하기에 적합한지가 결정되게 하고, 그렇지 않으면 미생물의 농도가 적절하게 조정되게 한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 샘플에서 미생물의 항균제 감수성을 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은,
(i) 미생물을 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 상기 샘플에서 생존 가능한 미생물 세포의 농도를 결정하도록 상기 샘플에서 상기에 정의되고 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (b) 내지 단계 (e)를 수행하는 단계;
(iii) 단계 (i)에서의 샘플을 사용하여 항생제 감수성 검사(AST)를 위한 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하는 단계이되, 일련의 시험 미생물 배양물은 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함하고, 상이한 성장 조건은 1종 이상의 상이한 항균제를 포함하고, 각각의 항균제는 2 이상의 상이한 농도에서 시험되는 것인 단계; 및
(iv) 각각의 성장 조건에서 미생물 성장의 정도를 평가하는 단계를 포함하고;
상기 샘플 또는 상기 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도는 필요한 경우 원하거나 미리 결정된 농도로 조정되고;
각각의 성장 조건에서의 미생물 성장의 정도는 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 MIC 값을 결정하여 상기 샘플에서 상기 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위해 사용된다.
따라서, 본 발명은 (예를 들어, 샘플의 탁도를 McFarland 표준과 간단히 비교함으로써) 샘플의 탁도를 측정하는 것보다 높은 정확도로 미생물의 농도가 결정되게 하므로 AST 분석을 수행하기 위한 보다 정확한 방법을 제공한다.
상기에 기술된 바와 같이, EUCAST 가이드라인에 따라 수행된 표준 AST 분석은 AST 분석의 설정의 다음 단계에서 미생물을 사용하도록 미생물이 충분히 성장할 시간을 일반적으로 필요로 한다. 예를 들어, 상기에 개괄된 프로토콜에서, 임상 샘플 배양이 '양성'으로 생각되는 지점(즉, 이것이 적어도 0.5 McFarland 단위에 도달하는 지점)으로 임상 샘플 배양물에서의 미생물의 농도가 증가하게 하도록 항온처리 기간이 필요하다. 개별 콜로니가 성장하게 하도록 임상 샘플 배양물의 플레이팅 후에 추가의 항온처리 단계가 필요하고, 선택적으로, AST 분석이 준비될 수 있기 전에 상기에 개괄된 바와 같이 제조된 미생물 현탁액이 0.5 McFarland 단위에 도달하게 하도록 부가적인 추가 항온처리 단계가 필요하다.
더욱이, AST 분석을 준비하기 위해 상기에 개괄된 프로토콜에서, 접종원을 제조하도록 일반적으로 (임상 샘플 배양물에 존재하는 총 미생물 수에 대한) 오직 하나의 콜로니 또는 적은 수의 콜로니를 사용하는데, 이 접종원은 결국 AST 분석을 설정하도록 사용된다. 따라서, 이러한 프로토콜은 감염을 유발하는 미생물을 대표하는 사용된 콜로니 또는 콜로니들에 따라 달라진다. 그렇지 않은 경우, AST 분석의 결과는 감염을 유발하는 미생물의 항균제 감수성을 정확히 반영하지 않을 수 있고, 이 결과에 기초한 임의의 임상 중재는 감염을 적절하게 치료하지 못할 수 있다.
하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 다른 샘플로부터 회수된 미생물을 함유하는 샘플에 존재하는 미생물의 농도를 결정하기 위해 본 발명의 농도 결정 방법을 사용할 수 있다. 샘플에서 미생물을 특성규명하는 데 필요한 시간을 유의미하게 줄이도록 이를 수행할 수 있다. 특히, AST 분석을 수행하는데 필요한 시간을 상당히 줄이고, 이로부터 얻은 결과의 신뢰성을 개선하기 위해 이러한 방식으로 본 발명의 농도 결정 방법을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명은 샘플로부터 직접 회수된 미생물의 샘플을 사용하여, 즉 회수된 미생물 샘플을 사용하여 AST 분석이 설정되게 한다.
따라서, 본 발명은 샘플에서 미생물을 특성규명하는 방법을 제공하는데, 이 방법은,
(i) 상기 샘플로부터 미생물을 회수하여 회수된 미생물 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 회수된 미생물 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하도록 상기에 정의되고 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (b) 내지 단계 (e)를 수행하는 단계;
(iii) 상기 회수된 미생물 샘플에서 미생물 세포의 농도를, 필요한 경우, 원하거나 미리 결정된 농도로 조정하는 단계; 및
(iv) 회수된 미생물 샘플에서 미생물을 특성규명하는 단계를 포함한다.
특히, 본 발명은 샘플에서 미생물의 항균제 감수성을 결정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은,
i) 샘플로부터 미생물을 회수하여 회수된 미생물 샘플을 제공하는 단계;
ii) 회수된 미생물 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하도록 상기에 정의되고 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (b) 내지 단계 (e)를 수행하는 단계;
iii) 단계 (i)에서의 회수된 미생물 샘플을 사용하여 항균제 감수성 시험(AST)을 위한 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하는 단계이되, 일련의 시험 미생물 배양물은 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함하고, 상이한 성장 조건은 1종 이상의 상이한 항균제를 포함하고, 각각의 항균제는 2 이상의 상이한 농도에서 시험되는 것인 단계; 및
iv) 각각의 성장 조건에서 미생물 성장의 정도를 평가하는 단계를 포함하고;
상기 회수된 미생물 샘플 또는 상기 시험 미생물 배양물 내의 미생물의 농도는 필요한 경우 원하거나 미리 결정된 농도로 조정되고;
각각의 성장 조건에서의 미생물 성장의 정도는 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 MIC 값을 결정하여 상기 샘플에서 상기 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위해 사용된다.
미생물이 회수되는 샘플은 미생물의 순수한 배양물 또는 현탁액을 포함하는 미생물을 함유하는 임의의 샘플, 및 하기에 추가로 기재된 바와 같이 미생물 감염, 오염 또는 콜로니화를 시험하는 것이 원해질 수 있는 임상적 샘플 또는 생물학적 샘플 또는 식품, 물 또는 환경적 샘플 또는 임의의 다른 샘플 및 특히 이러한 샘플들의 배양물(특히 임상 샘플의 배양물)일 수 있다. 따라서, 회수 단계에서 샘플로부터 미생물을 단리시킬 수 있다(또는 분리하거나 정제할 수 있다). 샘플에 존재하는 다른(비미생물성) 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 및/또는 다른 물질로부터 미생물 세포를 선택적으로 단리하는 방법이 하기에 기술되어 있다.
일반적으로, 샘플로부터 미생물 세포를 회수하는 방법은 임상 샘플에서 세포 잔해, 예를 들어 비미생물성 세포의 선택적 용해에서 용해된 비미생물성 세포의 잔여물을 형성시킨다. 유리하게는, 본 발명의 방법은 온전한 미생물(또는 생존 가능한 미생물)이 확인되고 보다 중요하게는 샘플로부터 미생물 세포를 회수한 후 샘플에 존재할 수 있는 비미생물성 세포 잔해(및 실제로는 비온전한 미생물 세포 또는 생존 불능 미생물 세포)와 구별되게 한다. 따라서, 샘플로부터 회수된 온전한 미생물의 농도를 신속하고 정확하게 결정할 수 있다.
따라서, 샘플로부터 회수된 미생물을 특성규명하게 하도록 후속 분석에 이 미생물을 사용할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, AST 분석에서 시험 미생물 배양물을 접종하기 위해 샘플로부터 회수된 미생물을 이와 같이 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 각각의 시험 미생물 배양물을 접종하기 위해 사용되는 접종원을 제조할 때 적어도 하나의 항온처리 단계를 생략할 수 있을 뿐만 아니라(이로써 AST 분석이 설정되기 전에 걸리는 시간을 감소시킴), 상기 접종원은 원래의 임상 샘플 배양물에 존재하는 미생물, 즉 대상체에서 감염을 유발하는 미생물의 보다 완전한 샘플(즉, 보다 대표적인 샘플)을 함유할 것이다. 따라서, 본 발명은 샘플에서 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위한 보다 신속하고 보다 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다.
그러나, 보다 광범위하게는, 본 발명은 상기 미생물을 특성규명하기 위해 적합한 농도 또는 수의 미생물 세포가 정성적 분석 또는 정량적 분석에 사용되게 하도록 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 신속하고 정확하게 결정하는 방법을 제공한다. 달리 말하면, 특성규명 방법에 적합한 농도 또는 수의 미생물 세포가 제공되게 하도록 미생물을 특성규명하기 위한 임의의 바람직한 방법 전에 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정할 수 있다. 따라서, 이는 이러한 분석을 사용하여 미생물의 특성규명이 가능하게 한다.
샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 것이 특히 유리할 수 있는 분석은 예를 들어 질량 분광법(MALDI-TOF, ESI-MS 및 CyTOF 포함), 라만 분광법, 핵산 기반 시험(미생물 및/또는 미생물에서의 항균제 내성의 마커를 확인하는 데 특히 유용할 수 있는 PCR, 회전 환 증폭(RCA: rolling circle amplification), 리가제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence based amplification) 포함)을 포함한다. 본원에서 다른 곳에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, AST 분석을 수행하기 전에 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 것이 특히 유리할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "미생물 세포" 및 "미생물"이라는 용어는 상호 교환 가능하고 동등한 의미, 즉 미시적인 유기체라는 의미를 갖는 것으로 간주된다. 상기 용어는 단세포이든 또는 아니든 모든 범주의 미생물을 포함하도록 본원에서 광범위하게 사용되고, 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 고세균(archaea) 및 마이코박테리아(mycobacteria), 진균, 원생동물을 포함한 원생생물 및 조류를 포함하는 박테리아를 포함한다. 미생물의 정체는 본 방법이 수행될 때 알려지거나 알려지지 않을 수 있다. 추가로, 샘플은 하나의 유형 또는 종의 미생물 또는 하나 초과의 유형 또는 종을 함유할 수 있고, 즉 샘플은 단일 미생물일 수 있거나 미생물의 혼합물을 함유할 수 있다.
더욱이, "세포 투과성" 염색제 및 "세포 불투과성" 염색제의 언급은 미생물 세포와 관련하여 이루어진다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 방법에 사용된 제1 염색제 및 제2 염색제의 투과성은 상기 염색제에 대한 미생물의 투과성이다.
본 발명과 관련하여 "생존 가능"이라는 용어는 성장하고/하거나 번식할 수 있는 미생물을 지칭한다. 바꾸어 발하면, 본 발명은 (예를 들어, AST 분석에서) 성장할 수 있는 샘플에서 미생물의 농도가 결정되게 한다. "생존력"이라는 용어는 미생물 세포가 성장하고/하거나 번식하는 능력을 지칭한다. 차등 염색에 의해 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정함으로써 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 간접적으로 결정한다. 따라서, 샘플 내의 온전한 세포의 농도로부터 생존 가능한 미생물의 농도를 도출하고, 본 발명의 방법은 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도에 대한 정확하고 신속한 방식을 제공한다. 보다 구체적으로, 생존 가능한 미생물을 함유하는 샘플을 단계 (a)에 사용할 때, 본 발명에 따른 온전한 미생물의 농도의 결정은 생존 가능한 미생물의 농도를 반영하거나 이의 표시를 제공한다.
생존 가능한 미생물의 농도는 온전한 미생물의 농도에 비례할 수 있고, 특정 농도의 온전한 미생물이 특정 농도의 생존 가능한 미생물과 어떻게 상관되는지에 대한 지식에 기초하여 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정할 수 있다. 이러한 관계는 샘플 및/또는 미생물의 성질 및/또는 샘플로부터 미생물을 회수하기 위한 임의의 단계와 같은 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이 미리 결정된 보정 곡선의 작성과 유사한 방식으로 간단하게 이 관계를 결정할 수 있는데, 즉 알려진 샘플, 즉 대안적인 방법 미생물에 의해 미생물의 농도가 결정되거나 결정된 샘플에서 온전한 세포의 농도와 생존 가능한 세포의 농도 사이의 관계를 결정함으로써 이 관계를 결정할 수 있다. 대표적인 예로서, 이는 알려진 농도의 온전한 미생물(및 이에 따라 알려진 수의 온전한 미생물)을 함유하는 샘플을 플레이팅하는 것 및 이로부터 형성된 발생한 콜로니 수(즉, 콜로니 형성 단위의 수)를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 온전한 미생물의 농도와 생존 가능한 미생물의 농도 사이의 관계를 결정하는 것은 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도가 본 발명의 방법에서 결정되게 할 수 있다.
하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 다양한 가능한 미생물을 함유하는 다양한 샘플을 분석할 수 있다. 따라서, 이용 가능한 샘플은 광범위한 가능한 상이한 농도의 미생물을 함유할 수 있고, 이러한 범위의 농도가 정확하게 결정되게 하도록 단일 보정 곡선 또는 보정 곡선들을 작성하는 것이 불가능할 수 있다. 따라서, 단계 (d)에서 결정된 객체의 수에 대한 영상 분석 값이 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내에 있도록 본 발명의 방법을 수행하는 과정 동안에 미생물을 함유하는 샘플 분취액을 희석하는 것이 유리할 수 있다.
추가로, 샘플의 성질에 따라, 농도 결정이 수행되게 하도록 샘플을 희석하는 것이, 예를 들어 농도 결정 방법을 방해할 수 있는 오염물질 또는 성분을 희석하는 것(또는 이의 양을 최소화하거나 감소시키는 것)이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 배지(예를 들어, 뮬러 힌턴 배지)는 형광 결정을 방해할 수 있는 성분을 함유하고, 샘플이 그러한 배지를 함유하는 배양 샘플이거나, 회수된 미생물이 그러한 배지에 재현탁되는 경우에, 희석 단계가 바람직할 수 있다.
희석 값으로 희석된 분취액을 제공하기 위해 희석할 때, 즉 단계 (b)에서 샘플 분취액을 희석할 때, 접촉 단계 (c)는 희석 단계 (b) 동안에 또는 후에 발생한다. 따라서, 샘플 분취액을 제1 염색제 및 제2 염색제와 접촉시키기 전에 희석할 수 있다. 이러한 상황에서, 희석 매질은 완충액, 또는 식염수 또는 물 또는 다른 수용액 등일 수 있다. 그러나, 특정 실시형태에서, 희석 단계 (b)는 샘플 분취액을, 예를 들어 제1 염색제 및 제2 염색제를 함유하는 용액으로서 DNA에 결합할 수 있는 제1 염색제 및 제2 염색제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있고, 분취액을 제1 염색제 및 제2 염색제와 접촉시킴으로써 생긴 샘플 분취액의 발생한 체적 증가는 그러므로 희석 단계 또는 희석 단계의 적어도 일부에 고려될 수 있다. 더욱이, 샘플 분취액의 일부를 제1 염색제 및 제2 염색제와 접촉시키는 것은 상기 분취액이 (하기에 기술된) 추가 희석제와 접촉되기 전에 수행될 수 있어 희석된 샘플 분취액을 제공하고, 이러한 절차는 희석 단계 (b) 동안에 희석된 샘플 분취액을 제1 염색제 및 제2 염색제와 접촉시킨다는 것의 정의 내에 속한다고 간주될 수 있다.
각각의 분취액이 상이한 정도로 희석되도록 2개 이상의 분취액을 제조할 수 있다. 바꾸어 말하면, 상이한 희석 계수 또는 희석 값으로 각각의 분취액을 희석할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제1 분취액(즉, 제1 희석 값에서의 분취액)은 샘플 분취액일 수 있고, 제2 분취액(또는 후속 분취액)은 제2 희석 값(또는 후속 희석 값)에서의 희석된 분취액일 수 있다. 대안적으로, 2의 별개의 희석을 수행할 수 있다. 연속 희석에 의해 희석된 분취액 중 하나 이상을 희석할 수 있다. 따라서, 원하는 바대로 일련의 순차적 단계, 개별적 단계 또는 동시적 단계에 의해 희석 시리즈를 제조할 수 있다.
단계 (b) 및/또는 단계 (c) 동안에 그러나 단계 (d) 전에 순차적으로 희석액을 제조할 수 있고/있거나, 단계 (d) 및/또는 단계 (e) 동안에 또는 후에 순차적으로 희석액을 제조할 수 있다.
2개 이상의 분취액을 제조하는 본 발명의 특정 실시형태에서, 접촉 단계 (c) 전에 또는 동안에 동시에(또는 순차 단계 또는 연속 단계에 의한 것을 포함하여 실질적으로 동시에) 각각의 상기 분취액을 제조할 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 분취액에 단계 (d) 및 단계 (e)를 동시에 수행하거나 순차적으로 수행할 수 있다. 바꾸어 말하면, 각각의 분취액을 동시에(즉, 나란히) 영상화하거나 순차적으로 영상화할 수 있고, 각각의 분취액으로부터 얻은 각각의 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교할 수 있다. 제1 분취액에 단계 (d) 및 단계 (e)를 교대로 수행할 수 있고, 상기 분취액으로부터 얻은 영상 분석 값이 미리 결정된 표준 보정 곡선의 범위 내에 있으면, 단계 (d) 및 단계 (e)는 제2 분취액 또는 추가 분취액이 없을 수 있다.
그러나, 대안적인 실시형태에서, 제1 분취액(샘플 분취액 또는 희석된 분취액일 수 있음)에서 본 방법의 단계를 수행하면 오직 희석된 분취액(또는 제2 희석된 분취액 또는 추가 희석된 분취액)을 제조할 수 있다. 이러한 실시형태는 예를 들어 영상 분석 값이 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내에 있지 않는 경우 바람직할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상이한 희석 값으로 제2 분취액(또는 추가 분취액)에서 본 발명의 방법을 반복하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 경우에, 2개의 분취액(또는 추가 분취액)의 각각이 순차적으로 제조됨을, 즉 예를 들어 제1 분취액에 단계 (d) 및/또는 단계 (e)가 수행된 후에 제조됨을 알 수 있다.
따라서, 하나 초과의 분취액을 제조하는 경우에도 단계 (d) 및/또는 단계 (e)를 하나의 분취액(희석된 분취액 또는 비희석된 분취액일 수 있음)에 수행하거나, 2개 이상의 분취액(희석된 분취액일 수 있거나, 비희석된 분취액을 포함할 수 있음)에 수행할 수 있다.
따라서, 2개 이상의 분취액의 각각의 분취액에 단계 (c) 및 단계 (d)를 수행하여 각각의 분취액에서 생존 가능한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정할 수 있다. 2개 이상의 분취액의 각각에 대해 2개 이상의 영상 분석 값을 얻은 경우, 단계 (e)는 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내에 영상 분석 값을 포함하는 분취액을 확인하는 것 및 상기 분취액에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 상기 샘플 내의 미생물의 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 분취액에 단계 (c) 및 단계 (d)를 순차적으로 수행하거나 동시에 수행할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 분취액은 희석된 분취액일 수 있거나, 비희석된 분취액을 포함할 수 있다.
희석은 샘플 분취액을 적절한 멸균 완충액 또는 수용액(예를 들어, 식염수 또는 염 용액) 또는 실제로 임의의 적합한 희석제의 체적과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 희석제는 제1 염색제 및/또는 제2 염색제 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 용액을 포함할 수 있다. 희석 시리즈에서 상이한 희석된 분취액을 제조하기 위해 상이한 희석제를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 염색제 비함유 희석제를 사용하여 하나 이상의 희석액을 제조할 수 있고, 염색제 함유 용액을 사용하여 추가 희석액을 제조할 수 있고(즉, 단계 (c) 동안에), 단계 (d)에 이 후자의 희석된 분취액을 사용할 수 있다. 따라서, 단순히 중간 희석된 분취액을 제조하기 위해 (단계 (b)에서) 염색제 비함유 희석제를 사용할 수 있고, 이어서 단계 (c)에서 본 방법의 후속 단계를 위해 이 중간 희석된 분취액을 더 희석한다. 대안적으로, 희석은 하나 이상의 염색제 함유 용액을 사용하여 단계 (c)에서 단독으로 발생할 수 있다.
특정 실시형태에서, 제1 염색제 및 제2 염색제를 샘플 분취액의 적어도 일부와 접촉하기 전에 예비 혼합할 수 있다. 그러나, 개별적이고 순차적인 접촉을 수행할 수 있고, 더욱이 임의의 순서로 이 접촉을 수행할 수 있음이 또한 고안된다(예를 들어, 분취액의 적어도 일부는 제1 염색제 또는 제2 염색제 중 어느 하나와 접촉하고, 이어서 남은 염색제와 접촉할 수 있음).
본 발명의 방법에 사용된 제1 염색제 및 제2 염색제는 각각 DNA에 결합할 수 있고, 이 방법을 사용하기에 이들이 적합하게 하는 특정 특성을 갖는 것이 각각 필요하다. 구체적으로, 제1 염색제는 형광 염색제이고, 온전한 미생물(예를 들어, 생존 가능한 미생물)의 (온전한) 막을 횡단하여 온전한 미생물 세포(예를 들어, 생존 가능한 미생물 세포) 내에 위치한 DNA에 결합할 수 있도록 세포 투과성일 필요가 있는 반면에, 제2 염색제는 세포 불투과성일 필요가 있다. 이러한 방식으로, 제1 염색제만이 온전한 미생물 세포에 들어갈 것으로 예상되는 것에 반해, 제2 염색제는 온전한 미생물 세포에 들어갈 수 없어 온전한 미생물 세포가 오직 제1 염색제로 염색되게 보장한다. 이와 대조적으로, 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두는 온전하지 않은 미생물 세포(즉, 세포막이 손상되거나 파괴된 미생물 세포)에 들어갈 수 있고, 그러므로 온전하지 않은 미생물 세포(예를 들어, 생존 불가능한 미생물 세포)를 온전한 세포(예를 들어, 생존 가능한 세포)와 구별할 수 있다.
제2 염색제에 의해 형광이 소멸되는 제1 형광 염색제의 사용을 통해 본 발명의 방법에서 온전한 미생물 세포와 온전하지 않은 미생물 세포 사이의 추가의 구별을 달성한다. 바꾸어 말하면, 제2 염색제는 푀르스터 공명 에너지 전달(FRET: Forster resonance energy transfer)(형광 공명 에너지 전달이라고도 함) 쌍에서 수용체 분자로서 작용할 수 있고, 제1 형광 염색제는 공여체 분자로서 작용한다. 바꾸어 말하면, 제1 염색제(형광 염색제)(즉, FRET 공여체)의 방출 스펙트럼이 제2 염색제(즉, FRET 수용체)의 흡수 스펙트럼과 적어도 부분적으로 중첩하도록 제1 염색제 및 제2 염색제를 선택한다.
이러한 방식으로, 제1 염색제로부터 생긴 임의의 신호의 적어도 일부가 FRET에 의해 제2 염색제에 의해 소멸될 것이므로, 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두로 염색된 임의의 세포는 제1 방출 파장에서 형광 신호 강도가 감소할 것이다. 이의 결과는 온전하지 않는 미생물 세포가 제2 형광 염색제로 다르게 염색될 뿐만 아니라 상기 세포가 제1 염색제의 방출 파장에서 형광도가 감소한다는 것이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 이는 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위해 제1 염색제만이 검출되게 할 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 온전한 미생물 세포와 온전하지 않은 미생물 세포 사이의 또 다른 구별은 제1 염색제 및 제2 염색제를 제공함으로써 가능하며, 여기서 제1 염색제는 제2 염색제보다 DNA 결합 친화도가 낮다. 이러한 방식으로, 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두에 의해 염색되는 임의의 (온전하지 않은) 세포에서, 제2 염색제는 세포 내에서 DNA로부터 제1 염색제를 쫓아낼 수 있을 것이어서, 제1 방출 파장에서의 상기 세포의 형광 강도를 더욱 약화시킬 것이다. 따라서, 제2 염색제는 DNA로부터 제1 염색제를 쫓아낼 수 있도록 제1 염색제보다 높은 DNA 결합 친화도를 갖는 것이 바람직하다.
DNA에 결합할 수 있는 특정 염색제는 또한 용액에 자유롭게 존재할 때와 비교하여 DNA에 결합할 때 형광이 향상되는 것으로 알려져 있다. 제1 형광 염색제 및/또는 제2 형광 염색제가 이 특성의 표시에 기초하여 선택되는 것이 바람직하다. 바꾸어 말하면, 바람직한 일 실시형태에서, 염색제가 DNA에 결합할 때 염색제의 형광 강도가 향상된다. 제1 형광 염색제의 형광 강도가 이러한 방식으로 향상되는 것이 특히 바람직하다. 이 특성을 갖는 제1 염색제(및 선택적으로 제2 염색제)의 선택은 제1 방출 파장(및 선택적으로 제2 방출 파장)에서 검출되는 동안 생성된 배경 신호의 수준을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. 특히, DNA에 결합하지 않을 때(즉, 용액 중에 유리되어 있을 때)에는 형광이 낮은 염색제를 선택할 수 있다. 예를 들어, 염색제는 용액 중에 유리된 경우에는 DNA에 결합할 때의 형광의 50% 미만, 또는 보다 바람직하게는 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만, 또는 보다 바람직하게는 형광의 10% 미만, 예를 들어 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만, 또는 형광의 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만을 나타낼 수 있다.
제1 염색제가 350 내지 700 nm의 파장에서 여기 파장 및 방출 파장을 갖는 것이 바람직하다. 이 범위 내에 방출 파장을 갖는 일련의 적합한 형광 염색제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 예시적인 형광 염색제는 하기에 기술되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 제1 형광 염색제는 녹색 형광 염색제, 즉 파장이 510 nm인 광에서 또는 그 주변에서 피크 형광 방출 강도를 갖는 것이다.
상기에 기술된 모든 바람직한 특성을 갖는 특히 바람직한 제1 염색제는 SYTO 녹색 형광 핵산 염색제(Molecular Probes)를 포함한다. SYTO 염색제는 비대칭 시아닌 염료의 예이고, 따라서 바람직하게는 본 발명의 방법에서 제1 염색제로 비대칭 시아닌 염료를 사용할 수 있다. 이용 가능한 SYTO 염료의 구조는 미국 특허 제5658751호, 미국 특허 제6291203호, 미국 특허 제5863753호, 미국 특허 제5534416호 및 미국 특허 제5658751호에 제공되어 있다. SYTO9, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 16, SYTO 21 및 SYTO 24를 포함하여 다수의 상이한 SYTO 염색제가 이용 가능하며, 이는 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. SYTO9 및/또는 SYTO13, 또는 염료의 혼합물인 SYTO BC가 특히 바람직하다. SYTO BC 염색제 혼합물은 473 내지 491 nm의 여기 파장 및 502 내지 561 nm의 방출 파장을 갖는다.
제2 염색제는 바람직하게는 350 내지 700 nm의 파장에서 흡광 파장을 가질 수 있다. 제2 염색제가 형광 염색제인 경우, 제2 염색제의 여기 파장은 이 범위 내에 있을 수 있다. 그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 제2 염색제의 흡광 스펙트럼은 제1 염색제의 방출 스펙트럼과 적어도 부분적으로 중첩할 것이 요구되고, 이에 따라 제2 염색제의 여기 파장은 제1 염색제의 방출 파장에 근접할 것이다.
제2 염색제는 특정 실시형태에서 또한 형광 염색제일 수 있다. 바꾸어 말하면, 특정 실시형태에서, 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두는 형광 염색제일 수 있고, 본 발명의 방법의 단계 (a)는 샘플 분취액의 적어도 일부를 제1 형광 염색제 및 제2 형광 염색제와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 제2 염색제가 형광 염색제일 때, 제2 염색제의 방출 파장은 또한 350 내지 700 nm의 파장에 있다.
제1 염색제 및 제2 염색제가 형광 염색제인 경우, 각각의 염색제가 구별되고 개별적으로 검출되게 하도록, 각각의 염색제는 상이한 방출 파장을 가질 것이다. 따라서, 제1 방출 파장 및 제2 방출 파장은 상이하다. 일반적으로, 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두가 형광 염색제인 경우, 각각의 염색제가 상기에 기술된 바대로 FRET 공여체/수용체로서 작용할 수 있다는 사실로 인해 제2 염색제의 방출 파장은 제1 염색제보다 긴 광 파장에 있을 것이다.
바람직한 일 실시형태에서, 제2 형광 염색제는 적색 형광 염색제, 즉 파장이 650 nm인 광에서 또는 그 주변에서 피크 형광 방출 강도를 갖는 것이다. 제2 형광 염색제로서 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 바람직한 적색 형광 염색제는 프로피디움 요오다이드(PI)이다.
생존 불능 미생물 세포로부터 생존 가능한 미생물 세포를 구별하는 데에 있어서 놀랍게도 효과적인 것으로 밝혀진 형광 염색제의 바람직한 조합은 제2 형광 염색제로서의 PI와 함께 제1 형광 염색제로서의 SYTO 염색제, 예를 들어 SYTO 9 또는 BC를 포함한다.
그러나, 특정 실시형태에서, 제2 염색제는 비형광 염색제, 즉 특정 파장에서의 광에 의한 여기에 응답하여 광을 방출하지 않는 염색제일 수 있다. dabcyl 및 QSY 염료와 같은 비형광 수용체는 예를 들어 특히 온전하지 않은 세포 내에서 직접적인 수용체 여기로부터 생긴 배경 형광의 잠재적 문제를 제거하는 이점을 갖는다.
분취액은 분취액 안에 있는 미생물에 해롭지 않은 온도에서 염색제와 접촉할 수 있고, 이는 염색제가 온전한 미생물 및 온전하지 않은 미생물에 적절하게 침투하게 하여 염색이 발생하게 한다. 예를 들어 샘플의 성질 또는 샘플 안에 있는 미생물의 정체에 기초하여 적합한 온도를 선택할 수 있다. 그러나, 샘플에서의 미생물의 손상을 피하기 위해 일반적으로 37℃ 이하의 온도를 사용한다. 따라서, 35℃, 30℃ 또는 25℃ 이하의 온도를 사용할 수 있다. 4℃ 이상의 온도, 예를 들어 5℃, 10℃ 또는 15℃ 이상의 온도를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 바람직한 일 실시형태에서, 샘플은 20℃ 내지 30℃에서, 더 구체적으로는 20℃ 내지 25℃에서 염색제와 접촉한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 샘플은 실온에서 염색제와 접촉할 수 있다.
선택적으로, 예를 들어 염색 과정을 개선하기 위해, 예를 들어 염색 전에 미생물을 불활화하거나 변형시키도록 분취액을 접촉 단계 (c) 전에 처리하거나(즉, 전처리하거나), 접촉 단계 (c) 동안에 처리할 수 있다. 이러한 처리 단계는 접촉 단계 (c) 전에 또는 동안에 분취액을 알코올, 예를 들어 에탄올과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 단계 (b)에서 분취액을 희석하기 전에, 희석함과 동시에 또는 희석한 후에 발생할 수 있고/있거나, 분취액을 알코올과 접촉시키는 것은 희석 단계 (b)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이는 분취액을 염색제와 접촉시키는 단계 (c) 동안에 발생할 수 있다. 선택적으로, 단계 (d)를 수행하기 전에 알코올을 제거할 수 있지만, 알코올의 제거가 필요하지 않고, 이에 따라 알코올/분취액/염색제 혼합물에서 단계 (d)를 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 알코올 처리는 미생물의 염색을 개선할 수 있다. 특정 실시형태에서, 분취액은 에탄올과 접촉하여 20 내지 50 v/v%의 에탄올, 예를 들어 25 내지 50 v/v%의 에탄올 또는 30 내지 45 v/v%의 에탄올을 포함하는 혼합물을 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 분취액은 에탄올과 접촉하여 45 v/v%의 에탄올을 포함하는 혼합물을 생성한다.
제1 방출 파장에서 형광 신호를 검출함으로써 온전한 미생물에 대응하는 것으로 객체가 식별된다. 사용된 염색제의 각각의 특성으로 인해 온전한 미생물로부터 제1 방출 파장에서 형광 신호가 발생하는 반면에, 상기 파장에서 샘플에서의 다른 항목(예를 들어, 온전하지 않은 미생물, 세포 잔해 또는 샘플에 존재하는 다른 입자)은 형광이 아니거나 온전한 미생물 세포보다 적은 정도로 형광이다. 따라서, 온전한 미생물 세포에 대응하는 객체는 샘플에서의 다른 객체와 상이한 형광 특성을 가지며, 샘플에서 이 객체를 다른 객체와 구별할 수 있어 온전한 미생물 세포에 대응하는 객체의 수가 결정되게 한다.
시각적 검출 수단에 의해 분취액-염색제 혼합물의 영상화를 수행한다. 온전한 미생물에 대응하는 객체를 검출하도록 분취액-염색제 혼합물의 확대된 영상을 얻고 분석한다.
온전한 미생물에 대응하는 객체가 온전한 미생물 세포일 수 있지만, 이것은 또한 2개 이상의 세포 클러스터, 예를 들어 비클론성 세포의 클러스터 및/또는 응집체로서 성장하는 클론일 수 있다. 따라서, 객체는 미생물 세포 또는 세포 클러스터일 수 있다. 상이한 미생물은 상이한 방식으로, 예를 들어 군집 또는 비군집으로, 또는 상이한 패턴 또는 형태로 성장할 수 있고, 주어진 미생물에 대해 이는 또한 성장 조건, 예를 들어 항균제의 존재 또는 양에 따라 달라질 수 있다. 영상을 분석하고 객체를 계수하고 이어서 객체의 수를 미생물 농도와 상관시켜 이러한 상이한 성장 패턴 및/또는 형태 등이 고려될 수 있다. 따라서, 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 제공하기 위해(이후 보정 곡선을 이용하여 온전한 미생물의 농도와 상관시킬 수 있음), 객체의 수를 계수하고, (예를 들어, 세포의 클러스터 또는 응집체를 처리하기 위해) 예를 들어 객체의 크기 및/또는 강도에 기초하여 그 수를 조정하여 영상을 분석할 수 있다. 이는 하기에서 더 논의된다.
분취액-염색제 혼합물의 영상화는 미생물에 해롭지 않은 온도에서 발생할 수 있다. 일반적으로, 실온, 또는 20℃ 내지 25℃에서 영상화가 발생할 것이지만, 다른 온도, 예를 들어 적어도 4℃ 내지 최대 37℃(즉, 37℃ 이하)가 또한 사용될 수 있다.
적어도 제1 염색제의 방출 파장에서 영상화를 수행하는데, 즉 제1 형광 염색제에 의해 염색된 객체를 검출하기 위해 수행한다. 상기에 기술된 바와 같이, 이는 온전한 미생물에 대응하는 객체가 샘플에 존재할 수 있는 다른 객체와 구별되게 하기에 충분한 정보를 제공할 수 있다.
특정 실시형태에서, 영상화는 제1 방출 파장에서 분취액-염색제 혼합물을 영상화하는 것을 오직 포함할 수 있고, 이에 따라 선택적으로 단계 (d)는 제2 염색제를 검출하는 것을 포함하지 않는다. 그러나, 일부 실시형태에서, 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두로부터 생긴 신호를 검출하는 것이 유리할 수 있고, 그러므로 제1 방출 파장에서 영상화를 수행할 수 있고, 제2 염색제를 검출하는 것도 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 따라서 제1 형광 염색제의 방출 파장 이외에 제2 형광 염색제의 방출 파장에 대응하는 파장에서 영상화를 수행할 수 있거나, 달리 말하면, 제2 방출 파장을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
본 방법이 제1 염색제와 제2 염색제 둘 모두를 검출하는 단계를 포함하는 경우, 개별적으로, 예를 들어 순차적으로 또는 동시에 각각의 염색제의 검출을 수행할 수 있다. 따라서, 단계 (c)는 제1 염색제를 검출하기 위해 (즉, 제1 방출 파장에서) 분취액-염색제 혼합물을 개별적으로 영상화하는 것을 포함할 수 있거나, 제1 염색제 및 제2 염색제를 검출하기 위해 분취액-염색제 혼합물을 동시에 영상화하는 것을 포함할 수 있다.
영상화는 명시야, 경사면, 암시야, 분산 염색, 위상차, 차등 간섭 대비, 형광, 공초점 현미경검사, 단일 평면 조명, 광 시트(light sheet) 및 대면적 다광자(wide field multiphoton) 현미경검사를 포함하는 현미경검사의 사용을 포함할 수 있다.
미생물은 영상화를 위해 검출 표면에 접촉하거나 결합하거나 회합하거나 흡착되게 할 수 있다. 그러나, 바람직한 일 실시형태에서, 표면 위에 또는 표면에 고정된 미생물보다는, 미생물의 현탁액, 즉 적합한 매질 또는 완충액에 있는 미생물에서 영상화를 수행할 수 있다. 바꾸어 말하면, 소정의 체적의 염색제-분취액 혼합물을 영상화할 수 있다. 미생물의 현탁액에서 영상화를 수행하는 경우, 현탁액에 걸쳐 하나 이상의 초점면에서 영상을 얻을 수 있다. 현탁액에 걸쳐 2개 이상의 (상이한) 초점면에서(예를 들어, 분취액-염색제 혼합물에 걸쳐 상이한 깊이 또는 단면에서) 영상을 얻는 것이 바람직할 수 있다. 바꾸어 말하면, 영상화되는 체적의 별개의 하위 체적을 영상화할 수 있다(즉, 염색제-분취액 혼합물 체적의 별개의 하위 체적의 영상을 얻을 수 있음). 따라서, 다수의(즉, 2개 이상의) 중첩되지 않는 영상을 얻을 수 있다. 이러한 다수의 영상은 적어도 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개 이상의 영상을 포함할 수 있다. 온전한 미생물에 대응하는 객체를 검출하고/하거나 식별하기 위해 영상을 분석한다. 그렇게 하여 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 얻는다. 샘플에서 얻은 모든 영상에서 검출된 객체는 샘플에서의 총 객체 수를 제공할 수 있다.
영상 단계를 수행하기 위해, 영상화가 발생할 수 있는 용기 또는 컨테이너, 예를 들어 플레이트의 웰, 또는 영상화에 적합한 캐리어의 구획에 단계 (c)로부터의 염색제-분취액 혼합물 또는 이의 일부 또는 분취액이 제공된다(예를 들어, 이들로 옮겨진다). 이러한 웰 또는 구획은 광학적 관찰 영역 또는 공간, 즉 현미경(또는 보다 구체적으로 이의 대물렌즈)에 접근 가능하고 현미경적 관찰 및 영상화가 가능하게 하는 광학 품질을 갖는 관찰(또는 관찰 가능한) 영역 또는 공간을 가질 것이다. 웰/구획의 기하 구조는 체적이 영상화되게 하기에 적합하거나 원하는 액체 높이(예를 들어, 적어도 2 mm의 액체 높이)와 함께 규정되거나 원하는 크기의 관찰 가능한 영역(예를 들어, 적어도 2 mm x 2 mm)을 제공할 수 있다. 대물렌즈는 웰 또는 구획 내부의 평면에, 예를 들어 바닥에 평행하게 초점화되고, 바닥에서 거리를 두고(예를 들어, 바닥에서 약 0.1 내지 0.5, 예를 들어 0.2 mm로) 떨어져 있을 수 있고, 현미경은 영상화 시간 동안 액체에 걸쳐 초점면을 연속적으로 이동시키도록, 예를 들어 영상 획득 시간(예를 들어, 10 내지 60초 또는 20 내지 30초) 동안 총 1 내지 3 mm(예를 들어, 1.5 mm) 이동시키도록 구성될 수 있다.
특히 바람직한 일 실시형태에서, 영상화는 광학 축을 따라 일련의 2D 영상을 얻는 것을 포함할 수 있으며, 그 각각의 영상은 현탁액의 체적에 걸쳐 광학 축을 따라 상이한 위치에서 얻어진다. 특정 실시형태에서, 광축에 수직으로 각각의 영상을 정렬할 수 있다(여기서는 xy 정렬이라고 함). 단일의 xy 정렬된 영상에 분취액-샘플 혼합물의 특정 영역이 포함되며, 이 영상의 크기는 영상화 장치의 광학 특성에 따라 달라진다. xy 공간에서의 각각의 위치에 대해, 광학 축 또는 z 축을 따라 상이한 간격으로 하나 이상의 2D 영상을 수집할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 샘플 체적의 3D 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있는 일련의 또는 스택의 2D 영상을 생성할 수 있다. 대안적으로, 2D 정보를 제공하는 다수의 개별 영상을 사용할 수 있다. 샘플로부터 3D 정보를 추출하기 위한 대안적인 방법은 Unisensor(예를 들어, 미국 특허 제8780181호)에 의해 사용되는 것이고, 여기서 광학 축은 xy 면에 대해 기울어져 있고, 샘플 또는 검출기는 x 면 또는 y 면 중 어느 하나를 따라 이동한다. 여기서, xy 공간 이외에 z 공간으로 확장된 일련의 영상을 얻는다. 영상 데이터의 후속 변환을 통해, 이 방법으로 xy 면에 수직으로 정렬된 2D 영상 스택을 또한 달성할 수 있다. 이러한 방식으로, 일련의 영상들의 각각은 별개의 영역(별개의 단면)의 영상이거나, 대안적으로 별도의 체적인 것으로 간주될 수 있다(단면은 z 방향으로 정의된 체적을 갖고, 따라서 각각의 영상에 깊이 z와 함께 xy 공간을 포함하는 체적이 제공될 수 있음).
2D 영상 스택에 내재된 3D 정보가 추출되면 샘플에서 온전한 미생물에 대응하는 객체를 식별하도록 그 정보를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어 z-스택을 하나의 2D 영상(투영된 2D 영상)으로 투영하여 3D 정보로부터 2D 영상을 생성할 수 있다. 이어서 생성된 2D 영상을 사용하여 분석을 수행할 수 있다. 대안적으로, 현탁액의 체적에 걸쳐 얻은 각각의 영상에 분석을 수행할 수 있고, 샘플에서 얻은 모든 2D 영상에 걸쳐 분석 결과를 통합할 수 있다. 또 다른 대안으로서, 얻은 각자의 2D 영상들의 각각에 개별적으로 분석을 수행할 수 있고(즉, 각각의 2D 영상에서 개별적으로 객체를 결정할 수 있음), 이로부터 수집된 정보를 조합할 수 있다. 조사 중인 시야, 예를 들어 영상 또는 투영된 2D 영상에서 온전한 미생물을 나타내는 형광 강도의 점 또는 영역으로 객체를 결정할 수 있다. 형광 영상에 대해 분석을 수행할 수 있고, 예를 들어 Cellprofiler 및 또한 대부분의 상업용 영상 분석 시스템에서 이를 위한 많은 대안적인 알고리즘이 존재한다.
다른 실시형태에서, xy 공간에서의 각각의 위치에 걸쳐 이어진 z 공간에서의 강도 변화가 등록되며, 이는 특정 위치에서의 미생물 덩어리를 나타낸다. 이는 전체 xy 공간에 걸쳐 적분되어 총 미생물 체적을 제공한다. 흔히 이용 가능한 영상 분석 소프트웨어(예를 들어, 프리웨어 Cellprofiler)에 이 절차에 대한 알고리즘이 또한 존재한다.
온전한 미생물에 대응하는 객체(즉, 제1 방출 파장에서 검출된 객체)가 영상화에 의해 검출되면, 분취액에 대한 영상 분석 값을 생성하도록 이렇게 얻은 정보를 사용할 수 있다. (예를 들어, 각각의) 객체의 형광 강도 및/또는 크기 및 선택적으로 (예를 들어, 각각의) 객체의 형태에 대해 영상을 분석할 수 있다. 객체의 진원도(circularity), 객체에서의 형광 강도의 균일성 또는 최대 형광 강도(예를 들어, 이 안의 픽셀의 최대 강도), 객체에서의 최빈 형광 강도, 중앙치 형광 강도 또는 평균 형광 강도 및/또는 영상화에 의해 검출되는 각각의 객체의 면적과 같은 인자들을 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 주어진 범위 내에서 이들 매개변수들 중 하나 이상을 갖는 객체만이 분석에 포함되어(예를 들어, 계수되거나 열거되어), 영상 분석 값을 생성할 수 있다. 영상 분석 값은 객체의 수, 즉 계수치를 나타내거나 이에 대응한다는 의미에서 식별된 객체에 대한 합산 값일 수 있다. 각각의 객체에 포함된 인접한 픽셀의 수에 기초하여 객체 면적을 결정할 수 있고, 적어도 소정의 개수의 픽셀을 포함하거나 그보다 많이 포함하는 객체만이 분석에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 객체 면적 x 강도에 대해 도출된 값에 기초하여 객체를 식별하고 검출할 수 있고, 특정 범위의 매개변수 내에 있는 특성을 갖는 객체만을 계수하거나 열거하여 영상 분석 값을 생성할 수 있다. 바꾸어 말하면, 영상 분석 값은 특정 범위의 매개변수 내에 있는 특징을 갖는 온전한 미생물에 대응하는 객체 수 또는 바꾸어 말하면 온전한 미생물에 대응하는 보정된 객체 수(또는 조정된 객체 수)를 나타낸다.
영상화된 객체의 집단, 즉 객체의 총체에 대한 정보를 제공하도록 각각의 객체에 대해 결정된 인자(예를 들어, 상기에 기재된 임의의 인자) 또는 모든 객체에 대한 객체 면적 x 강도와 같은 도출된 값을 또한 합산할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 영상화된 객체(또는 보다 특히 영상화된 객체의 세트 또는 그룹)의 최대 형광 강도, 최빈 형광 강도 또는 중앙치 형광 강도를 결정할 수 있다. 대안적으로, 영상화된 객체의 형광 강도의 분포 또는 영상화된 객체에 대한 객체 면적 x 강도와 같은 도출된 값을 결정할 수 있다. 따라서, 각각의 객체는 그것에 배정된 값(예를 들어, 면적, 최대 형광 강도, 전체 강도, 중앙치 강도 또는 평균 강도)을 가질 수 있고, 영상화된 객체의 집단에 대해 상기 인자들 중 하나 이상의 중앙치 또는 평균, 또는 변량 또는 평균 편차를 확립할 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 이 정보는 샘플에서의 미생물의 특성을 나타낼 수 있고, 이 샘플 안의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 데 사용하기 위한 적합한 보정 곡선의 선택에 이 정보를 사용할 수 있다. 더욱이, 이 정보는 샘플에서의 미생물의 표지의 효율성에 관한 정보를 제공할 수 있고, 형광 강도가 검출 한계 미만인 미생물의 비율을 결정하는 데 이 정보를 사용할 수 있다.
선택적으로, 영상에 대해 배경 공제 또는 정규화 단계를 초기 단계로서, 즉 본원에 기술된 임의의 후속 영상 분석 단계 전에, 수행할 수 있다. 임의의 편리한 공지된 표준 방법, 예를 들어 롤링 볼 공제를 사용하여 이를 수행할 수 있다.
스레시홀딩(thresholding)을 수행한 후에 영상 분석 값을 결정할 수 있다. 바꾸어 말하면, 객체가 검출되었는지 여부를 결정하기 위해 임계 값(threshold)을 설정할 수 있다. 샘플의 영상에 대해 얻은 신호의 강도의 하한을 설정하기 위해 스레시홀딩을 수행할 수 있고, 이 하한 아래에서의 객체는 고려되지 않는다. 본 발명의 방법의 맥락 내에서, 스레시홀딩은 제1 방출 파장에서 형광 강도가 낮은 객체(즉, 제1 염색제로 강하게 염색되지 않은 객체)가 임의의 미래의 분석에서 폐기되게 한다. 하나 이상의 수준에서 임계 값을 설정할 수 있고, 상이한 임계 값에서 객체를 계수할 수 있다.
특정 실시형태에서, 전반적 스레시홀딩을 수행할 수 있는데, 즉 영상의 전체(또는 영상의 세트)에 대해 단일 임계 값을 설정할 수 있다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 예를 들어 조명 및/또는 배경 신호가 영상에 걸쳐 균일하지 않는 경우 국부적 스레시홀딩을 수행할 수 있다. 국부적 스레시홀딩은 인접한 픽셀의 그레이스케일 정보에 따라 주어진 픽셀에 대한 임계 값을 추정한다.
추가로, 영상 분석 값을 결정하기 전에, 예를 들어 영상을 그레이스케일로 변환하기 위해(여기서, 그레이스케일 수준으로 형광 강도를 판독할 수 있음), 그리고/또는 배경을 공제하기 위해(예를 들어, 롤링 볼 방법을 사용함) 당업계에 공지된 기법에 따라 다른 영상 분석 조작을 수행할 수 있다.
예를 들어 미생물이 군집 미생물 또는 비군집 미생물인지를 영상화하여 얻은 정보에 기초하여 샘플을 특성규명할 수 있다. 유리하게는, 이 과정에 적합한 보정 곡선의 선택은 오직 샘플에서의 객체의 모습, 예를 들어 샘플에서 검출된 객체의 특정 비율이 특정 면적 및/또는 최대 강도를 갖는지에 기초할 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 온전한 미생물의 농도를 결정하기 전에 상기 샘플에서의 미생물의 정체를 알 필요가 없다. 따라서, 군집 미생물 또는 비군집 미생물에 대해 미리 결정된 보정 곡선을 선택할 수 있다.
샘플 내의 온전한 미생물의 농도와 영상 분석 값 사이의 관계는 상기 샘플 내의 미생물에 관한 다수의 매개변수들, 예를 들어 미생물의 크기 및 형태, 및/또는 미생물이 클러스터 또는 생물막을 형성하는 경향에 따라 달라질 수 있다. 각각의 객체는 2개 이상의 미생물에 대응할 수 있으므로, 따라서 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위해 샘플 내의 객체의 수를 직접 사용하지 않는다. 더욱이, 2개 이상의 초점면에서 영상화가 수행되는 본 발명의 실시형태에서 미생물 또는 미생물 클러스터가 상이한 초점면에서 촬영된 경우 2개의 별개의 영상으로 나타날 수 있고, 따라서 2개의 별개의 객체로 미생물 또는 미생물 클러스터를 검출할 수 있다. 따라서, 샘플 내의 미생물의 정체는 샘플 내의 미생물의 농도와 본 발명의 방법의 단계 (c)에서 영상화된 객체의 수 사이의 관계에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 방법에서 보정 곡선을 사용하여 이들과 같은 인자들, 및 (예를 들어, 생존 가능한 미생물 및 생존 불능 미생물의 불완전한 염색을 통한) 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 방법의 정확성에 영향을 미치는 것으로 당업계에서 이전에 확인된 인자들에서 벗어날 수 있다.
알려진 농도의 미생물을 함유하는 일련의 샘플, 즉 미생물의 농도가 대안적인 방법에 의해 결정되거나 결정됐던 샘플에 대해 본 발명의 농도 결정 방법의 단계 (c) 및 단계 (d)를 수행하여 보정 곡선을 작성할 수 있다. 따라서, 상이한 농도의 미생물을 함유하는 각각의 샘플에 대해 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수를 결정할 수 있고, 따라서 상기 객체의 수와 미생물의 농도 사이의 관계를 확립할 수 있다.
본 발명의 농도 결정 방법을 수행하기 전에 보정 곡선이 작성된다는 점에서 보정 곡선이 미리 결정된다. 따라서, 주어진(즉, 모든) 샘플 내의 미생물의 농도를 결정하기 전에 보정 곡선을 개별적으로 작성할 수 있다. 그러나, 다수의 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위해 보정 곡선을 작성하고 사용할 수 있거나, 달리 말하면, 동일한 보정 곡선을 사용하여 다수의 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정할 수 있는 것이 바람직하다. 바꾸어 말하면, 본 방법이 보정 곡선의 생성을 포함할 필요는 없고, 미리 작성된 보정 곡선을 사용할 수 있으며, 각각의 샘플마다 별개의 보정 곡선이 생성될 필요가 없다. 주기적으로, 예를 들어 매일, 매주 또는 매달 새로운 또는 새로 생성된 보정 곡선을 작성할 수 있거나, 예를 들어 새로운 염색제 배치(batch)를 사용하기 전에 배치 방식으로 보정 곡선을 작성할 수 있으며, 다른 새로운 보정 곡선을 작성하는 것이 필요할 때까지 온전한 미생물의 농도를 결정하는 데 상기 새로운 보정 곡선을 사용할 수 있다.
그러나, 본 발명의 방법을 수행할 때 주어진 미생물의 농도 또는 미생물의 유형을 결정하기에 적합한 보정 곡선을 제공할 수 있고, 따라서 상이한 특징, 예를 들어 상이한 성장 패턴을 갖는 상이한 미생물 또는 미생물 유형에 대해 별개의 보정 곡선을 작성하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이는 반드시 특정 속 또는 종의 미생물의 수준에 있을 필요는 없지만, 예를 들어 미생물의 형태 및/또는 성장 패턴에 따라 달라질 수 있다.
샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 데 사용하기 위한 보정 곡선의 적합성은 경우에 따라서는 상기 미생물의 정체에 의존할 수 있고, 보정 곡선이 얼마나 정확하게 영상 분석 값으로부터 온전한 미생물의 농도를 결정되게 하는지를 결정할 것이다. 예를 들어, 특정 미생물을 사용하여 생성된 단일 보정 곡선은 일련의 상이한 미생물, 예를 들어 단일 과 또는 속 내의 미생물의 농도를 결정하는 데 적합할 수 있으며, 이러한 방식으로 본 발명의 방법에 사용하기 위해 단일 보정 곡선을 작성하는 것만이 필요할 수 있다. 대안적으로, 이러한 목적을 위해 상이한 과, 속, 종 또는 균주 및/또는 유사한 특징 및/또는 형태를 갖는 상이한 미생물로부터 얻은 영상화 데이터를 사용하여 보정 곡선을 작성할 수 있고, 단일 보정 곡선을 제공하도록 이로부터 얻은 데이터들을 조합할 수 있다.
예를 들어, 상이한 종의 비군집 그람-음성 박테리아로부터 데이터를 수집하여 보정 곡선을 작성할 수 있다. 따라서, 이렇게 작성된 보정 곡선은 많은 상이한 미생물(적합한 미생물)의 농도, 즉 영상화된 객체의 수와 샘플 내의 미생물의 농도 사이의 만족스러운 상관관계(즉, 대표적인 상관관계)를 입증하는 미생물의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 특정 미생물이 불규칙하거나 특이한 특성을 나타내는 경우, 샘플에서 그 특정 미생물의 농도를 결정하기 위해 그 미생물에 대해 별개의 보정 곡선을 생성하는 것이 필요할 수 있다.
따라서, 상이한 선택 미생물의 농도를 결정하는 데 사용하기에 각각 적합한 다수의 상이한 보정 곡선을 제공할 수 있다(즉, 본 발명의 농도 결정 방법을 수행하기 전에 작성할 수 있음). 따라서, 예를 들어 비군집 그람-음성 박테리아, 비군집 그람-양성 박테리아, 군집 그람-음성 박테리아 또는 효모에 대해 별개의 보정 곡선을 제공할 수 있다. 따라서, 샘플에서 특정 미생물의 농도를 결정하기 위해 적절한 보정 곡선을 선택할 수 있다. 따라서, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 상이한 보정 곡선을 작성할 수 있고, 샘플에서 미생물의 영상화를 수행하면 적절한 보정 곡선을 선택할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 영상화 단계 (d)에서 얻은 정보는 특정 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하기 위해 어떤 보정 곡선이 사용되어야 하는지의 선택을 알려줄 수 있다. 선택적으로 배경 공제 및/또는 스레시홀딩 단계 후에 단계 (d)에서 검출된 객체에 대해 상기에 기술된 객체의 하나 이상의 매개변수(즉, 상기에 기술된 바와 같은 객체의 최대 강도, 최빈 강도 및/또는 면적 또는 도출 값)를 결정할 수 있고, 그 샘플에 적합한 보정 곡선을 선택하는 데 이 정보를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 군집 미생물 또는 비군집 미생물에 대해 미리 결정된 보정 곡선을 사용한다.
샘플의 성질, 미생물이 제공되는 배지, 및 샘플이 보관되거나 항온처리되는 조건과 같은 인자들도 샘플에서의 미생물 농도와 본 방법의 단계 (c)에서 영상화된 객체의 수 사이의 관계에 모두 영향을 줄 수 있고, 따라서 바람직하게는 분취액-염색제 혼합물이 영상화되는 조건과 유사하거나 동일한 조건 하에 보정 곡선을 작성한다.
상기에 언급된 바와 같이, 샘플은 미생물 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있고, 샘플로부터 제거하는 것이 바람직할 수 있는 추가 성분(샘플에 존재하는 미생물 세포의 정확한 시험을 방해할 수 있는 성분)을 포함할 수 있다. 샘플은 일반적으로 생물학적 샘플이거나 생물학적 샘플을 포함할 수 있거나, 그 대신에 표현되면 샘플은 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 특히, 샘플은 생물학적 유래의 비미생물성 물질(예를 들어, 세포성 물질)을 포함할 수 있다. 따라서, 샘플은 물 샘플(예를 들어, 폐수), 하수 유출물, 토양 샘플 또는 현탁액, 음식 샘플(예컨대, 과일 또는 야채 주스, 육류, 과일, 야채 또는 유제품) 또는 이들의 균질물과 같은 환경 샘플, 또는 의학 샘플 또는 임상 샘플일 수 있다.
미생물은 임의의 미생물(예를 들어, 하기에 추가로 기술된 바와 같은 임의의 박테리아 또는 진균 미생물, 또는 원생동물), 특히 임의의 병원성 미생물 또는 신체에 감염을 야기하는 임의의 미생물일 수 있으며, 따라서 특히 피험체의 어느 신체 부분 안에서 또는 상에서 미생물 감염을 검출하거나 진단하는 것과 관련하여 미생물의 농도를 결정하기 위해 본 발명의 방법을 사용할 수 있다.
따라서, 바람직한 일 실시형태에서, 샘플은 임상 샘플이거나 이를 포함한다. 임상 샘플은 피험체로부터 얻을 수 있는 임의의 샘플일 수 있으며, 이 피험체는 일반적으로 인간 환자일 것이지만 임의의 인간 또는 동물, 일반적으로 포유동물 대상체일 수 있다. 따라서, 이것은 신체 조직, 세포 또는 체액의 임의의 샘플, 또는 신체로부터 유래된 임의의 샘플, 예를 들어 면봉, 세척액, 흡인물 또는 세정액일 수 있다. 적합한 임상 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 분획, 관절액, 소변, 정액, 타액, 대변, 뇌척수액, 위 내용물, 질 분비물, 점액, 조직 생검 샘플, 조직 균질액, 골수 흡인물, 골 균질액, 가래, 흡인물, 호흡기 샘플, 상처 삼출물, 면봉 및 면봉 세정액, 예를 들어 비인두 면봉, 기타 체액 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 일 실시형태에서, 임상 샘플은 샘플이거나 혈액 또는 혈액 유래 샘플, 예를 들어 혈청 또는 혈장 또는 혈액 분획이다.
감염 또는 의심되는 감염의 증상 또는 대상체의 일반 임상 상태의 제시에 따라 임상 샘플의 성질을 결정할 수 있다. 임의의 미생물 감염이 포함되지만, 본 발명의 방법은 특히 패혈증의 검출 또는 진단(또는 보다 일반적으로 패혈증의 관리)의 과정에서 유용하거나 패혈증이 의심되는 경우에 유용하다. 따라서, 패혈증을 앓거나 패혈증이 의심되거나 패혈증의 위험이 있는 대상체로부터 임상 샘플이 유래될 수 있다. 그러한 경우, 샘플은 일반적으로 혈액 또는 혈액 유래 샘플일 것이다. 일반적으로, 패혈증의 경우 샘플은 혈액이거나 혈액을 포함할 것이지만 위에서 열거된 것과 같은 다른 유형의 샘플이 배제되지는 않는다.
배양 배지를 포함하는 배양 용기에 임상 샘플을 도입할 수 있다. 이는 당업계에 널리 공지되어 있고 문헌에 널리 기술된 표준 절차에 따라 수행될 수 있는 표준 단계이다. 따라서 임상 샘플을 배양할 수 있고, 따라서 본 방법에 사용된 샘플은 임상 샘플 배양물일 수 있거나, 하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 이 샘플은 임상 샘플 배양물로부터 회수되거나 단리된 미생물을 포함하는 샘플일 수 있다.
미생물 세포를 배양하기에 적합한 배양 배지를 함유하는 용기에 임상 샘플을 수집할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 배양 배지를 함유하는 배양 플라스크에 임상 샘플(예를 들어, 혈액 샘플)을 수집할 수 있고, 선택적으로 미생물 세포의 회수 전에 이 임상 샘플을 배양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 시험(예를 들어, AST 시험) 전에 배양 플라스크를 계속 배양하면서, 시험(예를 들어, 미생물 ID를 위해 시험)을 위해 임상 샘플을 배양 플라스크에 도입하고 짧은 배양 기간 직후에 또는 후에 플라스크로부터 임상 샘플/배양 배지 혼합물의 분취액을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법은 동시 계류 중인 국제공개 WO 2015/189390호에 기재되어 있다.
배양 용기는 미생물 세포의 배양에 적합한 임의의 용기 또는 컨테이너, 예를 들어 플레이트, 웰, 관, 병, 플라스크 등을 포함할 수 있다. 편리하게는, 임상 샘플이 혈액 또는 혈액 유래 샘플인 경우 배양 용기는 혈액 배양 플라스크, 예를 들어 BacT/ALERT(Biomerieux) 혈액 배양 플라스크, Bactec 혈액 배양 플라스크(Becton Dickinson) 또는 VersaTrek 혈액 배양 플라스크(Thermo Fisher), 또는 실제로 혈액의 샘플링을 위해, 특히 미생물을 검출하기 위한 배양의 목적을 위해 공지된 임의의 관, 플라스크 또는 병이다. 따라서, 샘플은 혈액 배양 샘플일 수 있다.
편리하게는, 배양 용기에는 이 용기 안에 이미 함유된 배양 배지가 제공될 수 있다. 그러나, 임상 샘플을 첨가하기 전에, 첨가함과 동시에 또는 첨가한 후에 개별적으로 배양 배지를 제공하고 배양 용기에 도입할 수 있다.
배양 배지는 임의의 적합한 배지일 수 있고, 임상 샘플 및/또는 의심되는 미생물의 성질 및/또는 대상체의 임상 상태 등에 따라 이 배양 배지를 선택할 수 있다. 이러한 용도에 적합한 많은 상이한 미생물 배양 배지가 공지되어 있다. 일반적으로, 배양 배지는 당업계에 공지된 바와 같이 미생물의 빠른 성장을 촉진하기에 충분한 영양소를 함유할 수 있다. 많은 경우에 적절한 배지는 뮬러-힌턴(MH) media, 까다로운 MH(MHF), 용해된 말 혈액이 보충된 뮬러-힌턴, 용원성 브로스(LB: Lysogeny broth), 2X YT Media, 트립톤 처리 대두 브로스, 콜롬비아 브로스(Columbia broth), 뇌 심장 주입 브로스, 브루셀라 브로스, 및 당업계에 공지된 범용 성장 배지와 같은 배지를 포함하는 복잡한 성장 배지이고, 특정 성장 인자 또는 보충제의 첨가를 포함할 수 있다. 배양물을 교반하거나 교반하지 않을 수 있다. 배양 배지는 액체, 고체 및 현탁액 등을 포함하여 다양한 형태로 이용 가능하고, 이들 중 어느 것도 사용할 수 있지만, 편리하게는 배지는 액체 배지일 것이다. 배양 용기가 상기에 기술된 바대로 혈액 배양 플라스크를 사용할 준비가 된 경우, 상기 용기는 넓은 범위의 미생물이 성장하게 하도록 특별히 변형된 특정 배지를 함유할 수 있다. 일반적으로, 제조자에 의해 혈액 배양 플라스크에 공급된 배지는 피험체로부터 취한 임상 샘플에 존재하는 임의의 항생제의 존재를 중화시키기 위한 제제 또는 첨가제를 함유할 것이다. 이러한 중화제를 함유하거나 함유하지 않는 플라스크를 사용할 수 있고, 원한다면 배양 용기에 중화제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 임상 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이며, 혈액 배양 플라스크(BCF: blood culture flask)에 이 임상 샘플을 수집한다. 혈액 배양 플라스크의 예는 BacT/ALERT(Biomerieux) 혈액 배양 플라스크, Bactec 혈액 배양 플라스크(Becton Dickinson) 또는 VersaTrek 혈액 배양 플라스크(Thermo Fisher), 또는 실제로 혈액의 샘플링을 위해, 특히 미생물을 검출하기 위한 배양의 목적을 위해 공지된 임의의 관, 플라스크 또는 병을 포함한다.
본 발명에 따른 샘플은 따라서 배양 배지에 임상 샘플을 포함할 수 있다. 추가로, 샘플은 임상 샘플 배양물(즉, 일정 기간 동안 배양된 임상 샘플)일 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 방법으로 처리되는 샘플은 수집되거나 준비된 복합한 샘플의 일부일 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 샘플은 일 실시형태에서 샘플로부터, 예를 들어 배양(즉, 항온처리) 기간 전이든, 동안이든 또는 후이든지 간에, 임상 샘플 또는 다른 샘플을 함유하는 배양 용기(플라스크)의 내용물로부터 취해지거나 제거된 분취액(예를 들어, 시험 분취액)일 수 있다. 더욱이, 하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 상기 임상 샘플 또는 임상 샘플 배양물로부터 회수된 미생물의 제제(예를 들어, 현탁액)에서 미생물의 농도를 결정하는 데 본 발명의 농도 결정 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 샘플은 회수된 미생물을 함유하는 샘플일 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 본 발명은 임상 샘플 배양물, 예를 들어 혈액 배양 플라스크로부터 미생물 세포를 회수하는 것을 포함하고, 여기서 바람직하게는 혈액 배양 플라스크에서 임상 샘플이 일정 기간 동안 배양되고, 따라서 이러한 임상 샘플 배양물로부터 회수된 샘플에서 미생물 세포의 농도를 결정하는 방법을 제공한다.
따라서, 일 실시형태에서, 단계 (a)에 사용된 샘플은 (예를 들어, 임상 샘플 배양 시스템에서) 미생물 성장에 대해 양성으로 지정된 임상 샘플의 배양물일 수 있다. 따라서, 이것은 양성 혈액 배양 플라스크일 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 따르면 임상 샘플 배양물을 양성으로 지정할 필요는 없으며, 이러한 임상 배양 샘플은 양성으로 지정되기 전의 단계에, 예를 들어 양성으로 표시되기에 필요한 기간보다 적은 기간 동안 배양될 때에 사용될 수 있다. 따라서, 샘플은 비양성 혈액 배양 플라스크(예를 들어, 플라스크를 양성으로 지정하는 데 필요한 수보다 적은 수의 미생물 세포를 함유하거나 더 짧은 기간 동안 배양되는 혈액 배양 플라스크)일 수 있다. 실제로, 일부 임상 샘플의 경우, 임의의 배양이 일어나기 전에(예를 들어, 임상 샘플 배양이 설정될 때) 임상 샘플 배양물의 샘플을 추출하여 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 그러나, 유리하게는 농도 결정 방법에서 이러한 양성 임상 샘플 배양물 또는 비양성 임상 샘플 배양물을 직접 사용하기보다는, 단계 (a)에 사용된 샘플은 이러한 임상 샘플 배양물로부터 회수되거나 단리된 미생물을 함유하는 샘플, 예를 들어 이러한 회수된 미생물을 포함하는 현탁액 또는 제제이다.
대안적인 실시형태에서, 상기에 언급된 항균제의 MIC를 결정하기 위한 EUCAST 표준 방법에 따라 샘플을 제조할 수 있다. 특히, 이 샘플은 종래의 AST 방법에 사용하기 위해 제조된 것일 수 있지만, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 AST 방법에 이 샘플을 사용할 수 있다. (예를 들어, 임상 샘플 배양물로부터의) 미생물 세포를 단리된 콜로니를 얻도록 플레이팅할 수 있고, 생성된 콜로니를 수집하고 사용하여 AST 시험 미생물 배양물을 위한 접종원을 제조하는 데 사용하기 위한 미생물 세포 현탁액을 제조한다. 이 현탁액은 단계 (a)에 사용된 샘플일 수 있다. 대안적으로, 접종원을 제공하기 위해 배양될 수 있는 배양 배지를 접종하기 위해 단리된 개별 콜로니를 사용할 수 있다. 이 배양물은 단계 (a)에 사용된 샘플일 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같이 샘플로부터 회수된 미생물을 함유하는 샘플에서 미생물(즉, 상기에 언급된 임의의 샘플, 특히 임상 샘플 또는 임상 샘플 배양물로부터 회수된 미생물)의 농도를 결정하도록 본 발명의 농도 결정 방법을 수행할 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 '샘플'은 회수된 미생물 샘플일 수 있다. 상기에 언급된 샘플은, 예를 들어 샘플 내의 온전한 미생물의 농도가 정확하게 측정되는 것을 방지하거나 미생물 생존력에 영향을 미치거나 미생물 성장을 억제함으로써, 미생물 세포의 제조, 취급 및 배양을 어떤 방식으로든 방해할 수 있는 성분을 함유할 수 있다. 따라서, 임의의 이러한 성분으로부터 미생물을 분리하기 위해 이러한 샘플 내에서 미생물을 회수하는 것이 유리할 수 있다. 회수된 미생물 샘플에서 미생물을 회수하면 미생물의 농도를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 AST 분석을 위한 미생물을 제공하기 위해 회수된 미생물 샘플을 사용할 수 있다. 따라서, 회수된 미생물 샘플에 대해 그리고 이 샘플을 사용하여 본원에 기술된 농도 결정 방법 및 AST 방법을 수행할 수 있다.
샘플로부터 미생물을 회수하는 것은 샘플이 임상 샘플 또는 임상 샘플/배양 배지 혼합물일 때 특히 유리할 수 있다. 배양 이전에, 동안에 또는 후에 임상 샘플/배양 배지 혼합물로부터 미생물 세포를 회수할 수 있다. 배양 플라스크, 예를 들어 혈액 배양 플라스크에 제공된 배양 배지는 예를 들어 샘플에서의 항균 화합물의 효능 및/또는 농도를 감소시키기 위해 흡착시킴으로써 그 화합물의 효과를 중화시키는 성분, 및/또는 샘플에 존재할 수 있는 대상체의 선천성 면역계의 성분(예를 들어, 보체 또는 다른 인자)의 항균 활성을 억제하는 나트륨 폴리아네톨 설포네이트(SPS: Sodium Polyanethole Sulfonate)와 같은 화합물을 함유할 수 있다. 따라서 이들과 같은 화합물을 함유하는 배양 배지로부터 미생물 세포를 회수하는 것이 바람직할 수 있다.
샘플로부터 미생물 세포를 선택적으로 단리시키거나 샘플에서 미생물 세포를 농후화하여 샘플로부터 미생물을 회수하는 것을 수행할 수 있다. "농후화"는 샘플 내에 미생물 세포의 농도를 증가시키거나 샘플로부터 임의의 비미생물성 성분(예를 들어, 비미생물성 세포)을 제거하거나 그렇지 않으면 이의 농도를 감소시키는 임의의 방법을 의미한다. 본 맥락에서, 농후화는 샘플로부터 피험체(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 유래된 세포를 제거하는 것 및 샘플로부터 미생물 세포를 단리하는 것 둘 모두를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 임상 샘플 배양물(또는 보다 특히 샘플 배양물의 분취액)로부터 미생물 세포를 분리할 수 있고, 항균제 감수성을 결정하기 위해 특히 AST 분석과 관련하여 본 발명에 따른 농도 결정 단계로 이 미생물 세포를 처리할 수 있다.
샘플로부터 미생물을 회수하기 위한 적절한 방법은 존재하는 임의의 비미생물성 세포를 선택적으로 용해시키고/시키거나 미생물 세포를 선택적으로 회수하는 것(즉, 샘플에서 미생물 세포의 양성 선택 또는 음성 선택)을 포함할 수 있다. 비미생물성 세포를 용해시키고 비미생물성 세포를 포함하는 혼합물로부터 미생물 세포를 단리시키는 것에 대한 절차 및 시약은 예를 들어 Molzym 또는 Biocartis로부터 상업적으로 입수 가능하다. 다른 용해 조건 및 방법은 당업계에, 예를 들어 문헌[Sullivan et al. 1975, J Clin Microbiol 1, 30-36]; 문헌[Zierdt et al. 1977 J Clin Microbiol 5, 46-50]에 널리 기재되어 있다.
따라서, 회수는 임의의 비미생물성 진핵 세포의 샘플로부터 제거하는 것을 포함할 수 있다. 회수는 예를 들어 피험체로부터 유래된 임의의 세포를 제거하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 샘플은 임상 샘플이다. 비미생물성 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 용해하지만, 미생물 세포를 용해시키지 않고, 바람직하게는 미생물 세포의 생존력을 유지시키는 임의의 조건 하에 회수를 수행할 수 있다. 예를 들어, 원치 않는 세포의 선택적 용해를 달성하기 위해 샘플에 적절한 용해 시약, 예를 들어 용해 완충액을 첨가할 수 있다. 비미생물성 세포의 선택적 용해는 샘플에 존재할 수 있는 다른 성분으로부터 미생물 세포가 분리되게 한다. 따라서, 용해 시약은 예를 들어 세포막을 가용화함으로써 세포(예를 들어, 포유류 세포)를 선택적으로 용해시킬 수 있다. 용해 시약은 하나 이상의 계면활성제(detergent), 하나 이상의 카오트로프(chaotrope), 하나 이상의 효소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 선택적 용해 시약의 상이한 성분은 단일 용해 시약으로서 샘플과 접촉할 수 있거나, 상이한 성분(예를 들어, 계면활성제 함유 용해 완충액 및 하나 이상의 효소)은 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 접촉할 수 있다. 이러한 접촉은 샘플을 시약/시약 구성요소에 첨가하거나 그 반대로 함으로써 이루어질 수 있다.
"용해"라는 용어는 세포의 분해를 의미한다. 특히, 세포는 분해되어 세포 내용물을 방출한다. 임의의 수단에 의해 용해를 달성할 수 있고, 이들 중 다수는 예를 들어 바이러스 메카니즘, 효소 메카니즘, 기계 메카니즘, 전기 메카니즘, 화학 메카니즘, 열 메카니즘, 냉 메카니즘 또는 삼투 메카니즘에 의한 것으로 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 세포 완전성을 손상시켜 주변 용액으로 세포 성분의 일부 또는 전부를 방출시킨다.
"선택적으로 용해시킨다" 또는 "선택적 용해"라는 용어는 샘플에 존재하는 세포의 특정 하위집단을 용해시키는 것을 의미한다. 본 경우에, 임상 샘플에 존재하는 미생물 세포를 실질적으로 용해시키지 않으면서 임상 샘플에 존재하는 비미생물성 세포, 또는 보다 특히 피험체(예를 들어, 포유 동물 세포)로부터 유래된 세포만을 선택적으로 용해시키는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 특정 방법에 따르면, 샘플로부터 얻은 미생물 세포가 성장하고 번식할 수 있는 것이 바람직하고(항균제 감수성을 결정하기 위해 성장이 필요함), 따라서 생장 및/또는 번식하는 미생물 세포의 능력(생존력)은 샘플에 존재하는 비미생물성 세포 또는 피험체 유래 세포의 선택적 용해에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게는 샘플로부터 회수된 모든 미생물(즉, 100%의 미생물) 또는 실질적으로 모든 미생물 세포는 임의의 이러한 처리 후에 생존 가능할 수 있으며, 샘플로부터 회수된 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94% 93%, 92%, 91% 또는 90%의 미생물 세포가 선택적 용해 단계 후에 생존 가능한 것이 바람직하다.
그러나, 본 발명의 방법이 회수된 미생물 샘플에서 온전한 미생물 또는 생존 가능한 미생물의 농도가 결정될 것을 요구함에 따라, 적어도 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10%의 회수된 미생물 세포가 온전하거나 생존 가능한 경우 항생제 감수성을 여전히 평가할 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 어떤 특정 수준의 미생물 생존력 또는 회수로 제한되지는 않는다.
미생물의 정체를 아는 것에 의존하지 않는, 샘플에서 미생물을 선택적으로 농후화하기 위해 비미생물성 세포를 선택적으로 용해시키기 위한 방법은 예를 들어 미국 특허출원공개 US 2013/0171615호, US 2012/0231446호, US 2010/0184210호, US 7893251호 및 US 8481265호에 기술되어 있고, 샘플로부터 진핵 세포를 선택적으로 제거하는 방법은 미국 특허출원공개 US 2005/0202487호에 기술되어 있다.
유용한 계면활성제는 Triton X100-R, Triton X-114, NP-40, Genapol C-100, Genapol X-100, Igepal CA 630, Aslasolve 200, Brij 96/97, CHAPS, 옥틸 β-D-글루코피라노시드, 사포닌 및 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르(C12E9, 폴리도세놀)와 같은 하나 이상의 비변성 용해 계면활성제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 변성 용해 계면활성제, 예를 들어 황산 도데실 나트륨(SDS), N-라우릴사르코신, 디옥시콜레이트 나트륨, 담즙염, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, SB3-10, SB3-12, 아미도설포베타인-14 및 C7BzO가 포함될 수 있다. 선택적으로, 가용화제, 예컨대 Brij 98, Brij 58, Brij 35, Tween 80, Tween 20, Pluronic L64, Pluronic P84, 비계면활성제 설포베타인(NDSB 201), 아피폴(PMAL-C8) 및 메틸-β-시클로덱스트린도 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리옥시에틸렌 계면활성제가 바람직할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 구조 C12-18/E9-10을 포함할 수 있고, 여기서 C12-18은 12개 내지 18개의 탄소 원자의 탄소 사슬 길이를 나타내고, E9-10은 9개 내지 10개의 옥시에틸렌 친수성 헤드기를 나타낸다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 Brij 97, Brij 96V, Genapol C-100, Genapol X-100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르(폴리도카놀) 또는 이들의 조합 및 에틸렌-디아민테트라아세트산(EDTA)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
용해 용액은 또한 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 용해 용액에 사용될 수 있는 효소는 제한 없이 핵산 및 다른 막 오염 물질을 분해하는 효소(예를 들어, 프로테이나제 XXIII, DNase, 뉴라미니다제, 다당류, Glucanex 및 Pectinex, 프로테이나제 K, 마이크로코커스 핵산분해효소(Micrococcal nuclease), 펩신 또는 트립신)를 포함한다.
적합한 카오트로프 또는 카오트로픽제는 우레아, 구아니디늄 히드로클로라이드, 부탄올, 에탄올, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 페놀, 프로판올 또는 티오우레아를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 예를 들어 2-머캅토에탄올 또는 디트리오트레이톨(DTT)과 같은 환원제, 마그네슘, 피루베이트 및 습윤제와 같은 안정화제, 및/또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제를 포함하는 하나 이상의 추가 제제를 사용할 수 있다.
원하는 세포를 용해시키기에 적합한 임의의 pH에서 용해 시약을 완충할 수 있으며, 용해 시약은 제한 없이 샘플의 유형, 용해될 세포 및 사용된 계면활성제를 포함하는 다수의 인자에 달라질 것이다. 일부 실시형태에서, pH는 2 내지 13, 예를 들어 6 내지 13, 8 내지 13 또는 10 내지 13의 범위일 수 있다. 적합한 pH 완충액은 원하는 범위, 예를 들어 약 0.05 M 내지 약 1.0 M CAPS에서 pH를 유지할 수 있는 임의의 완충액을 포함한다.
추가로, 용해 시약은 미생물 세포의 용해 또는 후속 취급을 돕는 NaCl, KCl, MgCl2, Na2HPO4, NaH2PO4를 포함하는 임의의 적합한 염을 포함할 수 있다. 염은 존재하는 경우 사용된 샘플 및 완충액의 체적과 같은 인자에 따라 임의의 적합한 농도, 예를 들어 적어도 0.01 M, 0.02 M, 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.5 M, 1 M, 2 M 또는 5 M으로 존재할 수 있다.
대안적으로, 비미생물성 세포를 선택적으로 제거하는 대신에, 시험 분취액으로부터 미생물 세포를 양성으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 미생물의 정체가 알려진 경우 미생물 세포에 특이적으로 또는 선택적으로 결합할 수 있는 고정되거나 고정된 이중 리간드(친화도 결합 파트너)에 미생물 세포가 결합하여 이 미생물 세포를 선택할 수 있다.
시험 분취액으로부터 비미생물성 세포를 제거한 후(예를 들어, 용해시킨 후), 생성된 혼합물(예를 들어, 용해물)로부터 미생물 세포를 회수할 수 있다. 일 실시형태에서 분리 및 회수 단계가 하나이고 동일하게 보일 수 있지만(예를 들어, 선택적으로 시험 분취액으로부터 미생물 세포를 분리하거나 비미생물성 세포의 용해에 의해 회수를 수행하는 방식으로 본 방법을 수행할 수 있음), 바람직한 실시형태에서 별개의 단계로 용해물로부터 미생물 세포를 회수하고, 즉 용해 단계 후 샘플로부터 물리적으로 회수한다. 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 임의의 편리한 방식으로 이를 수행할 수 있다.
따라서, 샘플로부터 미생물 세포를 회수한 후, 회수된 세포를 재현탁하여 회수된 미생물 샘플을 제공한다. 미생물 세포 성장에 적합한 배양 배지를 사용하여 재현탁을 수행할 수 있거나, 대안적으로 완충액 또는 임의의 다른 적합한 배지를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 여과에 의해 샘플로부터 미생물 세포를 회수하고, 배양 배지를 사용하여 필터로부터 이 미생물 세포를 직접 재현탁시킨다. 유리하게는, 배양 배지 및/또는 용해된 포유동물 세포 잔해 및 단편과 같은 샘플의 임의의 다른 성분의 통과가 가능하게 하면서, 임의의 미생물 세포를 포획하기 위해 적합한 공경을 포함하는 필터를 사용하여 여과함으로써 회수를 수행할 수 있다. 선택적으로, 배양 배지 또는 용해 완충액에 대해 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 성분, 예를 들어 계면활성제를 포함하는 임의의 적합한 세척 완충액을 사용하여 필터에 회수된 미생물 세포를 여과한 후 세척할 수 있다. 필터 표면으로부터 세포를 재현탁시키기 위해 피펫팅을 반복하여 필터로부터 세포를 재현탁시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 미생물 세포를 재현탁시키기 위해 필터를 통해 액체(예를 들어, 배양 배지 또는 완충액)를 역류(즉, 여과액이 여과되는 방향과 반대 방향)시킬 수 있다. 대안적으로, 전체 필터를 사용함으로써 예를 들어 배양 배지를 필터에 첨가하거나 배양 용기에서 필터를 배양 배지와 접촉시킴으로써 미생물 세포를 회수할 수 있다.
대안적으로, 비미생물성 세포를 제거한 후 원심분리에 의해, 즉 현탁액으로부터 온전한 미생물 세포를 침전시켜 펠릿을 형성하여 미생물 세포의 회수를 수행할 수 있다. 생성된 상청액을 이어서 폐기할 수 있다. 미생물 펠릿을 추가 횟수로 상기 정의된 바와 같은 적합한 세척 완충액에 재현탁시키고 원심분리하여 펠렛을 형성할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 원심분리에 의해 얻은 미생물 세포의 펠렛을 재현탁시켜 단계 (a)의 샘플을 얻을 수 있다. 대안적인 구성방식은 미국 특허출원공개 US 7547526호에서와 같이 중공 섬유를 사용하여 미생물 세포를 회수하는 것이다.
미생물 세포를 재현탁시키기 위해 배양 배지를 사용할 때, 배양 배지는 대체로 말해서 AST 시험의 사용에 승인되거나 인정된 배양 배지이다. 바람직하게는, 배양 배지는 액체 배지이다. 따라서, 일 실시형태에서 이것은 뮬러-힌턴(MH) 배지 또는 까다로운 뮬러-힌턴(MHF) 배지 또는 양이온 조절된 뮬러 힌턴 배지(CAMHB)이다. 비표준 AST의 경우, 흔히 알려진 임의의 다른 배지를 본 발명과 사용할 수 있다. 표준 AST 결과를 생성하도록 '비표준' 배양 배지를 사용하여 AST 분석을 수행하여 얻은 MIC 값을 조정할 수 있다(상관시킬 수 있다).
미생물 세포를 회수하면, 예를 들어 샘플로부터 비미생물성 세포를 제거한 후 회수된 미생물 샘플을 얻으면, 본 발명의 방법에 따라 회수된 미생물 샘플에 존재하는 미생물 세포의 농도를 결정한다. 하나의 특정 실시형태에서, 상기에 언급된 바와 같이, 이는 특히 AST 분석을 수행할 목적을 위한 것일 수 있으며, 즉 AST 분석이 수행되기 전에 미생물의 농도를 결정할 수 있다.
유리하게는, 회수된 미생물 샘플을 사용하여 AST 분석을 수행하는 것은 보다 신속한 AST 분석이 수행되게 할 수 있다. 특히, 임상 샘플 또는 임상 샘플 배양물로부터 직접 미생물 세포를 회수하여 어떤 오염물질도 없는 균질한 샘플인 회수된 미생물 샘플을 얻는다.
특정 샘플, 예를 들어 특히 식품 또는 환경 샘플은 입자상 물질을 포함할 수 있는데, 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하기 전에 이 입자를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 특정한 상업적으로 입수 가능한 배양 용기(예를 들어, 혈액 배양 플라스크)에는 수지 비드가 제공되는데, 수지 비드는 배양물에서의 미생물 세포의 성장이 가능하도록 임상 샘플에 존재하는(즉, 피험체에게 투여되는) 임의의 항균제의 효과를 중화시킨다. 따라서, 바람직한 일 실시형태에서, 샘플에 존재할 수 있는 임의의 큰 입자를 제거하기 위해 샘플을 여과할 수 있다. 바람직하게는, 이 여과 단계는 시험 분취액으로부터 임의의 세포성 물질은 실질적으로 제거하지 않지만, 예를 들어 적어도 100, 200 또는 300 μm이지만 최대 1000 μm일 수 있는 입자는 제거할 수 있는 기공 크기를 갖는 필터를 이용할 것이다.
임의의 미생물의 농도를 결정하는 데 본 발명의 방법을 사용할 수 있다. 대체로 말해서, 임상적으로 관련된 미생물이 관련되지만, 미생물은 병원성이거나 비병원성일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 미생물이라는 용어는 "미생물"의 범주에 속할 수 있는 임의의 유기체를 포함한다. 미생물은 반드시 그런 것은 아니지만 단세포일 수 있거나 단세포성 생활 주기를 가질 수 있다. 미생물은 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으며, 일반적으로 박테리아, 고세균, 진균, 조류 및 특히 원생동물을 포함하는 원생생물을 포함할 것이다. 그람 양성 또는 그람 음성 또는 그람 불확정 또는 그람 비반응성일 수 있는 박테리아 및 진균, 예를 들어 효모가 특히 관심 있다.
박테리아는 호기성 또는 혐기성일 수 있지만, 특정 실시형태에서, 특히 본 발명의 AST 방법이 관련된 경우 박테리아는 호기성이다. 박테리아는 마이코박테리아이거나 이를 포함할 수 있다.
특히, 박테리아의 임상적으로 관련된 속은 스타필로코커스(Staphylococcus)(응고효소 음성 스타필로코커스 포함), 클로스트리듐(Clostridium), 에스케리치아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로피오니박테륨(Propionibacterium), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 레지오넬라(Legionella), 마이코박테륨(Mycobacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 푸소박테륨(Fusobacterium), 모락셀라(Moraxella), 프로테우스(Proteus), 에스케리치아, 클레브시엘라(Klebsiella), 아시네토박터(Acinetobacter), 버크홀데리아(Burkholderia), 엔테로코커스(Entercoccus), 엔테로박터(Enterobacter), 시트로박터(Citrobacter), 헤모필루스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 세라티아(Serratia), 스트렙토코커스(Streptococcus)(알파 용혈성 스트렙토코커스 및 베타 용혈성 스트렙토코커스 포함), 박테로이데스(Bacteriodes), 예르시니아(Yersinia) 및 스테노트로포마스(Stenotrophomas), 및 실제로 임의의 다른 장성 또는 대장균성 박테리아를 포함한다. 베타 용혈성 스트렙토코커스는 A군, B군, C군, D군, E군, F군, G군 및 H형 스트렙토코커스를 포함할 것이다.
그람 양성 박테리아의 비제한적인 예는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스(Staphylococcus haemolyticus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스타필로코커스 슐레이페리(Staphylococcus schleiferei), 스타필로코커스 카프레(Staphylococcus caprae), 스타필로코커스 뉴모니아(Staphylococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아갈락티에(Staphylococcus agalactiae), 스타필로코커스 피오제네스(Staphylococcus pyogenes), 스타필로코커스 살리바리우스(Staphylococcus salivarius), 스타필로코커스 생귀니스(Staphylococcus sanguinis), 스타필로코커스 안지노수스(Staphylococcus anginosus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 에쿠이누스(Streptococcus equinus), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 포함한다. 그람 음성 박테리아의 비제한적인 예는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 봉고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토필라(Stenotrophomonas maltophilia), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 박테로이데스 프라길리스(Bacteriodes fragilis), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)를 포함한다.
임상적으로 관련된 진균은 특히 속 칸디다(Candida)의 효모 및 속 에스페르길루스(Aspergillus), 후사리움(Fusarium), 페니실륨(Penicilium), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 크립토코커스(Cryptococcus), 콕시디오데스(Coccidiodes), 말라세지아(Malassezia), 트리코스포론(Trichosporon), 아크레모늄(Acremonium), 리조푸스(Rhizopus), 무코르(Mucor) 및 아브시디아(Absidia)의 진균을 포함할 수 있다. 칸디다 및 아스페르길루스가 특히 관심있다. 진균의 비제한적인 예는 에스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 듀블리엔시스(Candida dubliensis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis) 및 칸디다 크루세이(Candida krusei)를 포함한다.
임상적으로 관련된 원생동물의 비제한적인 예는 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 베스노이티아 베스노이티(Besnoitia besnoiti), 베스노이티아 베네티(Besnoitia bennetti), 베스노이티아 타란디(Besnoitia tarandi), 이소스포라 카니스(Isospora canis), 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella), 크립토스포리듐 파르붐(Cryptospotidium parvum), 햄몬디아 혜도르니(Hammondia heydorni), 톡소플라스모시스 곤디(Toxoplasmosis gondii), 네오스포라 캐니눔(Neospora caninum), 헵파토준 카니스(Hepatozoon canis), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아(Plasmodium malariae) 및 플라스모듐 놀레시(Plasmodium knowlesi)를 포함한다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 농도 결정 방법은 AST 분석을 수행하는 것과 관련하여, 특히 이에 대한 접종원에서 미생물의 농도를 결정하는 것과 관련하여 샘플 내의 온전한 미생물(및 따라서 생존 가능한 미생물)의 농도를 결정하는 데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 미생물의 항균제 감수성을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기에 개괄된 바와 같이 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 단계 및 AST 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 본 발명은, 임상 샘플 또는 임상 샘플 배양물로부터 시작하여, 임상 샘플 또는 임상 샘플 배양물로부터 생존 가능한 미생물을 회수(또는 단리)하는 단계, 회수된 미생물의 현탁액에서 온전한 미생물(및 그러므로 생존 가능한 미생물을 나타냄)의 농도를 결정하는 단계 및 선택적으로 현탁액으로부터 접종원을 제조하는 단계(현탁액 중 미생물 또는 이의 일부 또는 분취액의 농도를 조정하는 것을 포함할 수 있음)를 포함하는 방법을 제공할 수 있다. AST 분석에서 제조된 AST 미생물 시험 배양을 위한 접종원으로서 회수된 미생물의 현탁액 또는 이로부터 제조된 접종원을 사용할 수 있다.
하기에 추가로 기술된 바와 같이 임의의 편리하거나 원하는 방식으로 AST 분석을 수행할 수 있다. 따라서, 상이한 항균제(예를 들어, 항생제)의 존재 및/또는 항균제(예를 들어, 항생제)의 양 또는 농도 하에 미생물 성장을 평가할 수 있다(또는 결정할 수 있다). 성장을 직접 평가하거나 성장 마커를 평가하여(결정하여) 성장을 평가할 수 있다.
대체로 말해서, 미생물 성장에 대한 항균제의 효과를 모니터링하여 AST 분석을 수행한다. 상이한 농도의 항균제를 각각 포함하는 일련의 적어도 2개의 배양 용기에서 배양 배지를 접종하도록(즉, 적어도 2의 AST 미생물 시험 배양을 설정하도록) 미생물을 함유하는 샘플을 사용하고, 일정 기간 동안 미생물을 배양한다. 이러한 방식으로, 미생물 성장을 방지하기 위해 필요한 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위해 일련의 적어도 2의 상이한 농도의 항균제를 시험한다. 이렇게 얻은 MIC 값은 미생물이 개별 항균제에 내성인지 또는 감수성인지의 지표를 제공한다.
상이한 농도의 항균제를 포함하는 적어도 2개의 AST 미생물 시험 배양물을 접종하는 것 외에, AST 분석은 미생물이 생존 가능하고 AST 분석을 위해 제공된 성장 배지에서 성장할 수 있음을 확인하기 위해 양성 대조군 조건(항균제를 포함하지 않는 배양 배지) 및 성장 배지가 임상 샘플로부터 얻어지지 않은 미생물로 오염되지 않음을 확인하기 위해 음성 대조군 조건(미생물 배양물로 접종되지 않고 항균제를 포함하지 않는 배양 배지)을 가질 것이다. 따라서, 샘플에서의 미생물의 항균제 감수성을 결정하는 방법의 단계 (iii)은 일반적으로 적어도 2의 상이한 성장 조건 이외에 적합한 양성 대조군 조건 및 음성 대조군 조건을 설정하는 것을 포함할 것이다.
양성 대조군 샘플은 일부 실시형태에서 항균제의 제1 농도(즉, 0 M의 농도)를 제공하는 것으로 볼 수 있으며, 항균제를 포함하는 제2 조건만을 설정할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 항균제 감수성을 결정하기 위해 양성 대조군 조건 및 항균제를 포함하는 조건에서 성장을 평가할 수 있다. 따라서, "각각의 항균제가 2 이상의 상이한 농도에서 시험되는 적어도 2의 상이한 성장 조건"은 항균제가 단일 성장 조건에만 첨가되는 실시형태를 포함하는 것으로 볼 수 있고, 양성 대조군 조건은 항균제의 제2 농도를 나타낸다.
바람직한 양태에서, 1종 초과(즉, 2종 이상)의 상이한 항균제를 시험하여 각각의 상이한 항균제마다 하나씩 2개 이상의 상이한 MIC 값을 제공한다. 상이한 MIC 값의 조합은 주어진 미생물의 항균제 감수성 프로파일, 즉 미생물이 어떤 항균제 패널에 내성이 있는지와 미생물이 어떤 항균제 패널에 감수성인지를 제공한다. 시험되는 각각의 별개의 항균제에 대해 별개의 양성 대조군 조건 및 음성 대조군 조건을 설정할 수 있지만, 다수의 상이한 항균제가 시험되는 경우 필요한 경우 단일 양성 대조군 조건 및 단일 음성 대조군 조건으로 충분할 것이다.
당업계에 공지된 임의의 수단을 포함하여 임의의 원하거나 적합한 수단에 의해 AST 방법에서의 미생물 성장을 평가할 수 있다. 보다 구체적으로, 미생물 및/또는 미생물 콜로니 또는 응집체의 양 및/또는 수 및/또는 크기를 결정함으로써 미생물 성장을 평가할 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 특정한 바람직한 실시형태에서, 영상화에 의해 미생물 성장을 평가하거나(결정하거나), 대안적으로 미생물을 시각화함으로써 미생물 성장이 표현된다. 따라서, 성장을 결정하는 수단(또는 평가하거나 모니터링하는 수단)으로서 세포의 응집체 또는 덩어리(클러스터) 또는 미생물 콜로니를 포함할 수 있는 미생물 세포를 시각화하거나 영상화할 수 있다. 이는 세포 또는 콜로니의 계수를 포함할 수 있지만, 이러한 방법들로 제한되지는 않고, 미생물 세포, 콜로니 또는 응집체의 크기, 면적, 형상, 형태 및/또는 수를 평가(또는 결정)함으로써 미생물 성장의 양을 시각적으로 평가하는 임의의 수단을 포함한다("집합체"라는 용어는 물리적으로 근접한 임의의 세포 무리, 예를 들어 덩어리 또는 클러스터를 포함하고, 이는 응집하거나 함께 달라붙는 세포의 비클론성 덩어리/클러스터(예를 들어, 응집되는 이웃하는 세포) 및 클론성 콜로니를 포함할 수 있음). 미생물 성장을 측정하는 데 사용되는 매개변수는 사용된 항균제 및 미생물의 정체에 따라 달라질 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 실제로, 사용된 항균제 및 유기체에 따라, 세포의 형태 또는 성장 패턴은 영향을 받을 수 있고, 예를 들어 항균제의 부재 하에 "일반" 또는 "전형적" 형태 또는 성장 패턴에서 이는 변경되거나 변할 수 있다. 일부 AST 성장 모니터링 방법이 이러한 변화의 검출에 의존할 수 있지만, 본 발명에 따라 이러한 변화를 고려하는 것이 필수적이지는 않으며, 미생물 성장 또는 바이오매스의 양(예를 들어, 면적)을 형태 및/또는 성장 패턴에 상관없이 결정할 수 있다. 따라서, 사용된 항균제 및/또는 미생물 세포에 관계없이 동일한 성장 모니터링 방법을 사용할 수 있다. AST 분석을 수행하는 방법은 하기에 추가로 기술되어 있다.
본 발명은 샘플에서 온전한 미생물 또는 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 방법을 제공하며, 시험 미생물 배양물에서 특정 농도의 미생물 세포를 정확하게 제공하는 데 이 정보를 사용할 수 있다. 예를 들어, 단계 (iii)에서 시험 미생물 배양물을 접종하기 위한 접종원을 제공하기 위해, 일단 샘플의 적어도 일부에서 미생물의 농도를 결정하면 그 농도를 조정할 수 있다. 따라서, 샘플에서의 미생물 세포의 농도가 예를 들어 AST 분석에 사용하기에 적합한 범위 내에 있도록 선택적으로 또는 필요한 경우 이 농도를 조정할 수 있다. 이러한 조정은 모든 경우에 필요하지 않을 수 있고, 즉 단계 (iii)에서 설정된 일련의 시험 미생물 배양물을 직접 접종하는 데 샘플을 사용할 수 있다(즉, 샘플을 직접 사용할 수 있는데, 즉 어떤 추가 조정 없이 샘플을 사용할 수 있음). 대안적으로, 원하거나 미리 결정된 농도로 샘플(또는 샘플 분취액)을 조정할 수 있다. 추가로 대안적으로, 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하기 위해 샘플을 직접(즉, 조정 없이) 사용할 수 있고, 필요한 경우 원하거나 미리 결정된 농도로 시험 미생물 배양물 내의 미생물의 농도를 조정할 수 있다. 임의의 이러한 조정은 농도 결정 방법에서 결정된 생존 가능한 미생물의 농도(즉, 샘플 내의 미생물의 농도)에 기초할 것이다.
따라서, 샘플 또는 샘플의 일부 및/또는 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도를 조정할 수 있다. 보다 특히, 미생물 세포의 수 또는 농도를 증가시키거나 감소시키도록 그 농도를 조정할 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (iii)에서 시험 미생물 배양물을 접종하기 위한 접종원을 제공하도록 샘플의 적어도 일부에서 미생물 농도를 조정할 수 있다. 따라서, 예를 들어 접종원 내의 미생물 세포의 농도는 예를 들어 미생물 세포가 성장하게 하는 일정 기간 동안 샘플을 배양함으로써 증가하거나, 예를 들어 시험 미생물 배양물을 접종하기 전에 또는 시험 미생물 배양물을 접종하는 과정에서 희석에 의해, 예를 들어 고체(예를 들어, 동결건조된 항생제)에 첨가함으로써 또는 AST 시험을 위해 접종원의 일부 또는 분취액이 항생제 및/또는 배양 배지의 체적에 첨가될 때에는 희석에 의해, 시험 배양을 설정하는 데 사용되는 적절한 양(예를 들어, 체적)을 선택함으로써 감소할 수 있다. 따라서, 샘플(또는 샘플 분취액) 또는 샘플로부터 조정된 접종원(예를 들어, 희석된 접종원)으로 시험 미생물 배양물을 접종할 수 있다.
일 실시형태에서, 샘플이 AST 분석에 사용되기에는 너무 높은 미생물 농도를 포함하는 경우, AST가 수행되기에 적합한 수준으로 세포 밀도를 감소시키도록 적절한 완충액 또는 배양 배지(예를 들어, 액체 배양 배지)를 사용하여 미생물 배양물을 희석할 수 있다. 바람직하게는, AST 분석을 수행하기 위해 사용될 배양 배지를 사용하여 희석을 수행한다. 일 실시형태에서, 뮬러 힌튼(MH) 브로스를 사용하여 희석을 수행할 수 있다. 농도를 조정하는 것은 예를 들어 AST 방법의 단계 (ii)에서 결정된 농도에 기초한 희석을 포함할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 샘플이 AST 분석에 사용되기에는 너무 낮은 미생물 농도를 포함하는 경우, 샘플 안에 존재하는 미생물이 성장하고 그 수가 증가하게 하도록 일정 기간 동안 샘플을 배양할 수 있다(또는 추가 배양할 수 있다). 미생물의 농도가 AST 분석이 수행될 수 있는 충분히 높은 세포 밀도에 도달할 때까지(즉, 단계 (iii)), 연속적으로 또는 일련의 개별 시점에 샘플에 존재하는 미생물 세포의 농도를 모니터링할 수 있다. AST 분석 자체에서의 성장을 모니터링하기 위해, 예를 들어 세포 또는 콜로니를 영상화하거나 계수하기 위해 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 이 단계에서의 미생물 배양물의 성장을 모니터링할 수 있고/있거나, 성장기 후에 본 발명의 농도 결정 방법을 수행할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 AST 분석에 사용된 시험 배양물을 접종하기 위해 표준 미생물 농도(예를 들어, 0.5 McFarland 단위 또는 108 CFU/ml) 또는 그 영역의 농도를 갖는 접종원(예를 들어, 샘플 또는 희석된 샘플)을 사용한다. 표준 농도를 갖는 샘플을 얻기 위해 샘플에 존재하는 세포의 수에 따라 샘플에 존재하는 미생물 세포의 농도를 선택적으로 또는 필요한 경우 조정할 수 있고, 즉 증가하거나 감소할 수 있다. 대안적으로, 샘플에 존재하는 미생물 세포의 농도는 조정 단계를 수행할 필요 없이 표준 범위 내에 있을 수 있다. 어떻든지, 샘플에 존재하는 미생물 세포의 농도는 본 발명의 방법에 의해 결정되며, 표준 농도를 갖는 샘플을 얻는 것이 필요한 경우에는 그 필요한 대로 조정될 수 있다. 대안적으로, 샘플을 조정하지 않고 사용할 수 있고, 샘플에서 결정된 미생물의 농도에 기초하여 (예를 들어, 시험 배양을 설정하기 위한 적절한 희석 인자 또는 적절한 체적을 선택하여) 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도를 조정할 수 있다.
항균제에 대한 미생물의 반응이 샘플에서의 미생물의 농도뿐만 아니라 항균제 자체의 유형 및 농도에 따라 변하는 것으로 공지되어 있으므로, 하나의 샘플 또는 한 위치에서 얻은 결과를 다른 곳에서 얻은 것과 비교가 가능하도록 AST 분석은 일반적으로 정해진(또는 표준 또는 표준화된) 세포 밀도 또는 미생물 농도를 갖는 미생물 배양물을 사용한다. 항균제의 투여량 및 환자에게 처방된 치료 요법과 같은 임상 결과에 영향을 미치는 인자는 정해진 표준 기준에 따라 수행된 AST 분석에서 얻은 결과에 기초한다.
'비표준' 미생물 배양(또는 "표준화되지 않은" 미생물 배양)(미생물의 항균제 감수성 프로파일 또는 MIC 값의 세트)을 사용하여 수행된 AST 분석에서 얻은 결과는 표준 기준, 예를 들어 '표준' 미생물 배양에 따라 수행된 AST 검정에서 얻은 결과와 다를 수 있다. 그러나, AST 시험 배양물을 접종하는 데 사용된 샘플 또는 접종원에서의 미생물 세포의 농도가 알려지면 비표준 미생물 배양을 사용하여 얻은 MIC 값이 표준 미생물 배양을 사용하여 얻은 MIC 값과 다른 정도를 결정할 수 있다. 이에 의해 비표준 미생물 배양을 사용하여 얻은 MIC 값으로부터 이론적 '표준' MIC 값을 계산할 수 있다.
비표준 미생물 배양을 사용하여 얻은 MIC 값이 '표준' MIC 값과 다른 정도는 미생물 및 항균제의 성질에 따라 변할 수 있으며, 예를 들어 시험된 각각의 상이한 항균제 및 상이한 농도의 미생물 세포를 포함하는 미생물 배양물에 대해 개별적으로 이 정도를 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 비표준 농도의 미생물 세포를 포함하는 접종원을 사용하여 미생물의 항균제 감수성 프로파일을 결정하는 방법을 제공하고, 여기서 AST 분석이 수행되기 전에(즉, 샘플에서의 미생물 세포의 농도가 결정되기 전에) (간접적으로, 상기 시험 미생물 배양물을 접종하기 위해 또는 접종원을 제조하기 위해 사용된 샘플에서 미생물 세포의 농도를 측정하여) 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도를 측정하고, 미생물 세포로부터 제조된 시험 미생물 배양물에서의 미생물 세포의 농도에 기초하여 AST 분석에서 얻은 MIC 값을 조정하여 표준 MIC 값을 생성할 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 종래 기술의 방법에서 AST 시험 분석을 설정하는데 사용된 표준 접종원은 일반적으로 대략 0.5 McFarland 단위이다. 상기에 언급된 바와 같이, 이는 대략 108 CFU/ml에 해당한다. 이는 일반적으로 1:200 희석으로 희석되어 대략 5x105 CFU/ml를 포함하는 시험 미생물 배양물을 제공한다. 그러나, 본 발명의 방법이 이러한 표준 값을 사용할 수 있고, AST 시험에서 접종된 미생물 시험 배양물 내의 미생물의 농도는 4.5 x 105 ± 80% 또는 5 x 105 ± 60%의 범위인 것이 일반적으로 바람직하지만, 본 발명의 방법에서 AST 값을 얻기 위해 사용된 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도가 알려지면 접종원(예를 들어, 샘플 및 샘플로부터 제조된 접종원) 및/또는 시험 미생물 배양물이 임의의 규정되거나 미리 결정된 미생물 세포 농도를 포함할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태에서, AST 시험에서 접종된 미생물 시험 배양물 내의 미생물의 농도는 1 x 105 ± 80%, 또는 5 x 104 ± 80%, 또는 5 x 104 ± 60% 등의 범위일 수 있다.
따라서, 샘플에서의 미생물 세포의 농도는 AST 방법에서 미생물 시험 배양을 설정하기에 적합한 임의의 원하거나 미리 결정된 농도일 수 있다. 그러므로, 이것은 적어도 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 5 x 1010 또는 1011 CFU/ml일 수 있다. 바람직하게는, 샘플에서의 미생물 세포의 농도는 10 내지 1011, 102 내지 1011, 103 내지 1011, 104 내지 1011 CFU/ml, 105 내지 1011 CFU/ml, 106 내지 1011 CFU/ml, 107 내지 1011 CFU/ml, 5 x 106 내지 1011 CFU/ml, 2x106 내지 1011 CFU/ml, 106 내지 1011 CFU/ml, 5 x 106 내지 5 x 1010 CFU/ml, 2 x 106 내지 5 x 1010 CFU/ml, 또는 106 내지 5x1010 CFU/ml일 것이다.
낮은 농도의 미생물을 갖는 접종원을 사용하여 수행된 AST 분석의 통계 신뢰도는 접종원이 더 높은 농도의 미생물을 함유하는 실시형태에서보다 나쁠 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 특히 낮은 농도의 미생물이 샘플에서 결정되면, 그 단계에서 AST 분석을 계속하지 않는 것이 바람직하거나 유리할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 샘플에서의 미생물의 농도가 1 x 103 CFU/ml 미만 또는 보다 바람직하게는 1 x 104, 1 x 105 또는 1 x 106 CFU/ml 미만인 경우, AST 분석은 그 샘플과 수행되지 않을 수 있다(즉, 단계 (ii)를 지난 후에는 AST 방법이 수행되지 않음). 선택적으로, 농도 결정 방법이 반복되기 전에(예를 들어, 배양 기간 후에) 샘플에서 미생물의 농도가 증가하게 할 수 있고, 그 샘플이 이 후기 단계에서 충분히 높은 농도의 미생물을 함유하면 AST 분석으로 진행할 수 있다.
샘플에서 미생물 세포의 농도가 예를 들어 표준 농도보다 높은 수준으로 증가하게 하도록 상기 샘플을 일정 기간 동안 항온처리할 필요성을 피할 수 있기 때문에 샘플에서 미생물 세포의 농도가 표준 농도보다 낮으면 AST 시험에 비표준 농도가 사용되게 하는 본 발명의 AST 방법이 특히 유용하다.
비표준 미생물 배양을 사용하여 AST 분석을 수행함으로써 얻은 MIC 값을 조정함으로써 본원에 제시된 AST 방법은 미생물의 '표준' 항균제 감수성 프로파일을 결정하는 방법으로 여겨질 수 있다. 다른 방식으로 보면, 이는 AST 분석에 사용된 시험 배양물을 접종하여 미생물의 항균제 감수성을 계산하는 데 사용되는 미생물 세포의 농도를 조정하는 이론적인 방법을 제공한다.
본 발명에 사용된 시험 배양물을 접종하기 위해 비표준 샘플을 사용할 수 있지만, 대안적인 실시형태에서 본 발명은 표준 AST 분석이 수행될 수 있도록 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도가 표준 또는 표준화된 농도(예를 들어, 약 5 x 105 CFU/ml)에 해당하도록 샘플 및/또는 시험 미생물 배양물에 존재하는 미생물 세포의 농도를 물리적으로 조정하는 방법을 제공한다.
샘플 또는 샘플로부터 제조된 접종원을 사용하여 시험 미생물 배양물을 접종한다. 상기에 기술된 바와 같이, 배양 배지에 샘플을 첨가할 수 있고, 즉 시험 미생물 배양을 설정하는 단계(AST 방법의 단계 (iii))에서 샘플을 희석하거나 더 희석할 수 있다. 따라서, 시험 미생물 배양물이 임의의 원하거나 미리 결정된 농도를 포함하도록 이 시점에 이 배양물을 조정할 수 있다. 따라서, 시험 미생물 배양물은 적어도 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109 CFU/ml, 바람직하게는 102 내지 108, 103 내지 107 또는 104 내지 106 CFU/ml의 초기 농도의 미생물 세포를 포함할 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, 따라서 5 x 104 ± 80%, 1 x 104 ± 80%, 4 x 105 ± 80%, 4.5 x 105 ± 80% 또는 5 x 105 ± 80%의 최종 농도로 시험 미생물 배양을 설정할 수 있다.
그러나, '표준' 샘플을 구성하는 것이 미생물의 정체에 따라 달라질 수 있으며, 즉 샘플에 존재하는 미생물 세포의 농도가 미생물의 정체에 의존할 수 있음에 유의한다. 바람직하게는, 샘플에서의 미생물 세포의 농도는 10 내지 1011, 10 내지 1010, 10 내지 109, 102 내지 109, 103 내지 109, 104 내지 109 CFU/ml, 105 내지 109 CFU/ml, 106 내지 109 CFU/ml, 107 내지 109 CFU/ml일 것이다.
AST 분석을 위해 인정되고 규정된 조건이 존재하며, 쉽게 비교 가능한 결과를 얻을 수 있어 다른 실험실에서 수행된 시험과 비교 가능하거나 비교될 수 있도록 이 조건을 따라야 할 수 있다.
이는 예를 들어 규정된 배지 및 배양 조건의 사용을 수반할 수 있다. 특정 실시형태에서, 미생물 배양용 배지는 액체 배지일 수 있으며, 즉 배양 배지는 액체일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상이한 미생물의 성장을 위해 상이한 배지를 동시에 갖는 시험 미생물 배양을 설정하는 것이 유리하거나 바람직할 수 있다. 예를 들어, 샘플에서의 미생물의 정체가 알려지지 않거나 성장 패턴 또는 요구사항이 완전히 특성규명되지 않은 경우에 이는 유용할 수 있다. 따라서, 예를 들어 성장 배지에서 까다로운 보충제를 함유하거나 함유하지 않거나, 바꾸어 말하면 까다로운 배지 또는 까다롭지 않은 배지에서 아주 유사한 시험 미생물 배양물을 함유하거나 함유하지 않는, 아주 유사한 미생물 시험 배양을 AST 방법에서 설정할 수 있다. 까다로운 배지는 당업계에 널리 공지되어 있고, 미리 제조된 까다로운 배지와 까다로운 보충제 둘 모두는 광범위하고 상업적으로 입수 가능하다. 까다로운 보충제는 예를 들어 용해된 혈액 제제(예를 들어, 용해된 말 혈액), 혈청, 다양한 비타민 및/또는 미네랄, 보인자 등, 예를 들어 베타-니코틴아미드를 포함한다. 편리하게는, 배양 배지에 희석 프로토콜의 일부로 까다로운 보충제를 첨가할 수 있다. 추가로, 까다로운 배지 또는 보충제가 사용되는지 또는 아닌지는 샘플에 대해 결정된 미생물 세포의 농도에 의존할 수 있다. 예를 들어, 농도가 낮은 경우, 예를 들어 샘플에서 미생물 세포가 2x106 CFU/ml 미만인 경우, AST 방법에서 까다로운 배지/보충제를 갖는 미생물 시험 배양물의 사용을 생략할 수 있다.
특정 실시형태에서, 특정 항균제에 대한 감수성을 시험하기 위해 최적화된 상이한 배지를 동시에 갖는 시험 미생물 배양을 설정하는 것이 또한 유리할 수 있다. 시험 미생물 배양물에 특정 항생제에 필요한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 시험 미생물 배양물에 폴리소르 베이트 80을 포함할 수 있고/있거나, 증가된 칼슘 농도를 제공할 수 있다.
주어진 항균제에 대한 미생물의 감수성을 결정하기 위해 다양한 항균제의 존재 하에 미생물을 성장시킬 수 있다. 미생물의 정체가 알려진 경우에는 그 정체 및 바람직하게는 또한 미생물 내에서 확인된 임의의 유전적 항균제 내성 마커의 성질에 기초하여 항균제를 선택할 수 있다. 현재 허가되거나 인정된 선택 항균제 치료에 대한 미생물의 감수성을 평가할 수 있도록, 사용될 항균제 및 양은 또한 현재의 임상 실무에 따라 선택될 수 있는데, 예를 들어 확인된 미생물을 치료하기 위해 어떤 항균제가 현재 사용되는지에 따라 선택될 수 있다.
따라서, 내성 마커의 존재에 기초하여 내성이 예상될 수 있는 임의의 물질을 배제하고 확인된 미생물에 대해 효과적인 것으로 공지된 것들 또는 현재 미생물을 치료하기 위해 실제로 사용되는 것들에 기초하여 항균제를 선택할 수 있거나, 이 항균제를 포함할 것이고, 내성 마커의 존재에도 불구하고 효과적일 수 있는 항균제의 양 또는 농도의 결정이 가능하게 하도록 사용될 양을 선택할 것이다. 항균제를 배양 배지에 첨가하여 최종 농도 또는 양의 범위가 된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 항균제의 희석을 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구성방식에서, 항균제를 용해한 후 미리 결정된 농도를 산출하기 위해 AST 전에 박테리아와 함께 배양 배지를 첨가한 웰에 미리 결정된 양의 항균제를 미리 침적시킨다. 미리 침적된 항균제는 바람직하게는 동결 건조 제제이다.
AST 분석에서 샘플/샘플로부터의 미생물을 성장시키거나 배양하는 단계는 임의의 공지되거나 편리한 수단에 의해 발생할 수 있다. 고체 또는 액체 배양물을 사용할 수 있다.
따라서, 예를 들어 바람직한 일 실시형태에서, 플레이트 또는 다른 고체 배지 상에 또는 내에, 또는 항균제를 함유하는 액체 배지를 함유하는 용기(예를 들어, 플레이트의 웰) 내에 미생물을 배양할 수 있고, 미생물의 시각화(예를 들어, 영상화)(즉, 플레이트의 영상화 등)에 의해 미생물 성장을 결정할 수 있다. 따라서, 성장을 모니터링하거나 평가하기 위한 수단으로서 배양물을 직접 시각화하거나 영상화한다. 따라서 바람직한 일 실시형태에서, 성장을 모니터링/평가하기 위해 배양물을 직접 분석한다. 예를 들어, 배양물을 플레이트의 웰에서 성장시킬 수 있거나, 담체 기질의 구획 및 웰/구획을 영상화할 수 있다.
대안적으로, AST 시험 배양물에서 간격으로 또는 상이한 시점에 샘플(또는 분취액)을 제거할 수 있고(또는 채취할 수 있고), 미생물 성장에 대해 이 제거된 샘플(분취액)을 분석할 수 있다. 예를 들어 핵산 기반 시험과 같은 예를 들어 분자 시험을 포함하는 임의의 수단에 의해 이를 수행할 수 있다. 따라서, 미생물 세포 또는 미생물 세포로부터 방출되거나 분리된 성분에 결합하는 검출 프로브 및/또는 프라이머를 사용할 수 있다. 이는 예를 들어 미생물 DNA에 혼성화할 수 있는 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 하기에 보다 상세하게 기술된 바와 같이 예를 들어 염색에 의해 미생물 세포를 직접 검출할 수 있다.
추가의 시험 분취액의 부재 하에서 배양되는 적어도 하나의 음성 대조군뿐만 아니라 임의의 항균제의 부재 하에서 미생물이 성장하게 하는 양성 대조군에 추가하여 적어도 2의 농도로 각각의 항균제를 사용한다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 이상의 농도의 항균제를 사용한다. 희석 시리즈에 사용된 농도는 각각의 농도 사이에 2배 다를 수 있다.
항균제라는 용어는 미생물을 사멸시키거나 미생물의 성장을 억제하는 임의의 제제를 포함한다. 본 발명의 항균제는 특히 항생제 및 항진균제를 포함할 수 있다. 항균제는 살균성 또는 정균성일 수 있다. 진균에 활성인 항생제, 또는 특히 진균의 군을 포함하는 다양한 상이한 부류의 항생제가 공지되어 있으며, 이들 중 일부 또는 전부를 사용할 수 있다. 항생제는 베타 락탐 항생제, 세팔로스포린, 폴리믹신, 리파마이신, 리피아르마이신, 퀴놀론, 설폰아미드, 마크롤라이드, 린코사미드, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 사이클릭 리포펩티드, 글리실사이클린, 옥사졸리디논, 리피아르마이신 또는 카르바페넴을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 항진균제는 폴리엔, 이미다졸, 트리아졸 및 티아졸, 알릴아민 또는 에키노칸딘을 포함할 수 있다. 지속적으로 항균제를 개발하고 있으며, 또한 본 발명에 의해 미래의 항균제를 분석할 수 있는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 시험 미생물 배양물 중 적어도 하나는 까다로운 배지를 포함한다. 보다 바람직하게는, 적어도 2의 시험 미생물 배양물, 예를 들어 상이한 농도의 동일한 항균제를 포함하는 적어도 2의 상이한 성장 조건이 까다로운 배지를 포함할 수 있어 특정 항균제에 대한 미생물의 항균제 감수성이 까다로운 성장 조건 하에 있다.
샘플로부터 미생물을 배양하고 다양한 시점에 걸쳐 AST 배양물을 분석함으로써 항균제 감수성을 결정할 수 있다.
미생물 성장을 모니터링하도록 다수의 시점에 AST 배양물을 분석할 수 있다. 예를 들어, 배양 개시 후 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간의 시점에 배양물을 분석할 수 있다. 배양 개시 후(여기서, t = 0임) 배양물을 분석할 수 있다. 배양 개시 후 24시간을 넘는 시점에 배양물을 분석할 수도 있다. 일반적으로 배양 개시 후 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간 및 24시간에 배양물을 분석할 수 있다. 그러나, 하기에 실시예에서 얻어지고 보고된 결과는 4시간과 같은 짧은 항온처리 시간이 미생물 성장 차이를 검출하기에 충분할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 최대 8시간, 7시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간 또는 2시간의 더 짧은 총 항온처리 시간을 또한 사용할 수 있고, 예를 들어 매시간 또는 2시간마다 또는 90분마다 분석할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 일반적으로 2 이상의 시점, 예를 들어 최대 4시간, 5시간 또는 6시간의 배양의 2 이상의 시점에 배양물을 분석한다. 특정 실시형태에서, 보다 빈번한 시점에 AST 배양물을 분석할 수 있다. t = 0에 배양물을 분석할 수 있고, 후속하여 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분의 간격으로 분석할 수 있다. 따라서, 이러한 짧은 분석 간격이 사용될 때 필요한 총 항온처리 시간은 또한 유리하게는 감소할 수 있고, 이에 따라 최대 10분, 15분, 20분, 25분, 30분 또는 60분의 더 짧은 항온처리 시간을 사용할 수 있다.
일정 기간(예를 들어, 최대 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간)에 걸쳐 연속하여 또는 간격으로 성장을 모니터링함으로써 또는 AST 성장 배양(시험 미생물 배양)이 개시될 때(t0)의 미생물 세포 물질의 양을 나중의 시점(예를 들어, 최대 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간), 즉 개재 시간에 발생하는 성장에서의 미생물 세포 물질의 양과 비교함으로써 AST 분석에서 미생물 성장을 모니터링하거나 평가할 수 있다. 대안적으로, 2 이상의 상이한 시점에 미생물 세포 물질의 양을 결정할 수 있고(예를 들어, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25 또는 30분 또는 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 후 제1 시점을 측정하고, 제1 시점 후 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분 또는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 또는 7시간, 또는 배양 개시 후 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분 또는 55분, 또는 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간의 제2 시점을 측정함), 그렇게 하여 성장의 양을 결정할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 1 초과의 시점, 즉 적어도 2의 시점에 미생물 성장의 정도를 결정할 수 있다.
다른 실시형태에서, 항균제의 존재 하에 성장한 시험 미생물 배양물과 항생제의 부재 하에 성장한 시험 미생물 배양물(예를 들어, 양성 대조군)에서 오직 1 시점에, 예를 들어 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간에 성장을 평가한다. AST 성장 배양의 개시 후 한 시점(또는 2 이상의 시점)에서 성장을 모니터링하는 것은 유리하게는, 이 기간 동안 상이한 조건에서의 미생물 성장 간의 임의의 차이가 작아서 검출하기 어려우므로, 미생물 성장의 지연 단계 동안 성장의 측정을 피함으로써 보다 정확한 결과가 달성되게 할 수 있다. 이 방법에 따라 30분 또는 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 후에 제1 측정을 할 수 있고, 제1 시점 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간 또는 8시간에 제2 측정을 할 수 있다.
그러나, 특정 미생물, 예를 들어 특정 혐기균, 마이코박테리아 또는 진균의 경우, 미생물 성장이 덜 빠를 수 있고, 그러므로 더 긴 기간 동안 AST 분석을 수행할 필요가 있을 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간 또는 12시간 이상, 예를 들어 12시간, 18시간 또는 24시간 동안 미생물 성장을 측정함으로써 AST 분석을 수행하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 1 이상의 시점에 적절한 측정을 따라서 수행할 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 각각의 성장 조건에서의 미생물 세포의 초기 숫자(양 또는 농도)에 대해 적어도 2의 성장 조건(예를 들어, 각각의 성장 조건)에서 성장을 측정할 수 있다.
시험 미생물 배양물의 배양은 미생물 성장을 촉진하는 임의의 온도, 예를 들어 약 20℃ 내지 40℃, 또는 20℃ 내지 37℃, 바람직하게는 약 25℃ 내지 37℃, 보다 바람직하게는 약 30℃ 내지 37℃ 또는 30 내지 35℃에서 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 약 35℃에서 AST 배양물을 배양할 수 있다.
미생물 성장을 모니터링하고 평가하기 위한 많은 방법이 공지되어 있으며, 예를 들어 탁도 측정, 비색 결정, 광 검출, 광 산란, pH 측정, 분광 측정, 항생제 또는 미생물의 분해 산물의 형광 검출 측정, 핵산 함량의 측정 또는 CO2와 같은 기체의 생성의 측정을 포함하여 AST 분석에 사용된다. 이들 중 어느 것도 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 영상화 방법에 의해 미생물 세포의 수 및/또는 양 및/또는 크기 및/또는 면적을 결정하거나 평가하여 성장을 검출하고 평가할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 미생물 세포는 콜로니 및/또는 응집체의 세포를 포함할 수 있다. 미생물을 측정하거나 검출하는 것으로 공지된 임의의 방법에 의해 항균제의 존재 하에 성장 전에 및/또는 후에 존재하는 미생물의 수 또는 양을 평가하거나 결정하여 이를 달성할 수 있다. 이러한 결정은 미생물 세포, 응집체 및/또는 콜로니의 수 및/또는 크기를 결정하는 것을 수반할 수 있다. 거듭하여, 이것에 대한 기법이 공지되어 있으며 이용 가능하다. 따라서, 시간에 따른 미생물 및/또는 미생물 세포 및/또는 콜로니 및/또는 응집체의 수 및/또는 양 및/또는 크기를 모니터링함으로써 성장을 측정할 수 있다. 직접적으로 또는 간접적으로 성장을 측정할 수 있다. 혈구 계산법, 유세포 분석법 또는 자동 현미경에 의해 미생물의 수 또는 양을 직접 측정할 수 있다. 검출 전에 미생물을 고정하고/하거나 투과시킬 수 있다. 대안적으로, 생체내 조건 하에 미생물을 검출할 수 있다.
유세포 분석법을 사용한 박테리아 세포수 모니터링에 의해 AST 분석을 하는 방법은 문헌[Broeren et al., 2013, Clin. Microbiol. Infect. 19. 286-291]에 기재되어 있다. 다채널 유체 카세트에서 자동화 현미경검사에 의해 박테리아가 성장하고 열거되는 AST 분석을 수행하는 방법은 문헌[Price et al. 2014, J. Microbiol. Met. 98, 50-58] 및 문헌[Metzger et al., 2014. J. Microbiol. Met. 79, 160-165]에 기재되고, Accelerate Diagnostics(예를 들어, 국제공개 WO 2014/040088 A1호, 미국 특허출원공개 US 2014/0278136 A1호 및 US 8,460,887 B2호 참조)에 의해 기재되어 있다. 이들 방법에서, 박테리아는 표면에 고정되어 성장하고, 2 이상의 시점에서 표면을 영상화함으로써 개별 박테리아 및/또는 콜로니를 생존력 및/또는 성장에 대해 평가한다(콜로니 성장을 측정하는 것을 포함). 본 발명에 따라 이러한 방법을 사용할 수 있다. 공지된 다른 방법은 문헌[Fredborg et al, J Clin Microbiol. 2013 Jul;51(7):2047-53], 및 Unisensor의 미국 특허(US 8780181호)에 의해 기술된 바와 같고, 상기 특허에서 용액의 일련의 적층된 영상(객체 평면)을 취하고 샘플에 존재하는 박테리아를 계수함으로써 명시야 현미경검사를 이용하여 용액 중에 박테리아가 영상화된다.
미생물 성장을 모니터링하기 위한 영상화의 사용에 기초한 임의의 방법을 사용할 수 있지만, AST 시험 단계(AST 방법의 단계 (iv))에서의 본 발명의 방법은 바람직하게는 개별 세포의 계수 또는 개별 세포 또는 콜로니의 성장의 모니터링(예를 들어, Accelerate Diagnostics Inc.의 방법에 따라 예를 들어 개별 세포 또는 콜로니의 크기의 증가의 모니터링)에 의존하지 않는다. 따라서, 본 발명은 AST 배양물 또는 AST 배양 샘플을 영상화하기 위해 고정된 위치를 사용하는 것에 제한되지는 않는다(그리고 바람직한 실시형태에서 이를 수반하지 않음). 오히려, 본 발명에 따르면 예를 들어 시야에서 벌크 셀을 영상화함으로써 AST 배양물에서 세포의 벌크 성장을 모니터링하는 것이 바람직하다. 시야에서의 미생물 세포 물질(바이오매스)의 양(예를 들어, 면적)을 영상화하여 결정할 수 있다. 예를 들어 명시야 현미경검사를 사용하여 세포/미생물 바이오매스를 직접(예를 들어, 현미경 또는 카메라 등에 의해) 검출할 수 있거나, 예를 들어 미리 결정되거나 필요한 성장 기간 후에 AST 배양물 또는 배양 샘플에 염색제를 첨가함으로써 검출을 위해 미생물 세포를 염색할 수 있다.
따라서, 미생물 시험 배양물에서의 성장을 평가하는 단계 (iv)에서, 바람직하게는 영상화에 이용 가능한 배양물의 많은 부분(중요하거나 상당한 부분)에 걸쳐 시험 배양물을 영상화함으로써 이를 수행한다. 더욱이, 단계 (iv)에서 영상화를 위한 시험 배양물의 집단 또는 일부를 미리 선택하지 않고 영상화를 수행할 수 있다. 액체(브로스) 배양물의 경시적 영상을 생성할 수 있다.
추가의 특정 실시형태에서, 미생물 세포를 고정하지 않거나, 영상화를 위해 그 세포를 검출 위치 또는 표면에 국재화시키도록 그 세포를 표면에 데려가거나 능동적으로 수송하지 않고서, 예를 들어 전기영동과 같은 힘을 가하지 않고서 AST 배양물을 직접 영상화하거나 시각화할 수 있다.
이러한 영상화 방법에서, 당업계에 널리 공지된 방법 및 원리에 따라 영상으로부터 미생물 성장의 양에 대한 값을 결정하기 위해 알고리즘을 적용할 수 있다. 따라서, 영상에서 미생물 세포 물질/바이오매스의 수, 크기 및/또는 면적(예를 들어, 영상/시야에서의 모든 미생물 세포 물질의 양, 예를 들어 영상화된 총 세포 물질)에 기초하여 미생물 세포의 영상에 통계 방법을 적용할 수 있다. 배양물에 존재하는 미생물 및 항균제의 정체에 기초하여 상이한 성장 패턴 및/또는 형태를 고려하여 알고리즘을 작성할 수 있다. 샘플에서의 미생물 바이오매스의 양 및 이에 따른 미생물 성장을 측정하는 데 사용하기 위한 스레시홀딩과 텍스처 필터링을 조합한 예시적인 영상 분석 알고리즘은 동시 계류 중인 국제공개 WO 2017/216312호에 기재되어 있고, 본 발명의 AST 방법에서 미생물 성장을 평가하는 데 이 방법을 사용할 수 있다. 이러한 계수 또는 영상화 방법은 AST 분석에서 미생물의 디지털 표현형 분석이 가능하게 한다. 이러한 디지털 표현형 결정이 기준 기법(예를 들어, 마이크로브로스 희석)과 유사한 MIC 값을 산출한다는 것을 보여주는 데이터를 얻었다.
이러한 방법을 사용하는 것의 특별한 장점은 광범위한 농도 또는 양의 미생물을 포함하는 시험 미생물 배양물에 대해 항균제 감수성 시험을 수행할 수 있고, 항균제 감수성 시험을 수행하기 전에 표준화된 미생물 역가를 사용할 필요가 없다는 점이다. 본 발명의 유용한 특징은 상이한 농도의 미생물을 사용하는 능력이다. 본 발명의 방법에 적어도 103 CFU/ml를 포함하는 시험 미생물 배양물 또는 샘플을 사용할 수 있고, 예를 들어 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 또는 1011 CFU/ml를 포함하는 샘플(AST 시험 샘플)을 사용할 수 있다. 대안적으로, 103 CFU/ml 미만, 예를 들어 적어도 102 CFU/ml를 포함하는 시험 미생물 배양물 또는 샘플을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 102 CFU/ml 미만을 포함하는 시험 미생물 배양물 또는 샘플을 사용할 수도 있다.
명시야 영상화가 시험 미생물 배양에서 미생물 세포의 농도를 분석하기 위한 하나의 구성방식을 나타내지만, 본 발명의 일 실시형태에서, AST 시험 배양물에서 미생물의 수 또는 양을 결정하기 전에 미생물을 염색하는 마커(즉, 염색제 또는 염료)를 첨가함으로써 또는 예를 들어 파지 대조 또는 샘플에서 박테리아의 수를 정량화하기 위한 당업계에 공지된 임의의 다른 방법과 같은 미생물의 고유 특성을 이용하는 방법에 의해 미생물을 검출할 수 있다. 적합한 염색제는 미생물을 시각화하는 수단으로서 유색 또는 형광 염료, 예를 들어 그람 염색 또는 펩티도글리칸에 대한 다른 염색 또는 DNA 염색을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 특정 실시형태에서, Vybrant® DyeCycleTM을 사용하여 미생물 내의 DNA를 염색할 수 있다. 다른 DNA 염색제는 널리 공지되어 있으며 이용 가능하다. 실제로, 박테리아를 염색하기 위해 당업계에서 이용 가능한 염색제의 수는 막대하고, 표준 참고 문헌을 포함하여 많은 수의 이러한 염색제가 문서화되어 있으며, 예를 들어 Life Technologies로부터 상업적으로 입수 가능하다. 염색에 의해 미생물을 직접 표지하는 것은 수행하기 쉽고 편리하며 비용 효과적이며 따라서 바람직한 실시형태를 나타낸다.
따라서, 예를 들어 미량적정 플레이트의 웰에서 AST 분석을 위해 미생물이 성장할 수 있고(즉, 각각의 시험 미생물 배양물은 플레이트의 웰에 있을 수 있음), 성장 기간의 종료 시에 염료 또는 염색제를 첨가할 수 있고, 플레이트 웰을 영상화할 수 있고, 예를 들어 미생물 세포, 응집체 또는 콜로니의 수 및/또는 크기를 결정하여, 예를 들어 계수하거나 영상화하여 미생물 또는 미생물 세포 물질의 수 또는 양을 평가할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 미국 특허출원공개 제61/979319호에 기술된 바와 같이 유세포 분석기 또는 유사한 유형의 기구, 예를 들어 스웨덴 소재의 Q-linea AB의 Aquila 400 기구를 사용하여 미생물을 열거할 수 있다.
영상을 분석하고 미생물 바이오매스의 양 등에 대한 값을 도출하거나 얻을 수 있는 영상 분석을 위한 알고리즘이 당업계에 널리 공지되어 있으며 이용 가능하다. 상기에 언급된 바와 같이, 하나의 이러한 영상 분석 기술은 국제공개 WO 2017/216312호에 기재되어 있고, 이는 AST 시험에서 미생물 성장을 평가하고 결정하기 위한 바람직한 수단을 나타낸다.
샘플에서 미생물에 대한 1종 이상의 항생제에 대한 MIC 값을 도출하기 위해 추가의 알고리즘을 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 미생물의 확인이 AST 시험을 설정하는 것을 도울 수 있지만, 이것이 본 방법의 전제 조건은 아니며, 본 방법이 수행되거나 설정될 때 미생물 ID를 알 필요는 없다. 따라서, 시험 결과의 속도의 면에서, 샘플에서의 미생물의 정체(ID)가 알려지지 않을 때 AST 방법을 시작할 수 있지만, 예를 들어 AST 미생물 시험 배양물을 영상화할 때 그리고/또는 영상화의 결과를 분석할 때 결과의 해석에 ID를 사용할 수 있다. 미생물 ID 없이 MIC 값을 얻을 수 있지만, 미생물에 대한 SIR(감수성/중간/내성) 정보를 결정하거나 해석하는 데 ID 정보가 중요하다. 영상화 분석으로부터 얻은 성장 데이터로부터 MIC 및/또는 SIR 정보를 도출하거나 얻기 위한 데이터 처리 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 이용 가능하다.
대안적인 실시형태에서, 미생물 내의 또는 미생물 상의 생물학적 특징부(biological feature)를 통해 미생물을 특이적으로 표지할 수 있다. "생물학적 특징부"는 예를 들어 미생물 내의 또는 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 상에 발현되거나 위치한 단백질 또는 다른 생체분자일 수 있다. 예를 들어, 유색 또는 형광 표지와 같은 표지는 특정한 생물학적 특징부에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 다른 친화도 결합 분자에 커플링될 수 있다. 일 실시형태에서, 단백질은 렉틴, 에피바디(affibody) 또는 항체, 또는 항체 단편일 수 있다. 이전에 기술된 바와 같이 이러한 방식으로 표지된 미생물을 검출하거나, 예를 들어 열거할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 미생물 내의 또는 미생물 상의 특정한 생물학적 특징부를 검출하는 데 근접 프로브를 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 대안적인 실시형태에서, 자물쇠 프로브(padlock probe) 및 RCA 기반 증폭된 단일 분자 검출(ASMD: amplified single molecule detection) 방법을 사용하여 시험 미생물 배양물에서의 미생물을 검출하고 열거할 수 있다. 이러한 방법은 단일 미생물 세포가 검출되고 계수되게 한다. 따라서, 자물쇠 프로브의 결합에 의해 미생물을 검출할 수 있고, 원형화된 자물쇠 프로브의 RCA를 통해 생성된 증폭된 신호에 의해 미생물의 수를 간접적으로 측정할 수 있다. 각각의 RCA 산물(방울)은 단일 미생물을 나타낼 수 있다. 미생물을 용해시킬 수 있고, 미생물의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하도록 설계된 자물쇠 프로브를 사용할 수 있다. 이는 DNA를 분리하는 단계, 바람직하게는 미생물 DNA를 선택적으로 분리하거나 농후화하는 단계를 포함할 수 있다. AST 분석에서 시험 미생물 배양물은 보통 초기 샘플보다 덜 복잡하기 때문에, 예를 들어 미생물을 분리시키기 위한 여과 및 미생물 세포 용해 또는 단순히 직접적인 미생물 세포 용해를 포함하여 미생물 DNA를 분리하거나 농후화하기 위한 단순화된 프로토콜을 사용할 수 있다.
대안적으로, 미생물 상에 또는 용해된 미생물 내에 존재하는 하나 이상의 분자에 결합하는 친화도 결합 분자를 사용할 수 있고, 이러한 친화도 프로브에는 자물쇠 프로브가 혼성화할 수 있는, 즉 면역RCA 검출 절차와 유사한 핵산 표지 또는 태그가 제공된다. 유사하게, 근접 프로브가 미생물 내의 또는 상의 표적에 결합하도록 근접 프로브를 사용할 수 있고, 자물쇠 프로브의 결찰을 주형화하고 선택적으로 또한 RCA에 의해 이의 증폭을 프라이밍하는 데 근접 프로브의 핵산 도메인을 사용할 수 있다. 이에 대한 절차는 널리 공지되어 있으며 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Dahl et al, 2004, PNAS USA, 101, 4548-4553] 및 국제공개 WO 03/012199호에 기술된 바와 같은 환-대-환 증폭(C2CA: circle-to-circle amplification)을 신호 증폭에 사용할 수 있다. 따라서, 블로브(blob)의 수를 계수함으로써 샘플에서 미생물의 수를 추정할 수 있고, 샘플 내에 있는 '블로브'를 상기에 기술된 바대로 표지할 수 있는데, 예를 들어 형광 표지할 수 있다. 이는 따라서 디지털 표현형 감수성 판독 출력을 얻기 위한 다른 편리한 수단을 제공한다.
이것은 대체로 말해서 시험 중인 미생물 배양물이 순수하도록, 즉 단일 미생물이 존재하도록 AST 분석을 수행하는 데 있어서 유리하다. 그러나, 이것은 필수 특징이 아니고, AST 분석을 수행하기 위한 시각화 또는 영상화를 기반으로 미생물 검출 방법, 예를 들어 용액에서가 아니라 표면 상의 박테리아의 영상화를 사용하는 Accelerate Diagnostics에 의해 제공된 바와 같은 방법, 또는 실제로 유체 시스템, 예를 들어 상기에 기재된 문헌[Price et al. 2014, J. Microbiol. Met. 98, 50-58] 및 문헌[Metzger et al., 2014. J. Microbiol. Met. 79, 160-165]에서의 자동화 현미경검사 유체 카세트 기반 시스템에서 표지된 미생물이 검출되는 방법을 사용할 수 있다. 하나 초과의 미생물을 함유하는 샘플의 AST 분석에 임의의 세포별 검출, 또는 형상 인식 및/또는 식별 방법을 사용할 수 있다. 상이한 미생물이 동일한 항생제에 의해 다르게 영향을 받을 수 있고, 따라서 특정 항생제로 처리할 때 공동 배양물에서 각각의 미생물에 대한 확인 및 AST 결정을 위해 유기체의 모습을 사용할 수 있다고 추가로 알려져 있다.
편리하게는, 본 발명의 방법을 자동화할 수 있다. 임의의 하나 이상의 단계들, 바람직하게는 단계 (a) 내지 단계 (e) 중 임의의 단계 또는 모든 단계를 자동화할 수 있다. 상기에 기재된 다양한 특정한 또는 바람직한 단계는 자동화, 예를 들어 본 발명의 농도 결정 방법에서 분취액을 염료와 접촉시키는 것 및/또는 샘플 분취액을 희석하는 것, 및/또는 분취액/염색제 혼합물을 영상화하는 것뿐만 아니라, 샘플로부터의 미생물의 AST 분석 및 회수에 매우 적합하다. 혈액 배양 방법을 포함하여 자동 배양 방법이 이미 개발되었으며, 이들은 예를 들어 본 발명에 따라 사용하기 위한 자동화 농도 결정 및/또는 AST 분석과 이 방법을 조합할 수 있다. 자동화는 조작 속도 및 조작 용이성과 함께 멀티플렉싱 능력의 이점을 제공할 것이고, 이는 임상 실험실 환경에서 중요하고, 특히 패혈증의 진단에 중요하다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 장치로 확장된다. 따라서, 추가의 양태에 따르면, 본 발명은 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 측정하기 위한 장치를 제공하고, 상기 장치는,
a. 미생물을 함유하는 샘플을 수용하기 위한 용기;
b. 샘플로부터 샘플 분취액을 배출시키기 위한 샘플 분취 디바이스(sample aliquoting device);
c. 제1 염색제와 제2 염색제를 함유하는 염색제 저장소, 또는 제1 염색제를 함유하는 제1 염색제 저장소 및 제2 염색제를 함유하는 제2 염색제 저장소이되, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로서 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있는 것인 염색제 저장소;
d. 제1 방출 파장에서 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물을 영상화하도록 작동 가능한 제1 영상화 다바이스(first imaging device); 및
e. 영상화된 혼합물에서 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하고, 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 상기 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하도록 작동 가능한 프로세서를 포함한다.
상기에 기술된 장치는 본 발명의 양태로서 본원에 기술된 방법을 수행하도록 구성될 수 있고, 선택적으로 이러한 방법의 바람직한 특징의 일부 또는 전부를 포함한다. 본 장치는 상기에 기술된 방법과 연결되어 기술된 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 이들 특징들은 상기에 기술된 목적을 위한 것이며 유사한 장점을 제공할 수 있다.
본 장치는 희석제를 함유하는 희석제 저장소 및 그 희석제 저장소로부터 희석제 분취액을 배출시키기 위한 희석제 분취 다바이스를 포함할 수 있다. 본 장치는 샘플 분취액을 희석제 분취액과 접촉시켜 희석 값으로 희석된 분취액을 제공하도록 구성될 수 있고, 바람직하게는 본 다바이스는 희석된 분취액을 수용하기 위한 용기를 포함하고, 선택적으로, 이러한 용기에서 샘플 분취액을 희석제 분취액과 접촉시키는 것을 수행할 수 있다.
상기 장치는 상이한 희석 값으로 샘플로부터 2개 이상의 희석된 분취액을 제공하도록 구성될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 상기 디바이스는 2개 이상의 희석된 분취액의 각각을 수용하기 위한 2개 이상의 용기를 포함할 수 있다. 본 장치는 제1 용기에서 제1 희석 값으로 샘플로부터 희석된 분취액을 제공하고, 제2 용기에서 상기 희석된 분취액을 추가 희석제 분취액과 접촉시켜 제2 희석 값으로 제2 희석된 분취액을 생성하도록 추가로 구성될 수 있다.
선택적으로, 본 장치는 희석된 분취액을 제조하기 전에, 제조함과 동시에 또는 제조한 후에 희석된 분취액을 수용하기 위한 용기에 제1 염색제 및 제2 염색제를 도입하도록 구성될 수 있다.
프로세서는 바람직하게는 영상 분석 값이 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내에 있는지를 결정하도록 구성된다.
바람직하게는, 제2 염색제는 제2 방출 파장을 갖고, 제1 영상화 디바이스는, 선택적으로 제1 방출 파장에서 영상화함과 동시에, 제2 방출 파장에서 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물을 영상화하도록 작동 가능하다.
샘플은 성장 배지에 함유된 미생물을 포함할 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 제2 염색제는 DNA로부터 제1 염색제를 쫓아낼 수 있도록 제1 염색제보다 높은 DNA 결합 친화도를 갖는다. 제2 염색제는 형광 염색제, 선택적으로 적색 형광 염색제일 수 있고, 바람직하게는 프로피디움 요오다이드이다.
상기 제1 방출 파장에서의 제1 형광 염색제의 형광 강도는 바람직하게는 그 염색제가 핵산에 결합할 때 향상된다.
제1 형광 염색제는 350 내지 700 nm의 파장 범위에서 여기 파장 및 방출 파장을 가질 수 있다. 제1 형광 염색제는 녹색 형광 염색제일 수 있다. 제1 형광 염색제는 비대칭 시아닌 염료일 수 있다.
제1 영상화 다바이스는 현미경일 수 있다. 현미경은 명시야, 경사면, 암시야, 분산 염색, 위상차, 차등 간섭 대비, 형광, 공초점, 단일 평면 조명, 광 시트 및 대면적 다광자 현미경검사를 포함하는 하나 이상의 현미경검사 기법을 사용하도록 구성될 수 있다.
바람직하게는, 본 장치는 영상화용 웰을 포함하고, 그 웰은 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부, 또는 희석된 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부를 함유하기 위한 것이다. 영상화 디바이스는 바람직하게는 웰의 깊이에 걸쳐 하나 이상의 초점면에서 영상을 얻도록 구성된다. 영상화 디바이스는 영상화 디바이스의 광학 축을 따라 일련의 2D 영상을 얻도록 구성될 수 있고, 광학 축을 따라 상이한 위치에서 각각의 영상을 얻는다.
바람직하게는, 프로세서는 영상을 분석하여 온전한 미생물 또는 이의 클러스터에 대응하는 객체를 검출하도록 작동 가능하다. 프로세서는 각각의 객체에 포함된 인접한 픽셀의 수를 계수함으로써 각각의 객체의 면적을 결정하도록 구성될 수 있고, 선택적으로, 면적이 미리 결정된 면적 임계값 미만인 객체를 무시하도록 구성된다. 프로세서는 각각의 객체의 형태, 예를 들어 각각의 객체의 진원도 및/또는 객체의 형광 강도의 균일성을 결정하도록 구성될 수 있다. 프로세서는 각각의 객체에서의 최대 형광 강도 및/또는 평균 형광 강도, 최빈 형광 강도 또는 중앙치 형광 강도를 결정하도록 추가로 구성될 수 있고, 선택적으로, 최대 형광 강도가 미리 결정된 최대 형광 강도 임계값 미만인 객체를 무시하거나 또는 최빈 형광 강도 또는 중앙치 형광 강도가 미리 결정된 임계값 미만인 객체를 무시하도록 구성된다. 프로세서는, 객체 면적과 객체의 최대 형광 강도 또는 최빈 형광 강도 중 어느 하나의 곱에 대응하는, 각각의 객체에 대한 객체 분석 값을 결정하도록 구성되고, 그 객체에 대한 객체 분석 값의 합에 대응하는 영상 분석 값을 계산하도록 구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 프로세서는 상기에 개략된 임의의 하나의 인자 또는 모든 인자들에 대해 영상화된 객체의 집단에 대한 매개변수를 결정하도록 작동 가능하다. 따라서, 프로세서는 인자에 대한 값을 각각의 영상화된 객체에 배정하고, 객체의 집단에 대해 상기 인자에 대한 중앙치 값 또는 평균 값, 및/또는 영상화된 객체의 집단에 대해 상기 인자들 중 하나 이상의 분산 또는 표준 편차를 결정하도록 구성될 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 프로세서는 바람직하게는 영상 분석에 기초하여 미생물이 군집인지 또는 비군집인지를 결정하도록 작동 가능하고, 이 결정에 기초하여 적절한 바대로 군집 미생물 또는 비군집 미생물에 대해 적합한 미리 결정된 보정 곡선을 사용하도록(즉, 선택하도록) 작동 가능하다.
상기에 기술된 장치는 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 최소 억제 농도(MIC) 값을 결정하기 위해 항생제 감수성 검사(AST)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
상기 장치는 시험 미생물 배양물에 대한 복수의 웰을 포함할 수 있다. 이 경우에, 본 장치는 바람직하게는 샘플을 사용하여 상기 웰에서 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하도록 구성되고, 일련의 시험 미생물 배양물은 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함할 수 있고, 상이한 성장 조건은 1종 이상의 상이한 항균제 및 2 이상의 상이한 농도의 항균제(들)를 포함할 수 있고, 선택적으로 복수의 웰은 상기 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함한다.
본 장치는 바람직하게는 각각의 성장 조건에서의 미생물 성장의 정도를 평가하기 위한 영상화 디바이스를 포함한다. 일 실시형태에서, 영상화 디바이스는 라인 카메라이다.
프로세서는 바람직하게는 각각의 성장 조건에서의 미생물 성장의 정도에 기초하여 적어도 하나의 항균제로부터 적어도 하나의 MIC 값을 결정하도록 구성된다.
본 장치는 샘플에서의 온전한 미생물의 결정된 농도에 기초하여 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하기 위해 샘플의 적어도 일부의 농도를 조정하도록 구성될 수 있다. 바람직하게는, 본 장치는 샘플의 적어도 일부를 희석함으로써 또는 샘플을 배양하거나 더 배양함으로써 샘플의 적어도 일부의 농도를 조정하도록 구성된다.
일부 실시형태에서, 시험 미생물 배양물 중 적어도 하나는 까다로운 배지를 포함한다.
본 장치는 하나 이상의 소모품(consumable)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 장치는 염색제 저장소(들)가 제공된 제1 소모품을 포함할 수 있다. 제1 소모품에서 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물을 영상화할 수 있다. 대안적으로, 제2 소모품에서 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물을 영상화할 수 있다.
시험 미생물 배양물을 위한 상기에 기술된 복수의 웰은 제1 소모품 또는 제2 소모품 또는 제3 소모품에 제공될 수 있다.
본 장치는 바람직하게는 샘플로부터 미생물을 회수하여 회수된 미생물 샘플을 제공하도록 구성된다. 이 경우, 본 장치는 샘플에서 비미생물성 세포의 선택적 용해를 위한 완충액을 함유하는 용해 완충액 저장소 및 샘플로부터 온전한 미생물을 회수하기 위한 회수 도구를 포함할 수 있다. 용해 완충액 저장소 및 회수 도구는 제1 소모품에 제공될 수 있다. 회수 도구는 바람직하게는 필터이다.
바람직하게는 본 장치를 자동화한다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 최소 억제 농도(MIC) 값을 결정하기 위해 항생제 감수성 검사(AST)에 사용하기 위한 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한 장치(즉, 상기에 기술된 선택적인 특징부들 중 일부 또는 전부를 선택적으로 포함하는, 선행하는 양태의 장치)의 용도로 확장된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 제1 염색제와 제2 염색제를 함유하는 염색제 저장소, 또는 제1 염색제를 함유하는 제1 염색제 저장소 및 제2 염색제를 함유하는 제2 염색제 저장소이되, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로서 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있는 것인 염색제 저장소; 및 영상화용 웰이되, 웰은 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부, 또는 희석된 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부를 함유하기 위한 것인 영상화용 웰을 포함하는 농도 결정 소모품을 제공한다.
농도 결정 소모품은 샘플에서 비미생물성 세포의 선택적 용해를 위한 완충액을 함유하는 용해 완충액 저장소를 포함할 수 있다.
농도 결정 소모품은 샘플로부터 온전한 미생물을 회수하기 위한 회수 도구를 포함할 수 있고, 회수 도구는 바람직하게는 필터이다.
소모품 결정 농도는 대안적으로 또는 추가로 희석제를 함유하는 희석제 저장소를 포함할 수 있다. 농도 결정 소모품은 희석된 샘플 분취액(들)을 수용하기 위한 하나 이상의 용기를 추가로 포함한다.
마지막 양태에서, 본 발명은 제1 염색제와 제2 염색제를 함유하는 염색제 저장소, 또는 제1 염색제를 함유하는 제1 염색제 저장소 및 제2 염색제를 함유하는 제2 염색제 저장소를 포함하는 제1 소모품이되, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로서 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있는 것인 제1 소모품; 및 영상화용 웰을 포함하는 제2 소모품이되, 웰은 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부, 또는 희석된 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부를 함유하기 위한 것인 제2 소모품을 포함하는 농도 결정 키트를 제공한다.
제1 소모품은 샘플에서 비미생물성 세포의 선택적 용해를 위한 완충액을 함유하는 용해 완충액 저장소; 및/또는 샘플로부터 온전한 미생물을 회수하기 위한 회수 도구이되, 회수 도구는 바람직하게는 필터인 회수 도구; 및/또는 희석제를 함유하는 희석제 저장소 및 바람직하게는 희석된 샘플 분취액을 수용하기 위한 용기를 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 4℃, 실온, 및 35℃에서 염색제 용액과 항온처리된, 혈액 배양물에서 회수된 에이치.인플루엔자(A) 또는 피.아에루기노사(B) 샘플에서 측정된 온전한 미생물의 수를 도시한다.
도 2는 다양한 상이한 미생물에 대해 샘플 내의 온전한 미생물의 농도와 영상화에 의해 결정된 객체 수 사이의 관계에 대한 혼합 데이터를 도시한다. 데이터는 상이한 미생물들 사이에 광대한 대략적인 자릿수로 양호한 선형성을 나타낸다. 추가적으로, 에스.아우레우스(군집 미생물)는 주 데이터에서 벗어난다.
도 3은 모든 비군집 미생물에 대한 (축 반전된) 도 2로부터의 혼합 데이터를 도시하되, 회귀선이 EUCAST 지침에 따라 최적 선으로부터 ± 60% 경계 밖에 있는 실험 점의 개수를 최소화하도록 적응된 상태에서 도시하는 것이다.
도 4는 개별 미생물에 대한 도 3으로부터의 데이터를 도시한다. (A - 케이.뉴모니아; B - 에이치.인플루엔자; C - 피.아에루기노사; D - 피.미라빌리스; E - 이.패칼리스; F - 에스.뉴모니아). 시험된 모든 비군집 미생물에 동일한 보정 곡선이 적합한 것으로 밝혀졌다.
도 5는 에스. 아우레우스에 대한 데이터 및 보정 곡선을 도시한다. 에스. 아우레우스에 대해서 별개의 보정 곡선이 필요한데, 이는 이 실험에서 시험된 유일한 군집 미생물이기 때문이다.
도 6은 모든 비군집 미생물에 대한 (축 반전된) 도 2로부터의 혼합 데이터를 도시하되, 회귀선이 최적 선으로부터 ± 80% 경계 밖에 있는 실험 점의 개수를 최소화하도록 적응된 상태에서 도시하는 것이다. 에이치.인플루엔자를 제외하고는 LOD 위의 모든 데이터 점은 이 경계 안에 있다.
도 7은 ± 80% 경계를 사용하여 A - 케이.뉴모니아; B - 에이치.인플루엔자; C - 피.아에루기노사; D - 피.미라빌리스; E - 이.패칼리스; F - 에스.뉴모니아의 개별 미생물에 대한 도 6으로부터의 데이터를 도시한다. 이에 따라 최적 곡선을 조정하였다. 시험된 모든 비군집 미생물에 동일한 보정 곡선이 적합한 것으로 밝혀졌다.
도 8은 ± 80% 경계에서 에스.아우레우스에 대한 데이터 및 보정 곡선을 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시형태에 따른, 세포 배양물을 수용하기에 적합한 제1 AST 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 10은 본 발명의 일 실시형태에 따른, 세포 배양물을 수용하기에 적합한 제2 AST 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시형태에 따른, 세포 배양물을 수용하기에 적합한 제3 AST 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 12는 본 발명의 일 실시형태에 따른, 환자 샘플을 수용하기에 적합한 제4 AST 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 실시형태에 따른, 환자 샘플을 수용하기에 적합한 제5 AST 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 14는 본 발명의 일 실시형태에 따른, 환자 샘플을 수용하기에 적합한 제6 AST 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 15는 본 발명의 일 실시형태에 따른, 세포 배양물을 수용하기에 적합한 농도 결정 장치의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다.
도 16은 도 9 내지 도 14의 AST 장치 또는 도 15의 농도 결정 장치에 사용하기에 적합한 소모품을 도시한다.
실시예 1 - 농도 측정 및 AST 분석 설정
제1 샘플 분취액(20 μl)을 80 μl의 PBS에 희석하고, 15 μl의 희석된 혼합물의 분취액을 10 μM SYTO BC 및 3 μM 프로피디움 요오다이드를 함유하는 15 μl의 염색제 용액에 첨가하여 제1 희석된 분취액/염색제 혼합물을 제공한다. 샘플 분취액/PBS 혼합물(20 μl)을 180 μl의 PBS에 더 희석하고, 15 μl의 분취액을 15 μl의 염색제 용액에 희석하여 제2 희석된 분취액/염색제 혼합물을 제공한다.
제1 분취액/염색제 혼합물 및 제2 희석된 분취액/염색제 혼합물을 별개의 영상화 웰에 약 2 mm의 깊이로 옮긴다. 509 nm에서의 SYTO BC 방출 피크를 검출하기 위해 502 내지 561 nm에서의 방출 필터를 사용하여 광학 축의 방향으로 30 μm 떨어져 이격된 각각의 웰에 대해 현탁액 중의 미생물에서 50개의 영상을 얻는다. 얻은 영상을 스레시홀딩하고 분석하여 온전한 미생물에 대응하는 각각의 객체의 크기, 형광 강도 및 선택적으로 형태를 결정하여 각각의 희석된 분취액에 대한 영상 분석 값을 얻는다. 농도 결정 단계에서 사용하기 위한 미리 결정된 보정 곡선을 선택하는 데(예를 들어, 샘플이 군집 미생물인지 또는 비군집 미생물인지를 결정하는 데) 샘플에서의 미생물의 특징이 사용된다. 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내의 영상 분석 값을 갖는 희석된 분취액 중 하나가 확인된다. 선택된 희석된 분취액에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정한다.
필요한 경우, 적합한 성장 배지(예를 들어, 양이온 조정된 뮬러 힌턴 브로스(CAMHB))를 사용하여 샘플을 희석하여 이 샘플의 적어도 일부의 농도를 조정함으로써 항균제 감수성 시험(AST) 분석을 위한 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하기 위한 접종원을 제조한다. 선택적으로, 까다로운 배지에서 추가 접종원도 제조한다. 접종원(또는 접종원들)을 5 x 105 CFU/ml의 농도로 제조하고, AST 분석에서 적어도 2의 상이한 성장 조건에서 일련의 시험 미생물 배양물을 제조하도록 동결건조된 항균제를 함유하는 일련의 웰에 접종원을 첨가한다.
실시예 2 - 농도 결정에 대한 염색제 항온처리 온도의 영향
에이치.인플루엔자 또는 피.아에루리노사가 스파이킹된 10 ml의 혈액을 Bactec 플라스크(BD)에 첨가하고 양성 배양 결과가 얻어질 때까지 밤새 항온처리하였다. 용해 완충액을 사용하여 혈액 배양 플라스크에 존재하는 비미생물성 세포의 선택적 용해를 수행하고, 0.2 μm 나일론 메시 필터를 사용하여 샘플을 여과시켰다. 샘플을 여과한 후 양이온 조정된 뮬러 힌턴 브로스(CAMHB)로 세척하고 필터 막을 통해 역세척 CAMHB에 의해 재현탁시켰다.
회수된 미생물 샘플의 희석된 분취액을 더 희석하고 실시예 1에 개괄된 바와 같이 염색제 용액과 접촉시켰다. 희석된 분취액/염색제 혼합물을 포일로 덮고 4℃, 실온, 또는 35℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 각각의 분취액을 영상화하고, 영상을 실시예 1에 개괄된 바와 같이 분석하여 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하였다. 각각의 온도에서 각각의 희석된 분취액에 반복 수행하였다. 대조군 샘플에 대한 영상 분석 값을 또한 결정하였다. 각각의 온도에서 준비 후 결정된 영상 분석 값은 비교되어 에이치.인플루엔자에 대해 모든 온도에 대해 유사한 것으로 밝혀졌다. 실온 및 35℃ 조제물이 피.아에루기노사에 대해 유사한 것으로 밝혀졌다. 모든 온도에서 대조군 샘플에 대해서도 유사한 값을 결정하였다.
회수된 미생물 샘플의 분취액을 PBS에서 1 x 10-4, 1 x 10-5 및 1 x 10-6의 인수로 희석하고 플레이팅하여 미생물 생존력을 확인하였다.
실시예 3 - 미리 결정된 보정 곡선의 준비
상이한 농도에서 다수의 상이한 미생물에 대해 데이터를 수집하고, 계수된 객체의 수와 온전한 미생물의 농도 사이의 관계를 그래프에 작도하였다(도 2). 이 데이터는 (비록 측정된 상이한 종들 사이에 주어진 농도에 대해 계수된 객체의 수에 대해 광대한 대략적인 자릿수이지만) 대부분의 미생물 종에 대한 온전한 미생물의 농도와 계수된 객체의 수 사이에 선형 관계가 있다는 것을 보여준다.
비군집 미생물에 대한 컴파일링된 실행의 데이터는 혼합되어 최적 선이 계산되게 하였다(도 3). 수학적 최적 선을 제공하도록 최적 선을 생성하지 않고, 오히려 EUCAST 지침에 따라 ± 60% 한계 밖에 있는 데이터 점의 수를 최소화하도록 작성하였다. 개별 미생물에 대한 데이터를 생성된 최적 선과 비교하였다. 감출 한계 아래의 계수치는 음영 영역에 표시된다. 따라서, 샘플에서 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아 둘 모두의 농도를 결정하기 위해 동일한 최적 선을 사용할 수 있다.
군집 미생물인 에스.아우레우스(도 5)에 대해 별개의 최적 선을 계산하였다.
에이치.인플루엔자에 대한 대부분의 데이터 점은 최적 작도 곡선에 대해 원래의 ± 60% 경계 밖에 있었다. 비군집 미생물(도 6 및 도 7) 및 군집 미생물(도 8)에 대해 ± 80% 경계에 기반한 새로운 최적 곡선을 생성하였다. 에이치.인플루엔자를 제외하고는 검출 한계 위의 모든 데이터 점은 새로운 경계 내에 있다.
도 9는 세포 배양 샘플을 분석하기에 적합한 제1 AST 장치(1)의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다. 제1 AST 장치(1)는 샘플 피펫(12)(즉, 샘플 분취 다바이스), 희석제 피펫(14)(즉, 희석제 분취 다바이스), 현미경(16)(즉, 제1 영상화 다바이스(16)) 및 라인 카메라(18)(즉, 제2 영상화 다바이스)를 포함하는 제1 AST 장치(1) 내의 하위시스템을 제어하도록 작동 가능한 프로세서(10)를 포함한다.
제1 AST 장치(1)는 샘플 용기(31)(즉, 샘플을 수용하기 위한 용기), 희석제 저장소(35), 희석된 분취액 용기(36)(즉, 희석된 분취액을 수용하기 위한 용기), 제1 염색제 및 제2 염색제를 포함하는 염색제 저장소(37) 및 영상화 웰(38)이 제공된 제1 소모품(30a)을 수용한다. 영상화 웰(38)은 적어도 2 mm x 2 mm의 관찰 가능 영역 및 적어도 2 mm의 액체 깊이를 허용하기에 충분한 깊이(예를 들어, 3 mm)를 갖는다.
장치(1)는 또한 미생물 배양을 시험하기 위한 복수의 웰(42)을 포함하는 제2 소모품(40a)을 수용하고, 웰(42)은 복수의 상이한 항균제를 포함하고, 각각의 항균제는 복수의 농도로 제공된다.
사용시, 사용자는 제1 소모품(30a)에서 샘플 용기(31)에 샘플(도시되지 않음)을 로딩하고, 제1 AST 장치(1)에 제1 소모품(30a)을 로딩한다.
사용시, 프로세서(10)는,
- 희석제 저장소(35)로부터 희석제 피펫에 의해 옮긴 희석제를 사용하여 희석된 분취액 용기(36)에 세포 배양 샘플을 희석하고;
- 희석된 분취액 용기(36)로부터 희석된 분취액을 영상화 웰(38)로 옮기고;
- 염색제 저장소(37)로부터 제1 염색제 및 제2 염색제를 영상화 웰(38)로 옮기고;
- 현미경(16)을 사용하여 영상화 웰(38)을 영상화하여 세포의 농도를 결정하고;
- 희석된 분취액 용기(36)로부터 희석된 분취액을 웰(42)로 옮기고;
- 라인 카메라(18)를 제어하여 각각의 웰에서 미생물 성장의 정도를 평가하기 위해 웰(42)을 영상화하고;
- 샘플에서의 미생물의 항균제 감수성을 결정하기 위해 항균제에 대한 MIC 값을 결정하기 위해 영상을 분석하도록 구성된다.
제1 염색제 및 제2 염색제는 DNA에 결합하여 샘플-염색제 혼합물을 제공할 수 있다. 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있다. 이 예에서, 제1 염색제는 SYTO 9이고, 제2 염색제는 프로피디움 요오다이드이다.
프로세서(10)는 제1 방출 파장에서 영상화 웰(38)을 영상화하도록 현미경(16)을 제어하도록 작동 가능하다. 사용시, 현미경(16)은 영상화 웰(38) 내부의 평면에, 예를 들어 바닥에 평행하게 초점화되고, 바닥에서 거리를 두고(이 예에서, 바닥에서 0.2 mm로) 떨어져 있고, 영상화 시간 동안 액체에 걸쳐 연속적으로 초점면을 이동시키도록, 예를 들어 영상 획득 시간(예를 들어, 20 내지 30초) 동안 총 1.5 mm 이동시키도록 구성된다.
프로세서(10)는 현미경(16)에 의해 얻은 영상을 분석하여 영상화된 혼합물에서 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하도록 작동 가능하다. 프로세서(10)는 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하도록 구성된다.
2개의 유사한 AST 장치가 도 10 및 도 11에 도시되어 있고, 둘 모두는 세포 배양 샘플을 분석하는 데 또한 적합하다. 이들 장치의 구성요소는 제1 AST 장치(1)의 구성요소와 대체로 유사하며, 대응하는 특징부의 설명은 여기서 반복하지 않는다. 대신에, 도 9에 도시된 제1 AST 장치(1)와 비교하여 차이점에 중점을 두어 설명한다. 특히, 그 차이는 영상화 웰(38)의 위치와 관련된다.
도 10은 제2 AST 장치(2)의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다. 제1 AST 장치(1)에서 제1 소모품(30a)에 영상화 웰(38)이 있는 반면에, 제2 AST 장치(2)의 제1 소모품(30b)에서 영상화 웰이 생략되고 대신에 제2 소모품(40b)에 제공된다.
도 11은 제3 AST 장치(3)의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다. 제3 AST 장치(3)는 제1 소모품(30b)(도 10과 관련하여 기술된 바와 같음) 및 제2 소모품(40a)(도 9와 관련하여 기술된 바와 같음)을 수용하고, 제3 소모품(50)도 수용한다. 제3 소모품(50)에 영상화 웰(38)이 제공된다.
도 12 내지 도 14는 환자 샘플(예를 들어, 혈액 배양 플라스크로부터의 혈액 샘플)을 수용하기에 적합한 3개의 추가 AST 장치(4, 5, 6)의 개략적이고 단순화된 다이어그램을 도시한다. 도 12 내지 도 14는 각각 도 9 내지 도 11과 대체로 유사하다. 각 경우에서의 차이점은 분석을 위해 환자 샘플을 준비하기 위해 (영상화 웰을 포함하는) 제1 소모품(30c) 및 (영상화 웰을 포함하지 않는) 제1 소모품(30d)이 추가 구성요소를 포함한다는 점이다. 제1 소모품(30c 및 30d)은 용해 완충액 저장소(32), 필터(33)(즉, 회수 도구) 및 재현탁된 세포 용기(34)(즉, 샘플을 수용하기 위한 용기)를 포함한다.
도 12 내지 도 14에 도시된 추가 AST 장치(4, 5, 6)의 프로세서(10)는,
- 샘플 피펫(12)이 샘플 용기(31)로부터 샘플 분취액을 주사기(도시하지 않음)로 옮기게 하여 용해 저장소(32)로부터의 용해 완충액과 혼합되고;
- 용해된 샘플을 필터(33)를 통해 여과시키고;
- (배양 배지 저장소(도시하지 않음)로부터의) 배양 배지를 사용하여 필터(33)로부터 미생물 세포를 재현탁시킴으로써 필터(33)로부터 이들을 회수하도록 구성된다.
도 15는, 도 11의 AST 장치(3)가 AST 분석을 수행하기에 적합하게 하는 구성요소를 농도 결정 장치(7)가 포함하지 않는다는 점을 제외하고는, 도 11에 도시된 제3 AST 장치(3)와 유사한 농도 결정 장치(7)를 도시한다. 농도 결정 장치(7)는 농도 결정 분석만을 수행하도록 구성된다. 도 11에 도시된 제3 AST 장치(3)와 비교하여, 도 15의 농도 결정 장치(7)는 제2 소모품(40a) 및 라인 카메라(18)가 생략된다. 이 실시형태에서, 농도 결정 장치(7)는 도 10과 관련하여 상기에 기술된 바와 같은 제1 소모품(30b) 및 도 11과 관련하여 상기에 기술된 바와 같은 제3 소모품(50)을 포함한다. 즉, 영상화 웰(38)은 제1 소모품(30b)과 별개인 소모품에 제공된다. 농도 결정 장치(7)는 세포 배양 샘플을 수용하기에 적합하다. 농도 결정 장치가 환자 샘플(예를 들어, 혈액 배양 플라스크로부터의 혈액 샘플)을 수용하기에 적합한 다른 실시형태(도시되지 않음)에서, 제1 소모품(30b)이 제1 소모품(30d)에 의해 대체되어 농도 결정 장치는 용해 완충액 저장소(32), 필터(33)(즉, 회수 도구) 및 재현탁된 세포 용기(34)(즉, 샘플을 수용하기 위한 용기)를 포함한다.
유사한 실시형태(도시되지 않음)에서, 농도 결정 장치(7)는 대신에 (도 9와 관련하여 상기에 기술된 바와 같은) 제1 소모품(30a) 또는 (도 12와 관련하여 상기에 기술된 바와 같은) 제1 소모품(30c)을 사용할 수 있다. 이들 둘 모두는 영상화 웰(38)을 포함하고, 이 경우 제3 소모품(50)을 생략할 수 있다. 제1 소모품(30a)을 사용하는 경우, 농도 결정 장치는 세포 배양 샘플을 수용하기에 적합하다. 제1 소모품(30c)을 사용하는 경우, 농도 결정 장치는 환자 샘플(예를 들어, 혈액 배양 플라스크로부터의 혈액 샘플)을 수용하기에 적합한데, 왜냐하면 상기 장치가 용해 완충액 저장소(32), 필터(33) 및 재현탁된 세포 용기(34)를 포함하기 때문이다.
도 16은 제2 소모품(40a 또는 40b) 또는 제3 소모품(50)으로 사용하기에 적합한 소모품(100)을 도시한다. 이 소모품은 국제공개 WO 2017/216314호에 상세하게 기술되어 있다. 도 16에 도시된 바와 같이, 소모품(100)은 3개의 층을 갖는다. 광학적으로 평평한 제1 층(110)이 기층을 형성한다. 제2 층(114)은 제1 층(10)의 상부에 배치되고 채널(118)을 통해 연결된 (웰(42)에 대응하는) 웰(116)에서 유체를 보유하기 위한 체적으로 형성된다. 제1 층(110)은 웰(116)의 바닥을 밀폐한다. 제3 층(120)은 웰(116) 및 채널(18)의 상단을 덮는다. 제3 층(120)은 각각의 채널(118)로 유체가 분배되게 하고 이어서 채널(118)을 따라 웰(116)을 모두 채우도록 각각의 채널(118)의 일 단부에 개구부(122)를 포함한다. 제3 층(120)은 샘플 유체(들)가 채널(118)을 채우면서 가스가 이 채널을 떠나게 하도록 각각의 채널(118)의 다른 단부에 벤트(124)를 또한 포함한다. 벤트(124) 및 선택적으로 또한 개구부(122)는 가스 투과성 막으로 덮일 수 있다.
모든 층들(10, 14, 20)은 장치(2)에 샘플 홀더(100)를 로딩하는 동안 사용되는 중앙 홀(126)을 갖는다. 이 예에서, 샘플 홀더(100)는 원형 기하구조를 가지며, CD와 유사한 방식으로 유지될 수 있어 스핀들 플래터(spindle platter)에 지지되고 샘플 홀더(100) 위에서 그리고/또는 아래에서 영상화 부재와 회전하도록 유지될 수 있다. 장치들(1, 2, 3, 4, 5, 6)에서 중앙 홀(126)은 샘플 홀더(100)를 스핀들 플래터에 커플링하기 위한 장착부를 형성한다. 제1 층(110) 및 제3 층(120)은 샘플을 영상화하기 위해 사용된 파장에서 광에 투명하고, 일반적으로 가시광에 투명하다.

Claims (80)

  1. 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법으로서,
    a. 미생물을 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
    b. 선택적으로, 희석 값으로 희석된 분취액을 제공하도록 상기 샘플의 분취액을 희석하는 단계;
    c. 샘플-염색제 혼합물을 제공하도록 단계 (a)의 샘플의 분취액의 적어도 일부 또는 희석 단계 (b) 동안의 또는 후의 상기 샘플의 희석된 분취액의 적어도 일부를 DNA에 결합할 수 있는 제1 염색제(stain) 및 제2 염색제와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자(donor molecule)로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자(acceptor molecule)로서 작용할 수 있는 것인, 단계;
    d. 상기 제1 방출 파장에서 상기 단계 (c)의 분취액-염색제 혼합물을 영상화하고, 영상화된 혼합물에서 온전한 미생물에 대응하는 객체(object)의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하는 단계; 및
    e. 상기 분취액에 대한 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 상기 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플 분취액은 희석 값으로 희석된 분취액을 제공하도록 희석되고, 접촉 단계 (c)는 희석 단계 (b) 동안에 또는 후에 발생하고, 단계 (c) 내지 단계 (e)는 상기 희석된 분취액에서 수행되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상이한 희석 값으로 2개 이상의 희석된 분취액을 제공하도록 상기 샘플 분취액을 희석하는 것을 포함하고, 상기 2개 이상의 분취액은 단계 (c) 전에 또는 동안에는 동시에 제조되거나, 제2의 또는 추가의 희석된 분취액이 단계 (d) 및/또는 단계 (e) 후에 제조되는 경우에는 순차적으로 제조되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 및 단계 (d)는 상이한 희석 값의 2개 이상의 분취액에서 수행되고, 단계 (e)는 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내에 영상 분석 값을 포함하는 분취액을 확인하는 것과, 상기 분취액에 대한 영상 분석 값을 상기 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 상기 샘플 내의 생존 가능한 미생물의 농도를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (c)와 단계 (d)가 각각의 분취액에 동시에 수행되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 단계 (c)와 단계 (d)가 각각의 분취액에 순차적으로 수행되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제는 DNA로부터 상기 제1 염색제를 쫓아낼 수 있도록 상기 제1 염색제보다 높은 DNA 결합 친화도를 갖는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제를 검출하는 것을 포함하지 않는 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (d)는 상기 제1 염색제 및 제2 염색제를 검출하도록 각각의 분취액-염색제 혼합물을 동시에 영상화하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 성장 배지에 함유된 미생물을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 염색제 및 제2 염색제는 단계 (c)에서 상기 샘플 분취액 또는 상기 희석된 샘플 분취액 또는 이들의 일부와 접촉하기 전에 염색제 용액을 형성하도록 예비혼합되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 방출 파장에서의 상기 제1 형광 염색제의 형광 강도는 상기 염색제가 핵산에 결합할 때 향상되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 염색제는 350 내지 700 nm의 파장 범위에서 여기 파장 및 방출 파장을 갖는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 염색제는 녹색 형광 염색제인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 염색제는 비대칭 시아닌 염료인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 녹색 형광 염색제는 SYTO 염색제인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 SYTO 염색제는 SYTO BC인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제는 형광 염색제인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제2 염색제는 적색 형광 염색제인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 적색 형광 염색제는 프로피디움 요오다이드인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상화는 미생물의 현탁액에서 수행되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 영상은 상기 현탁액에 걸쳐 하나 이상의 초점면에서 얻어지는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 영상화는 광학 축을 따라 일련의 2D 영상을 얻는 것을 포함하고, 각각의 영상은 상기 현탁액의 체적에 걸쳐 상기 광학 축을 따라 상이한 위치에서 얻어지는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색제와 접촉시키는 단계 (c)는 4℃ 초과의 온도에서 수행되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계 (c)에서 상기 분취액 또는 희석된 분취액, 또는 이들의 일부는 1 내지 20분의 기간 동안 상기 제1 염색제 및 제2 염색제와 항온처리되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서의 영상화는 실온에서 수행되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상화 단계 (d)에서 상기 미생물이 군집 또는 비군집인지가 확인되고, 군집 미생물 또는 비군집 미생물에 대해 미리 결정된 보정 곡선이 사용되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상은 각각의 열거된 객체의 형광 강도 및/또는 크기 및 선택적으로 각각의 열거된 객체의 형태에 대해 분석되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상은 각각의 열거된 객체의 최대 형광 강도, 중앙치 형광 강도 및/또는 면적에 대해 분석되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상은 객체의 집단의 최대 형광 강도, 중앙치 형광 강도 및/또는 평균 형광 강도 및/또는 면적에 대해 분석되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 생존 가능한 미생물의 농도가 결정되는, 방법.
  33. 샘플에서 미생물의 항균제 감수성을 결정하는 방법으로서,
    (i) 생존 가능한 미생물을 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 샘플에서 온전한 미생물 세포의 농도를 결정하기 위해 상기 샘플에서 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단계 (b) 내지 단계 (e)를 수행하는 단계;
    (iii) 단계 (i)에서의 샘플을 사용하여 항생제 감수성 검사(AST: antibiotic susceptibility test)를 위한 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하는 단계로서, 상기 일련의 시험 미생물 배양물은 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함하고, 상기 상이한 성장 조건은 1종 이상의 상이한 항균제를 포함하고, 각각의 항균제는 2 이상의 상이한 농도에서 시험되는 것인, 단계; 및
    (iv) 각각의 성장 조건에서 미생물 성장의 정도를 평가하는 단계를 포함하고;
    상기 샘플 또는 상기 시험 미생물 배양물 내의 미생물 세포의 농도는 필요한 경우 원하거나 미리 결정된 농도로 조정되고;
    각각의 성장 조건에서의 미생물 성장의 정도는 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 MIC 값을 결정하여 상기 샘플에서 상기 미생물의 항균제 감수성을 결정하도록 사용되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 단계 (ii)에서 결정된 농도에 기초하여, 단계 (i)의 샘플의 적어도 일부의 농도는 단계 (iii)에서 시험 미생물 배양물을 접종하기 위한 접종원을 제공하도록 조정되는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 농도를 조정하는 단계는 단계 (ii)에서 결정된 농도에 기초한 희석을 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 (ii) 후에 단계 (i)의 샘플의 적어도 일부는 단계 (iii)에 대한 접종원을 제공하도록 희석되는, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종된 미생물 시험 배양물 내의 미생물의 농도는 4.5 x 105 ± 80% 또는 5 x 105 ± 60%의 범위인, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 미생물 배양물 중 적어도 하나는 까다로운 배지(fastidious medium)를 포함하는, 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농도 조정은 상기 샘플의 배양 또는 추가 배양을 포함하는, 방법.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플에서의 미생물의 농도가 1 x 106개 미만의 미생물인 경우, 상기 AST 분석은 상기 샘플로 수행되지 않는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물의 샘플은 샘플로부터 미생물을 회수하여 회수된 미생물 샘플을 제공함으로써 제공되는, 방법.
  42. 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한 장치로서,
    a. 미생물을 함유하는 샘플을 수용하기 위한 용기;
    b. 상기 샘플로부터 샘플 분취액을 배출시키기 위한 샘플 분취 다바이스(sample aliquoting device);
    c. 제1 염색제와 제2 염색제를 함유하는 염색제 저장소, 또는 제1 염색제를 함유하는 제1 염색제 저장소 및 제2 염색제를 함유하는 제2 염색제 저장소로서, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로 작용할 수 있는 것인, 염색제 저장소;
    d. 상기 제1 방출 파장에서 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물을 영상화하도록 작동 가능한 제1 영상화 디바이스(first imaging device); 및
    e. 상기 영상화된 혼합물에서 온전한 미생물에 대응하는 객체의 수에 대한 영상 분석 값을 결정하고, 상기 영상 분석 값을 미리 결정된 보정 곡선과 비교하여 상기 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하도록 작동 가능한 프로세서를 포함하는, 장치.
  43. 제42항에 있어서, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 구성된, 장치.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 희석제를 함유하는 희석제 저장소와, 상기 희석제 저장소로부터 희석제 분취액을 배출시키기 위한 희석제 분취 다바이스를 포함하고, 당해 장치는 희석 값으로 희석된 분취액을 제공하도록 상기 샘플 분취액을 상기 희석제 분취액과 접촉시키도록 구성되고, 선택적으로 상기 디바이스는 상기 희석된 분취액을 수용하기 위한 용기를 포함하는, 장치.
  45. 제44항에 있어서, 당해 장치는 상이한 희석 값으로 상기 샘플로부터 2개 이상의 희석된 분취액을 제공하도록 구성된, 장치.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서는 상기 영상 분석 값이 미리 결정된 보정 곡선의 범위 내에 있는지를 결정하도록 구성된, 장치.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제는 제2 방출 파장을 갖고, 상기 제1 영상화 디바이스는, 선택적으로 상기 제1 방출 파장에서 영상화함과 동시에, 상기 제2 방출 파장에서 상기 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물을 영상화하도록 작동 가능한, 장치.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 성장 배지에 함유된 미생물을 포함하는, 장치.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제는 DNA로부터 상기 제1 염색제를 쫓아낼 수 있도록 상기 제1 염색제보다 높은 DNA 결합 친화도를 갖는, 장치.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 염색제는 형광 염색제, 선택적으로 적색 형광 염색제이고, 바람직하게는 프로피디움 요오다이드인, 장치.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 방출 파장에서의 상기 제1 형광 염색제의 형광 강도는 상기 염색제가 핵산에 결합할 때 향상되는, 장치.
  52. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 염색제는 350 내지 700 nm의 파장 범위에서 여기 파장 및 방출 파장을 갖고/갖거나,
    상기 제1 형광 염색제는 녹색 형광 염색제이고/이거나,
    상기 제1 형광 염색제는 비대칭 시아닌 염료인, 장치.
  53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 영상화 디바이스는 현미경이고; 선택적으로, 명시야, 경사면, 암시야, 분산 염색, 위상차, 차등 간섭 대비, 형광, 공초점, 단일 평면 조명, 광 시트(light sheet) 및 대면적 다광자(wide field multiphoton) 현미경검사를 포함하는 하나 이상의 현미경검사 기법을 사용하도록 구성된, 장치.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화용 웰을 포함하고, 상기 웰은 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부, 또는 희석된 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부를 함유하기 위한 것인, 장치.
  55. 제54항에 있어서, 상기 영상화 디바이스는 상기 웰의 깊이에 걸쳐 하나 이상의 초점면에서 영상을 얻도록 구성되고/되거나,
    상기 영상화 디바이스는 상기 영상화 디바이스의 광학 축을 따라 일련의 2D 영상을 얻도록 구성되고, 각각의 영상은 상기 광학 축을 따라 상이한 위치에서 얻어지는, 장치.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서는 온전한 미생물 또는 이의 클러스터에 대응하는 객체를 검출하도록 상기 영상을 분석하도록 작동 가능한, 장치.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로세서는 상기 미생물이 군집 또는 비군집인지를 결정하도록 작동 가능하고, 이 결정에 기초하여 적절한 바대로 군집 미생물 또는 비군집 미생물에 대해 적합한 미리 결정된 보정 곡선을 사용하도록 작동 가능한, 장치.
  58. 제57항에 있어서, 상기 프로세서는 각각의 객체에 포함된 인접한 픽셀의 수를 계수함으로써 각각의 객체의 면적을 결정하도록 구성되고, 선택적으로 면적이 미리 결정된 면적 임계값 미만인 객체를 무시하도록 구성된, 장치.
  59. 제58항에 있어서, 상기 프로세서는 각각의 객체에 대한 최대 형광 강도 및/또는 평균 형광 강도 또는 중앙치 형광 강도를 결정하도록 구성되고, 선택적으로, 최대 형광 강도가 미리 결정된 최대 형광 강도 임계값 미만인 객체를 무시하거나 또는 최빈 형광 강도 또는 중앙치 형광 강도가 미리 결정된 임계값 미만인 객체를 무시하도록 구성된, 장치.
  60. 제59항에 있어서, 상기 프로세서는 각각의 객체에 대한 상기 객체 면적과 상기 객체의 최대 형광 강도 또는 최빈 형광 강도 중 어느 하나의 곱에 대응하는 객체 분석 값을 결정하도록 구성되고, 상기 객체에 대한 객체 분석 값의 합에 대응하는 영상 분석 값을 계산하도록 구성된, 장치.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 프로세서는 상기 객체의 집단의 최대 형광 강도, 중앙치 형광 강도 및/또는 평균 형광 강도, 면적 및/또는 객체 분석 값을 결정하도록 구성된, 장치.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 최소 억제 농도(MIC: minimum inhibitory concentration) 값을 결정하기 위해 항생제 감수성 검사(AST)에 사용하기 위한, 장치.
  63. 제42항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 미생물 배양물에 대한 복수의 웰을 추가로 포함하고, 당해 장치는 샘플을 사용하여 상기 웰에 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하도록 구성되고, 상기 일련의 시험 미생물 배양물은 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함하고, 상기 상이한 성장 조건은 1종 이상의 상이한 항균제 및 2 이상의 상이한 농도의 항균제(들)를 포함하고, 선택적으로 상기 복수의 웰은 상기 적어도 2의 상이한 성장 조건을 포함하는, 장치.
  64. 제63항에 있어서, 각각의 성장 조건에서 미생물 성장의 정도를 평가하기 위한 영상화 디바이스를 포함하고, 바람직하게는 상기 영상화 디바이스는 라인 카메라인, 장치.
  65. 제64항에 있어서, 상기 프로세서는 각각의 성장 조건에서의 미생물 성장의 정도에 기초하여 적어도 하나의 항균제로부터 적어도 하나의 MIC 값을 결정하도록 구성된, 장치.
  66. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 장치는 상기 샘플에서의 온전한 미생물의 결정된 농도에 기초하여 상기 일련의 시험 미생물 배양물을 접종하기 위해 상기 샘플의 적어도 일부의 농도를 조정하도록 구성된, 장치.
  67. 제66항에 있어서, 당해 장치는
    상기 샘플의 적어도 일부를 희석함으로써, 또는
    상기 샘플을 배양하거나 추가로 배양함으로써, 상기 샘플의 적어도 일부의 농도를 조정하도록 구성된, 장치.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 미생물 배양물 중 적어도 하나는 까다로운 배지를 포함하는, 장치.
  69. 제42항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색제 저장소(들)가 제공되는 제1 소모품(consumable)을 포함하는, 장치.
  70. 제69항에 있어서, 상기 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물은 상기 제1 소모품에서 영상화되는, 장치.
  71. 제69항에 있어서, 상기 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물은 제2 소모품에서 영상화되는, 장치.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 종속될 때, 상기 시험 미생물 배양물에 대한 복수의 웰은 제1 소모품, 또는 제2 소모품, 또는 제3 소모품에 제공되는, 장치.
  73. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 장치는 샘플로부터 미생물을 회수하여 회수된 미생물 샘플을 제공하도록 구성된, 장치.
  74. 제73항에 있어서, 샘플에서 비미생물성 세포의 선택적 용해를 위한 완충액을 함유하는 용해 완충액 저장소와, 상기 샘플로부터 온전한 미생물을 회수하기 위한 회수 도구를 포함하는 장치.
  75. 제74항에 있어서, 상기 용해 완충액 저장소 및 회수 도구는 상기 제1 소모품에 제공되는, 장치.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 회수 도구는 필터인, 장치.
  77. 제42항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 장치는 자동화된, 장치.
  78. 농도 결정 소모품으로서,
    제1 염색제와 제2 염색제를 함유하는 염색제 저장소, 또는 제1 염색제를 함유하는 제1 염색제 저장소 및 제2 염색제를 함유하는 제2 염색제 저장소로서, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있는 것인, 염색제 저장소; 및
    영상화용 웰로서, 상기 웰은 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부, 또는 희석된 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부를 함유하기 위한, 상기 영상화용 웰을 포함하고;
    선택적으로,
    샘플에서 비미생물성 세포의 선택적 용해를 위한 완충액을 함유하는 용해 완충액 저장소; 및/ 또는
    상기 샘플로부터 온전한 미생물을 회수하기 위한 회수 도구이되, 상기 회수 도구는 바람직하게는 필터인 회수 도구; 및/ 또는
    희석제를 함유하는 희석제 저장소 및 바람직하게는 상기 샘플의 희석된 분취액을 수용하기 위한 용기를 포함하는, 장치.
  79. 농도 결정 키트로서,
    제1 소모품이되, 제1 염색제와 제2 염색제를 함유하는 염색제 저장소, 또는 제1 염색제를 함유하는 제1 염색제 저장소 및 제2 염색제를 함유하는 제2 염색제 저장소를 포함하고, 상기 제1 염색제는 형광 염색제이고, 세포 투과성이고, 제1 방출 파장을 가지며, 상기 제2 염색제는 세포 비투과성이고, 공여체 분자로 작용하는 제1 염색제와 FRET 쌍으로 수용체 분자로서 작용할 수 있고;
    선택적으로,
    샘플에서 비미생물성 세포의 선택적 용해를 위한 완충액을 함유하는 용해 완충액 저장소, 및/ 또는
    상기 샘플로부터 온전한 미생물을 회수하기 위한 회수 도구이되, 상기 회수 도구는 바람직하게는 필터인 회수 도구, 및/ 또는
    희석제를 함유하는 희석제 저장소 및 바람직하게는 상기 샘플의 희석된 분취액을 수용하기 위한 용기를 포함하는 것인 제1 소모품;

    영상화용 웰을 포함하는 제2 소모품이되, 상기 웰은 샘플 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부, 또는 희석된 분취액과 제1 염색제와 제2 염색제의 혼합물의 적어도 일부를 함유하기 위한 것인 제2 소모품을 포함하는, 장치.
  80. 적어도 하나의 항균제에 대한 적어도 하나의 최소 억제 농도(MIC) 값을 결정하기 위해 항생제 감수성 검사(AST)에 사용하기 위한 샘플 내의 온전한 미생물의 농도를 결정하기 위한, 제42항 내지 제77항 중 어느 한 항의 장치의 용도.
KR1020207013325A 2017-10-13 2018-10-12 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법 KR20200062321A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1716883.2 2017-10-13
GBGB1716883.2A GB201716883D0 (en) 2017-10-13 2017-10-13 Method for determining the concentration of intact microorganisms in a sample
PCT/EP2018/077852 WO2019073025A1 (en) 2017-10-13 2018-10-12 METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION IN INTACT MICROORGANISMS IN A SAMPLE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200062321A true KR20200062321A (ko) 2020-06-03

Family

ID=60419267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207013325A KR20200062321A (ko) 2017-10-13 2018-10-12 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200299748A1 (ko)
EP (1) EP3668992A1 (ko)
KR (1) KR20200062321A (ko)
CN (1) CN111164218A (ko)
GB (1) GB201716883D0 (ko)
WO (1) WO2019073025A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210004870A (ko) * 2019-07-05 2021-01-13 주식회사 더웨이브톡 미생물 콜로니 검출 시스템

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
CN112362435A (zh) * 2020-11-05 2021-02-12 深圳安侣医学科技有限公司 细胞染色试剂及细胞染色方法
GB202118957D0 (en) * 2021-12-23 2022-02-09 Univ Liverpool Dyes and uses thereof
CN115014908A (zh) * 2022-05-23 2022-09-06 江西中医药大学 染色剂、心脏切片制备方法及微血管灌注染色评价方法
CN116626001B (zh) * 2023-05-24 2024-04-05 中国矿业大学 一种基于荧光分光光度法测定硫酸盐还原菌在煤表面的吸附率的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658751A (en) * 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
AU7603096A (en) * 1995-11-08 1997-05-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of assessing viability of microbial cultures
AU4134801A (en) * 1999-10-25 2001-05-30 Genprime, Inc. Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation
CA2454340A1 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Pharmacia Corporation Methods and apparatus for producing gender enriched sperm
US6803208B2 (en) * 2001-07-30 2004-10-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets
FR2831187A1 (fr) * 2001-10-22 2003-04-25 Univ Aix Marseille Ii Methode de determination de l'activite bacteriostatique ou bactericide des agents antibiotiques par pcr quantitative
US20080305514A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Alcon Research, Ltd. Method for detecting microbes
WO2009038607A1 (en) * 2007-06-19 2009-03-26 University Of Wyoming Method for selectiveley staining microorganisms
US9933341B2 (en) * 2012-04-05 2018-04-03 Becton, Dickinson And Company Sample preparation for flow cytometry
WO2013166338A2 (en) * 2012-05-02 2013-11-07 Charles River Laboratories, Inc. Cell capture system and use thereof
EP2780707B1 (en) * 2012-05-02 2016-02-24 Charles River Laboratories, Inc. Method of detecting viable cells in a cell sample
EP2769218B1 (en) * 2012-05-02 2016-08-10 Charles River Laboratories, Inc. Viability staining method
EP3351642B1 (en) * 2014-06-13 2019-09-11 Q-Linea AB Method for detecting and characterising a microorganism
CN107148479A (zh) * 2014-09-04 2017-09-08 赛拉诺斯股份有限公司 病原体和抗微生物剂抗性检测

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210004870A (ko) * 2019-07-05 2021-01-13 주식회사 더웨이브톡 미생물 콜로니 검출 시스템

Also Published As

Publication number Publication date
GB201716883D0 (en) 2017-11-29
CN111164218A (zh) 2020-05-15
WO2019073025A1 (en) 2019-04-18
EP3668992A1 (en) 2020-06-24
US20200299748A1 (en) 2020-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210017568A1 (en) Device for determining antimicrobial susceptibility of a microorganism
US11505835B2 (en) Method for determining the identity and antimicrobial susceptibility of a microorganism
KR20200062321A (ko) 샘플에서 온전한 미생물의 농도를 결정하는 방법
Wang et al. Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology
Caron et al. Assessment of bacterial viability status by flow cytometry and single cell sorting
US20210032674A1 (en) Method for determining microorganism concentration
JP6401146B2 (ja) フローサイトメトリーのための試料調製
EP2738262B1 (en) Method for evaluating bacterial cell wall integrity
CA3115262A1 (en) Detection and analysis of cells
JP6353518B2 (ja) 複合マトリックス中の微生物の分析を向上させるための方法

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal