JP6401146B2 - フローサイトメトリーのための試料調製 - Google Patents
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- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Description
本出願は、2012年4月5日に出願した米国特許仮出願第61/620,823号明細書の出願日の利益を主張し、本出願と共同所有される2013年3月13日に出願した米国特許仮出願第61/779,766号明細書に関連するものであり、これらの開示は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。
として示される。ある特定の実施形態では、R1は、バックグラウンドシグナル低減分子の生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択される。
過剰のバックグラウンドシグナル低減分子
の少なくとも1種を包含する。
核酸色素と共有結合により連結された消光剤
樹脂による粒子状物質の除去
キット
式(II)の分子をトリプチケースソイブロス(TSB)に加え、最終濃度を5μMとした。混合物を、30分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、TSBおよび核酸染色剤のみを含有し、式(II)の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図1A〜1Cにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、TSBのみの試料における6591カウントから、式(II)の分子と混合された試料における58カウントまで低減されることを実証する。これは、バックグラウンドシグナル(つまり、試料微粒子と結合された色素からのシグナル)が、およそ99%低減されることを実証する。
式(II)の分子をTSBに加え、TSB中の最終濃度を5μMとした。混合物を、5分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えたか、またはプレインキュベーションなしで核酸染色剤と同時に加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、TSBおよび核酸染色剤のみを含有し、式(II)の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図2A〜2Cにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、TSBと核酸染色剤のみにおける6436カウントから、式(II)の分子および染色剤と同時に混合されたTSBにおける3062カウントまで低減されることを実証する。これは、およそ51%のバックグラウンドシグナルの低減を実証する。しかしながら、核酸染色剤を加える前に、式(II)の分子をTSBと混合およびインキュベートした場合、バックグラウンドシグナルは、486カウントまで低減され、ほぼ92%のバックグラウンドシグナルの低減である。
式(II)の分子をTSBに加え、最終濃度を0.5μM、1.67μM、または5μMのいずれかとした。混合物を、60分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、TSBおよび核酸染色剤のみを含有し、式(II)の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図3にまとめられ、バックグラウンドシグナルの低減が、バックグラウンドシグナル低減分子の濃度に依存することを実証する。加えて、バックグラウンドシグナルは、最低濃度のバックグラウンドシグナル低減分子により少なくとも82%低減される。
式(II)の分子をTSBに加え、最終濃度を5μMとした。混合物を、2分または5分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、TSBおよび核酸染色剤のみを含有し、式(II)の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図4にまとめられ、バックグラウンドシグナルの低減が、バックグラウンドシグナル低減分子とのインキュベーションの時間に依存することを実証する。加えて、バックグラウンドシグナルは、2分のインキュベーション時間により少なくとも75%低減される。
式(I)、(III)、および(IV)の分子をTSBに加え、分子の最終濃度を5μMとした。混合物を、30分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、TSBおよび核酸染色剤のみを含有し、バックグラウンドシグナル低減分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図5A〜5Eにまとめられる。バックグラウンドシグナル低減分子はそれぞれ、フローサイトメトリー分析におけるバックグラウンドシグナルを、少なくとも55%のパーセントから最大94%までも低減する。
式(I)の分子をTSBに加え、分子の最終濃度を5μMとした。混合物を、2分または5分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えたか、またはプレインキュベーションなしで核酸染色剤と同時に加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、TSBおよび核酸染色剤のみを含有し、式(I)の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図6A〜6Dにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、バックグラウンドシグナル低減分子を含有するすべての試料において低減されることを実証する。バックグラウンドシグナル低減分子が核酸染色剤と同時に混合された試料については、バックグラウンドシグナルは、およそ34%低減された。核酸染色剤を加える前に、試料をバックグラウンドシグナル低減分子とプレインキュベートした場合、バックグラウンドシグナルの低減量は増加した。バックグラウンドシグナルは、5分および2分でインキュベートした試料について、それぞれおよそ89%および93%低減された。
式(I)および(II)の分子をプロセス水に加え、分子の最終濃度を5μMとした。混合物を、30分間インキュベートし、その後核酸染色剤Syto(登録商標)62を0.2μMの最終濃度で加えた。次いで、混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、プロセス水および核酸染色剤のみを含有し、式(I)および(II)の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図7A〜7Dにまとめられ、フローサイトメトリーによる分析の前に、プロセス水を含む試料を本明細書に記載されるバックグラウンドシグナル低減分子とインキュベートした場合、バックグラウンドシグナルがゼロ近くまで低減されることを実証する。
様々なスワブ試料からのバックグラウンドシグナルを低減するために、本明細書に記載されるバックグラウンドシグナル低減分子を使用した。ポリウレタンまたはフォーム製のスワブを、5μMの最終濃度の式(I)の分子の溶液中で、30分間インキュベートした。次いで、0.2μMの最終濃度の核酸染色剤Syto(登録商標)62を混合物に加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、スワブおよび核酸染色剤のみを含有し、式(I)の分子を含有しない試料についても試験した。3つの領域を分析し、領域1、領域2、および領域3は、それぞれカビ、細菌、および酵母が典型的に集合する領域を表す。結果は、図8A〜8Fにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、両方の種類のスワブの各領域において、有意に低減されることを実証する。
生菌を含まない精製水試料を、フローサイトメトリー分析のためのBD FACSMicroCountにおいて使用した。標準的なBD MicroCount TVO試薬(バッファー試薬、細胞浸透性の核酸にインターカレートする蛍光色素(nucleic acid intercalating fluorescent dye)であるバイオマス染色剤(Biomass Stain)、BRAG3)を試料に加え、その後機器により分析した。図9Aに示されるように、強度プロットにおける丸で囲んだゲート領域内の事象を計算して、生菌の濃度(カウント/ml)を報告する。
およそ15,000cfu/mlの大腸菌(Escherichia coli;E. coli)を、水試料中にスパイクし、スパイクした試料を、標準的な水質試験法を使用して、FACSMicroCountにより分析した。ゲート内で3283の総カウントが、総生菌濃度として報告された。結果は、図10Aに示される。
Claims (30)
- 生存微生物の量について試料を分析する方法であって、
少なくとも1種の生存標的微生物の存在または不在について試験すべき試料を採取するステップと;
前記試料を調製するステップと;
過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を含む、バックグラウンドシグナルを低減する物質を加えるステップであって、前記バックグラウンドシグナル低減分子は前記微生物の生存細胞に浸透しないステップと;
前記微生物の標的生存細胞に浸透しおよびそれを標識する核酸染色剤を加えるステップと;および、
前記調製された試料を分析するステップと、
を含み、
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で非標的粒子と結合し、
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、構造Y−(CH=CH)n−CH=Zを有する分子またはその塩からなる群から選択され、
式中、Yは、
nは、0または最大約5の整数であり;
Xは、炭素または硫黄のいずれかであり;
R1は、場合により、水素、1〜6個の炭素原子を有するアルキル基、サルファイト部分、またはアルキルアミドであり、前記バックグラウンドシグナル低減分子の前記生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択でき;
Zは、Yと同じかまたは異なるかのいずれかである)
からなる群から選択される、ことを特徴とする方法。 - 前記試料は、食物試料、環境試料、化粧品試料、および生物試料からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子の濃度は、前記試料と組み合わせたとき、0.1μMから50μMであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子の濃度は、前記試料と組み合わせたとき、0.1μMから10μMであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子の濃度は、前記試料と組み合わせたとき、0.5μMから5μMであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記核酸染色剤を加える前に、2分から1時間前記試料とインキュベートされることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記核酸染色剤を加える前に、2分から30分間前記試料とインキュベートされることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記核酸染色剤を加える前に、2分から5分間前記試料とインキュベートされることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子に、消光剤が付着されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、ヘミシアニンまたは閉鎖シアニンであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- nは、0または最大約3の整数であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- Yは、それに縮合したベンゼン部分;それに縮合したベンゼン部分誘導体;およびキノロン置換基からなる群から選択され、
前記ベンゼン部分、ベンゼン部分誘導体、およびキノロンは、置換されていても置換されていなくてもよいことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - nは、0または最大約3の整数であり;Xは、硫黄であり、R1は、アルキルアミドであり;Yは、それに縮合したベンゼンまたはベンゼン誘導体を有することを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記核酸染色剤と逐次的にまたは同時に加えられることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記調製された試料は、フローサイトメトリーにより分析されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- バックグラウンドシグナル強度は、少なくとも90%低減されることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- バックグラウンドシグナル強度は、少なくとも70%低減されることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- バックグラウンドシグナル強度は、少なくとも50%低減されることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 試料を分析して生存微生物の量を決定する方法であって、
少なくとも1種の標的微生物の存在または不在について試験すべき試料を採取するステップと;
前記試料を調製するステップと;
蛍光消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤を加えるステップと;
生存細胞に浸透する、消光剤を含まない核酸染色剤を加えるステップと;および、
前記調製された試料を分析するステップとを含み、
消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、消光剤を含まない前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で非標的粒子と結合し、消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に実質的に浸透せず、前記蛍光消光剤は、スペクトル重複により、消光剤を含まない前記核酸染色剤の蛍光シグナルを消光し;および、
消光剤を含まない前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に浸透しおよびそれを標識する、ことを特徴とする方法。 - 請求項20に記載の方法であって、さらに少なくとも1種の標的微生物の存在または不在について試料を分析する工程を含み、
該工程が、
前記調製された試料を、前記試料中の非標的粒子と結合するように選択される樹脂と組み合わせるステップと;
前記核酸染色剤を前記調製された試料に加える前に、前記樹脂を、前記調製された試料から除去するステップであり、前記樹脂は、それとともに前記非標的粒子を保持するステップと、を含むことを特徴とする方法。 - 前記樹脂は、濾過により前記試料から除去されることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 前記試料は、樹脂の使用により前記試料中の粒子状物質の少なくとも一部を除去することにより調製されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記試料は、樹脂の使用により前記試料中の粒子状物質の少なくとも一部を除去することにより調製されることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 試料中の少なくとも1種の微生物を検出するためのキットであって、バックグラウンドシグナル低減分子または蛍光消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤の少なくとも1種と;消光剤を含まない核酸染色剤とを含み、
前記キットは任意選択的に、前記試料中の非標的粒子に結合しうる樹脂を含んでいてもよく、
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、消光剤を含まない前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で前記試料中の非標的粒子と結合し、
蛍光消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に実質的に浸透せず、前記蛍光消光剤は、スペクトル重複により、消光剤を含まない前記核酸染色剤の蛍光シグナルを消光し、
蛍光消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、消光剤を含まない前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で非標的粒子と結合し;
消光剤を含まない前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に浸透しおよびそれを標識し、および、
前記樹脂は、前記試料中の非標的粒子と結合するように選択される、ことを特徴とするキット。 - フローサイトメトリーアッセイにおけるバックグラウンドシグナル強度を低減するためのバックグラウンドシグナル低減剤であって、複合マトリックスと少なくとも1種の微生物とを含有する試料中の非標的粒子と結合するバックグラウンドシグナル低減分子を含み、
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記試料中の生存微生物の存在または不在を検出するために前記試料に加えられる核酸染色剤が前記非標的粒子と結合するのと同様にして同様の効率で、前記非標的粒子と結合し、
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、構造Y−(CH=CH)n−CH=Z、またはその塩の構造を有し、式中、
Yは、
nは、0または最大約5の整数であり;
Xは、炭素または硫黄のいずれかであり;
R1は、場合により、水素、1〜6個の炭素原子を有するアルキル基、サルファイト部分、またはアルキルアミドであり、前記バックグラウンドシグナル低減分子の前記生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択でき;
Zは、Yと同じかまたは異なるかのいずれかである、ことを特徴とするバックグラウンドシグナル低減剤。 - nは、0または最大約3の整数であることを特徴とする請求項26に記載のバックグラウンドシグナル低減剤。
- Yは、それに縮合したベンゼン部分;それに縮合したベンゼン部分誘導体;およびキノロン置換基からなる群から選択され、
前記ベンゼン部分、ベンゼン部分誘導体、およびキノロンは、置換されていても置換されていなくてもよい、ことを特徴とする請求項26に記載のバックグラウンドシグナル低減剤。 - nは、0または最大約3の整数であり;Xは、硫黄であり、R1は、アルキルアミドであり;Yは、それに縮合したベンゼンまたはベンゼン誘導体を有することを特徴とする請求項28に記載のバックグラウンドシグナル低減剤。
- 前記バックグラウンドシグナル低減分子は、
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