CN107643238A - 一种定量检测血液循环微粒浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量检测血液循环微粒浓度的方法，属于血液成分计量分析技术领域。本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法，包括以下步骤：采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤；将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；所述染色为：采用Annexin V抗体对微粒进行染色。本发明提供的检测方法避免了离心对微粒定量的影响，减少了红细胞和白细胞对流式细胞技术定量微粒的误差，避免了使用昂贵计数微球，更易于在临床普及。

Description

一种定量检测血液循环微粒浓度的方法

技术领域

本发明涉及血液成分计量分析技术领域，尤其涉及一种定量检测血液循环微粒浓度的方法。

背景技术

血液中微粒是由血液细胞、血管内皮细胞、血小板等在受到刺激活化后形成的，能直接而特异性地反映其来源细胞的功能状态，为揭示血液或血管性疾病及与血管相关的疾病的发病机制、发展趋势提供依据，也可作为鉴别诊断、临床疗效的指征之一，因而检测血液中微粒具有重要意义。

现有技术中，血液中循环微粒检测通常将待测血液使用高速离心后经荧光标记进行流式细胞技术。然而离心过程会造成循环微粒的破坏、融合，也会造成更多的微粒吸附在沉降的血细胞表面，导致循环微粒的表型改变以及循环微粒定量减低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测血液循环微粒浓度的方法。本发明提供的检测方法避免了离心对微粒定量的影响，减少了红细胞和白细胞对流式细胞技术定量微粒的误差，避免了使用昂贵计数微球，更易于在临床普及。

本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法，包括以下步骤：

采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤；

将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；

所述染色为：采用AnnexinV抗体对微粒进行染色。

优选的是，所述稀释用缓冲液包括PBS、0.9％氯化钠等渗溶液中的一种。

优选的是，所述稀释的倍数为5～100倍体积。

优选的是，所述滤膜的材质为聚苯烯。

优选的是，所述过滤的速度为10～100ul/s。

优选的是，所述抗体染色后，避光孵育25～30min。

本发明还提供了一种定量检测血液循环微粒浓度的方法，包括以下步骤：

采用流式细胞仪检测上述技术方案所述前处理方法得到的待测样品中微粒和血小板的比例；

采用血细胞计数仪检测所述待测样品中血小板的浓度，根据所述微粒和血小板的比例以及血小板的浓度得到微粒的浓度。

本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法。前处理方法中的稀释和过滤操作实现了红细胞、白细胞和细胞碎片的去除，避免了离心对微粒定量的影响，以及红细胞和白细胞对流式细胞技术定量微粒的误差，操作简单且检测准确度高。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的定量检测血液循环微粒浓度的操作示意图；

图2为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪对微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，其中图2-1为高灵敏度流式细胞仪对微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，图2-2为使用Biocytex公司的Megamix-SSC荧光微球对微粒区域设置的检测图；

图3为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪定量检测过滤后血液样本的检测图，其中图3-1为高灵敏度流式细胞仪定量检测过滤后血液样本中微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，图3-2为高灵敏度流式细胞仪定量检测过滤后血液样本中AnnexinV+微粒检测图；

图4为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪血浆样本的检测图，其中图4-1为高灵敏度流式细胞仪定量检测血浆样本中使用Biocytex公司的Megamix-SSC荧光微球对微粒区域设置的检测图，图4-2为高灵敏度流式细胞仪定量检测血浆样本中AnnexinV+微粒的检测图；

图5为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪定量检测全血样本的检测图，其中图5-1为高灵敏度流式细胞仪定量检测全血样本中微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，图5-2为高灵敏度流式细胞仪定量检测全血样本中AnnexinV+微粒检测图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法，包括以下步骤：

采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤；

将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；

所述染色为：采用AnnexinV抗体对微粒进行染色。

本发明采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤。本发明对所述血液没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的检测用血液样品即可，如使用大规格采血针(≥21G)收集血液，舍弃初始收集的1～3毫升血液，加入抗凝剂，在5min内对血液样品进行处理。本发明对所述抗凝剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售抗凝剂即可，如柠檬酸钠。

在本发明中，所述稀释用缓冲液包括PBS、0.9％氯化钠等渗溶液中的一种。在本发明中，所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.2～7.4。在本发明中，所述血液和缓冲液的体积比优选为1：(5～100)，更优选为1：50。在本发明中，所述缓冲液能够降低血液的粘稠度和密度，增加微粒的沉降速度，提升过滤速度，处理时间的减少也可以避免微粒的产生。本发明使用5μm滤膜的滤膜进行过滤可以去除血液中大部分白细胞和红细胞，以及部分细胞碎片，提高微粒在样本中的百分率，减少检测误差。

在本发明中，所述滤膜的材质为聚苯烯。

在本发明中，所述过滤的速度为10～100ul/s，更优选为50ul/s。

得到过滤后的血液后，本发明将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；所述染色为：采用AnnexinV抗体对微粒进行染色。本发明对所述染色方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的流式细胞仪检测样品染色方法即可。本发明对AnnexinV抗体的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的AnnexinV抗体的常规市售产品即可，如购自Sigma公司。在本发明中，由于微粒直径较小，无法明显与背景噪音区分，本发明采用荧光抗体(AnnexinV抗体)进行标记，能够实现AnnexinV阳性微粒的高效检测。在本发明中，流式细胞仪检测过程中血小板能够明显和背景噪音区分，故不对血小板进行染色。

在本发明中，所述抗体染色后，避光孵育25～30min，更优选为28min。

本发明还提供了一种定量检测血液循环微粒浓度的方法，包括以下步骤：

采用流式细胞仪检测上述技术方案所述前处理方法得到的待测样品中微粒和血小板的比例；

采用血细胞计数仪检测所述待测样品中血小板的浓度，根据所述微粒和血小板的比例以及血小板的浓度得到微粒的浓度。

在本发明中，所述流式细胞仪优选为高灵敏度流式细胞仪，所述高灵敏度流式细胞仪能够检测并区分直径200nm以及之上的颗粒。具体的，高灵敏度流式细胞仪例如贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪、贝克曼库尔特Navios流式细胞仪，BD FACSVerse^TM流式细胞仪等结合Biocytex公司的Megamix荧光微球可以将直径为300nm的微粒与背景噪明显区分开来。在本发明中，采用AnnexinV标记微粒，流式细胞仪能够对样品中的微粒进行分析；通过Megamix荧光微球设置阈值，可计算AnnexinV+MPs与Plt比例。本发明通过将微粒与血小板进行比较，计算微粒的浓度，与传统的检测微粒方法(直接计数微球)相比，成本降低，更有利于临床推广。

平行处理的另外一个过滤样本使用血细胞计数仪计算血小板绝对数量，从而可以计算出AnnexinV+MPs数量。

具体的，使用BD公司的FACSVerse^TM流式细胞仪和Biocytex的Megamix-Plus SSC为例：根据0.20～0.5um荧光微球设定MPs区域选定MPs，直径大于此阈值的云团选定为Plt。在对不同组流式检测时，使用荧光单染组与所有同型对照设组设定光补偿。在荧光染色组中检测出AnnexinV+MPs与Plt比例为G％。

使用血细胞计数仪分析原血液样本中血小板的绝对浓度为M。

根据公式血液中微粒浓度C(MPs)＝G％*M。

下面结合具体实施例对本发明提供的一种定量检测血液循环微粒浓度的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

定量检测血液循环微粒浓度的操作示意图如图1所示。

取500ul血液样本与0.45ml抗凝剂柠檬酸钠和4.05mLPBS稀释用缓冲液缓慢混合，得到溶液①。所述柠檬酸钠原溶液的质量分数为4％，所述PBS浓度为0.01mol/L，PH在7.2～7.4之间，本例选用7.3。

吸取稀释样本，使用Millpore 5μm过滤器(货号：SLSV025NB)除去大部分血细胞，收集过滤后的血液，即溶液②

比较例的设置：

传统检测方法组：取相同血液样本1ml，先经过2000g离心20min后取上清液为溶液③

单纯血液组：取相同血液样本500ul为溶液④。

流式抗体染色

流式分组为：三种溶液②/③④，溶液②为过滤后稀释血液样本，溶液③为传统检测方法的样本，溶液④为未过滤的全血液样本。在此次试验中溶液③和④为②的对照，溶液③为观察传统流式方法与新方法的差异性，溶液④是观察未除红细胞和白细胞对实验结果产生的影响。每种溶液均设置ABC三组。

A组：阴性对照组

B组：AnnexinV–FITC单染组(AnnexinV为标记微粒的抗体，FITC为一种荧光标记物)；

C组：同型对照FITC+组(此组为单纯FITC荧光标记物，用于B组的对照试验)；

根据表1分别向三只流式管中加入不同试剂，避光孵育25～30min，后上机检测。

表1 不同试剂添加情况

表1备注：在对溶液③进行检测时需加入10ul的计数微球，用于计算血浆中微粒数目。

使用BD公司的FACSVerse^TM流式细胞仪和Biocytex的Megamix-Plus SSC为例。由不了解研究目的的检验员在高灵敏度流式细胞仪检测。根据0.20～0.50um荧光微球设定MPSgate选定MPs，直径大于此阈值的云团选定为PLt。结果如图2所示：

图2-1：为血液过滤处理组溶液②和全血组溶液④在检测时使用的Biocytex的Megamix-SSC荧光微球设置MPs区域的图像。

图2-2：为检测血液过滤处理组溶液②和全血组溶液④在检测时使用的Biocytex的Megamix-SSC荧光微球设置MPs区域的准确性，其中带有荧光的三种微球直径0.2um，0.24um，0.5um均在设置的MPs区域(P5门)内。

由图2得出的结论是：1、在检测血液过滤处理组溶液②和全血组溶液④时使用对BD公司的FACSVerse^TM流式细胞仪可以检测并区分200nm的颗粒，符合高灵敏度的要求。2、利用Biocytex的Megamix-SSC微球可以准确设置MPs的区域。

在对不同组(过滤后血液样本组溶液②，血浆样本组溶液③和全血样本组溶液④)流式检测时，使用荧光单染(B)组同型对照设组(C组)设定光补偿，与背景噪明显区分的为血小板，红细胞和白细胞，与背景噪音无法明显区分使用AnnexinV-FITC抗体标记AnnexinV+MPs。在B组中检测AnnexinV+MPs出Plt与比例为G％。结果如图3，图4和图5所示：

图3-1：为溶液②组在流式细胞仪检测中的设门图，P5代表微粒(MPs)，P3代表血小板和白细胞，P4代表红细胞；

图3-2：为溶液②使用AnnexinV-FITC染色后，其右上区域代表AnnexinV+MPs(AnnexinV阳性的微粒)，此图可得出AnnexinV+MPs的比例；

图4-1：为血浆样品③在检测时使用的Biocytex的Megamix-SSC荧光微球设置MPs区域的图像；

图4-2：为血浆样品③进行AnneixinV-FITC染色后，图示标识的范围为AnnexinV+MPs，此图可得出AnnexinV+MPs的数目；

图5-1：为溶液④组在流式细胞仪检测中的设门图，P5代表微粒，P3代表血小板和白细胞，P4代表红细胞；

图5-2：为溶液④使用AnnexinV-FITC染色后，其右上区域代表AnnexinV+MPs(AnnexinV阳性的微粒)，此图可得出AnnexinV+MPs的比例；

使用血细胞计数仪分析溶液①中血小板的绝对浓度为M。

根据公式血液中微粒浓度C(MPs)＝G％*M。

传统方法检测组：

溶液③即血浆样品检测时AnnexinV+MPs与计数微球比例G为4.3，计数微球已知浓度为1*10^6/ml，故血浆中AnnexinV+MPs的浓度为：4.3*10^6/ml

全血样本监测组如表2所示：

即溶液④中红细胞和白细胞比例为：95％，检测的PLT比例为：2.07％，AnnexinV+MPs的比例为：0.1％，血细胞计数仪检测PLT数量为：150*10^6/ml。故计算得出AnnexinV+MPs在血液中浓度为：7.2*10^6/ml

过滤后血液样本组如表2所示：

即溶液②中红细胞和白细胞比例为：23.8％，检测PLT比例为：22.65％,AnnexinV+MPs的比例为：6.1％，血细胞计数仪检测PLT数量为：150*10^6/ml。故计算得出AnnexinV+MPs在血液中浓度为：40*10^6/ml。

表2 全血样本和过滤后血液样本组中微粒检测表

得出的实验结果为：

1、使用AnnexinV对微粒进行染色，能够使微粒和背景噪音明显区分，有利微粒定量。

2、传统方法组检测出MPs的浓度(4.3*10^6/ml)明显低于全血组(40*10^6/ml)和过滤后血液样本组(7.2*10^6/ml)，得出的结论为由于高速离心过程中血细胞的沉降过程中吸附了大量的循环微粒，所以使用血液样本相对于传统离心方法更有优势。

3、全血样本组中红细胞和白细胞比例为95％，经过过滤处理后明显其比例在下调至23.8％。结果显示血液经过过滤后红细胞和白细胞比例减少和微粒与血小板的比例增高十分显著，微粒更容易检测。

4、过滤后血液样本组中微粒的浓度为40*10^6/ml明显高于全血样本组(7.2*10^6/m)，即过滤除去红细胞和白细胞，可以提高流式细胞计数仪对微粒的检测的敏感度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法，包括以下步骤：

采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤；

将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；

所述染色为：采用AnnexinV抗体对微粒进行染色。

2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述稀释用缓冲液包括PBS、0.9％氯化钠等渗溶液中的一种。

3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述稀释的倍数为5～100倍体积。

4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述滤膜的材质为聚苯烯。

5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述过滤的速度为10～100ul/s。

6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述抗体染色后，避光孵育25～30min。

7.一种定量检测血液循环微粒浓度的方法，包括以下步骤：

采用流式细胞仪检测权利要求1～6任意一项所述前处理方法得到的待测样品中微粒和血小板的比例；

采用血细胞计数仪检测所述待测样品中血小板的浓度，根据所述微粒和血小板的比例以及血小板的浓度得到微粒的浓度。