CN104677809B - 隐球菌活力检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了一种隐球菌活力的检测试剂盒，试剂盒采用两种荧光染料分别标记真菌菌体和真菌活力，利用该试剂盒、并借助普通流式细胞仪的辅助，可快速准确分析脑脊液隐球菌数量和活力，本发明还提供了一种利用上述的隐球菌活力检测试剂盒的检测方法，对患者预后判断和临床治疗方案制定具有重要指导意义。

Description

隐球菌活力检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，是一种检测隐球菌活力方法的试剂盒及其检测方法。

背景技术

新生隐球菌是一种重要的病原真菌，可引起隐球菌脑膜炎和播散性隐球菌感染。隐球菌脑膜炎治疗时间长，复发率较高。在隐球菌脑膜炎治疗中困扰临床医生的一个最重要问题是，由于无法在治疗中对隐球菌的活力做出有效判断，从而对疗程的判定缺乏客观的时间标准(洪微,温海,陈滨,廖万清.隐球菌脑膜炎脑脊液真菌学指标的比较研究[J].中华皮肤科杂志,2003,08:48.)。

根据美国感染病学会（IDSA，Infectious Diseases Society of America）隐球菌脑膜炎治疗指南，为了防治隐球菌脑膜炎复发，治疗时间需要延长到1年以上才能保证隐球菌的活力被足够抑制。非艾滋病患者隐球菌脑膜炎治疗过程包括≥4周的两性霉素B联合氟胞嘧啶诱导治疗，8周氟康唑巩固治疗和6-12个月的氟康唑维持治疗(Perfect JR,Dismukes WE,Dromer F,et al.Clinical practice guidelines for the management ofcryptococcal disease:2010update by the infectious diseases society ofamerica.Clin Infect Dis.2010Feb1;50(3):291-322.)。在整个治疗过程中需要根据患者耐受情况和脑脊液中隐球菌活力来调整治疗方案。抗真菌药均有一定的毒副作用，以两性霉素B的肾毒性最为严重，通过监测隐球菌活力早日完成诱导治疗和缩短全部治疗过程有助于改善患者生活水平和减轻患者经济压力。

目前，临床多通过脑脊液隐球菌计数、真菌培养和隐球菌乳胶凝集实验对临床治疗效果进行监测(陈江汉,温海,陈孙孝,吴建华,徐红,朱元杰,熊爱君.隐球菌性脑膜脑炎复发因素的初步分析[J].第二军医大学学报,2005,04:463-464.)。但脑脊液隐球菌计数无法对菌体活力进行判断，无法通过光镜区分有活力和无活力的隐球菌。而真菌培养方法随着治疗时间的延长，培养时间也会延长，这不利于即时对疗效进行跟踪。乳胶凝集实验虽可以半定量对隐球菌菌量进行监测，但其存在滞后性和假阴性可能，临床有患者经过1年正规抗真菌治疗血乳胶凝集滴度仍可低水平阳性。隐球菌脑膜炎患者正规抗真菌治疗后大部分可以达到脑脊液真菌培养阴性，但患者颅内压仍较高，脑脊液墨汁染色可见真菌，乳胶凝集实验仍为阳性，明确此时脑脊液中隐球菌活力对疾病治疗策略的制定至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种隐球菌活力检测试剂盒，本发明另一目的在于提供该试剂盒的检测方法。

本发明的主要技术方案是，试剂盒采用两种荧光染料分别标记真菌菌体和真菌活力，利用该试剂盒、并借助普通流式细胞仪的辅助，可快速准确分析脑脊液隐球菌数量和活力，对患者预后判断和临床治疗方案制定具有重要指导意义。

本发明提供了一种隐球菌活力检测试剂盒，该试剂盒是用流式细胞学方法检测隐球菌活力和数量，该试剂盒包括下列试剂：

检测液A：3.5%（w/v）荧光增白剂（Calcofluor white，CFW），pH值为10；

检测液B：1%（w/v）核酸染色剂碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）；

稀释液C：PBS稀释缓冲液，pH值为7.2。

所述的试剂盒，较佳的，检测液A：1.75mg CFW溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存；

较佳的，检测液B：0.5mg PI溶于0.5ml双蒸水中，避光保存；

较佳的，稀释液C：磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2。

所述的试剂盒，最佳的，包括：1ml的检测液A、1ml的检测液B和50ml的稀释液C。

本发明的试剂盒中配置了下述荧光化合物组合：核酸染色剂碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）、荧光增白剂Calcofluor white(CFW)和PBS稀释缓冲液。PI是一种DNA结合染料，在536nm波长时被激发，产生617nm的红色荧光。PI无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能对细胞膜有破损的死亡细胞进行染色。CFW是一种荧光增白剂，多用于油漆、油墨、涂料等的增白，同时，它也可以与真菌或植物细胞壁多糖特异性结合（如壳聚糖）。CFW在347nm波长光下可被激发出355nm蓝光。

进一步地，本发明还提供了一种利用上述的隐球菌活力检测试剂盒的检测方法，该方法包括如下步骤：

A、将含隐球菌的样本悬液离心1000转/分钟，5分钟，去上清；用稀释液C将沉淀稀释至10⁶个/ml，制成待测标本；

B、将待测标本振荡后进行流式细胞检测调零，调零后的标本中加入检测液A，上机检测，并进行圈门；

C、在步骤B的样本中加入检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞并加以记录和统计分析。

上述的步骤B中采用FL1和FL4通道检测荧光。

上述的步骤C获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A双参数点图中进行设门调整。

本发明采用上述试剂盒和检测方法，应用于隐球菌活力的检测，可以检测脑脊液、肺泡灌洗液等无菌体液中隐球菌的活力。

采用上述试剂盒和检测方法，对脑脊液中隐球菌活力进行分析的方法，包括下述步骤：

步骤一试剂制备

1.1、检测液A为3.5%（w/v）CFW（Calcofluor white）保存液：1.75mg CFW溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存。

1.2、检测液B为1%（w/v）PI（Propidium Iodide,碘化丙啶）保存液：0.5mgPI溶于0.5ml双蒸水中，避光管保存。

1.3、稀释液C为：磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2，取50ml分装。

步骤二样本标记与检测

将脑脊液样本1000转/分离心5分钟，弃上清液，加入1.3中稀释液C200μl，重悬，制成待测标本；

步骤三采用流式细胞仪进行检测

按照流式细胞仪的操作规程，对步骤二中制备的待测标本进行测试。并用Flowjo分析软件进行数据分析。

3.1将重悬的待测标本振荡后进行流式细胞检测，采用二维点图形式进行结果分析：先建立FSC/SSC点图，排除细胞碎片，选取R1区；

3.2在3.1的样本中加入5μl检测液A，再次上机检测，吸样量为50μl，FL1-A/FL4-A双通道检测；

3.3在3.2的样本中加入5μl检测液B，再次上机检测，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A双参数点图中进行调整。

四分门左下象限代表脑脊液中有活力的宿主细胞数a（如白细胞等），右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌数b，左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞数c，右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌数d。每个标本至少连续测定两次，至少记录10000个细胞并加以记录和统计分析。

脑脊液中隐球菌浓度为（b+d）×离心后样本重悬体积/（流式细胞仪吸样量*原始脑脊液体积）。

脑脊液中隐球菌活力比值为b/(b+d)。

通过对隐球菌浓度和活力比值的综合判断可以及时对治疗方案进行调整，若在诱导治疗4周时，隐球菌活力明显下降，则可进入巩固治疗阶段。同时，若在治疗疗程结束后脑脊液中仍有有活力的隐球菌，则延长维持治疗时限，防止疾病复发。由于真菌细胞壁均有胞壁多糖成分，所以格特隐球菌、新生隐球菌和其他少见的隐球菌均可利用该方法进行检测。

采用该技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明的试剂盒采用2种荧光小分子化合物组合，能够准确分析脑脊液中隐球菌的活力，做到临床治疗效果检测和预后判断；（2）本方面使用方法简单、方便，传统培养方法往往需要1周左右的培养时间，而且随菌体活力的下降，培养时间还将延长，本发明可在30分钟内完成检测；（3）利用本试剂盒的荧光小分子化合物组合，为定量分析脑脊液中隐球菌的活力比提供了可能，有利于治疗效果评价的标准化和规范化。

附图说明

图1是两性霉素B治疗5天的隐球菌脑膜炎患者脑脊液样本检测示意图，

其中：图1A为未进行荧光标记的脑脊液上样，图1B为试剂盒双标后脑脊液样本分区图，根据图1B可知患者脑脊液中68.9%的隐球菌尚未死亡；

图2是本发明对实验样本的检测示意图，

其中：实验样本为1×10⁶/ml细胞混悬液上样，细胞悬浮液为小鼠外周血循环白细胞与隐球菌1:4混合液；图2A为正常隐球菌与小鼠白细胞混悬液，图2B为热灭活隐球菌与小鼠白细胞混悬液。根据流式细胞检测结果可知混合液中含有隐球菌8.03×10⁵/ml，白细胞1.83×10⁵/ml，与原始混合液配比基本一致。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。以下就本发明所提供的一种检测隐球菌活力试剂盒和检测方法做进一步说明。

实施例1：制备本发明的试剂盒

本发明的试剂盒各成分信息如下

检测液A为3.5%（w/v）CFW（Calcofluor white，购自Sigma-Aldrich公司，货号F3543）保存液：1.75mg CFW溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存。

所述检测液B为1%（w/v）PI（Propidium Iodide,碘化丙啶，上海将来试剂，货号A007233）保存液：0.5mg PI溶于0.5ml双蒸水中，避光保存。

所述稀释液C为：磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2，取50ml分装。

实施例2：脑脊液中隐球菌活力检测

1.相关试剂配制

相关试剂配制参照实施例1

2.检测过程

2.1隐球菌脑膜炎脑脊液常规检查过程中留取将脑脊液样本5ml，1000转/分水平离心机离心5分钟，弃上清液，加入稀释液C200μl，重悬，制成待测标本；

2.2将200μl重悬的标本振荡后进行流式细胞检测调零（图1A）；

2.3在2.2调零后的标本中加入5μl检测液A，再次上机检测，吸样量为30μl，回避细胞碎片，选取大小正常的细胞群体进行分析进行，采用FL1和FL4通道检测荧光；

2.4在2.3的样本中加入5μl检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A双参数点图中进行设门调整。

3.结果

结果见图1B

四分门左下象限代表脑脊液中有活力的宿主细胞（21.3%），右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌（54.4%），左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞（0.24%），右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌（24%）。由此可计算脑脊液中69.4%的隐球菌未死亡。

实施例3：本发明检测方法敏感性和特异性检测

1.相关试剂配制

相关试剂配制参照实施例1

2.实验样本准备

2.1采用眼眶取血方法取小鼠外周血0.5ml，红细胞裂解液裂解红细胞，1000rpm离心后稀释液C重悬，用血细胞计数板将白细胞调整至1×10⁶/ml。

2.2将培养的隐球菌用稀释液C重悬后，稀释成1×10⁶/ml菌悬液。取0.5ml该浓度菌悬液备用，再取0.5ml菌悬液90℃水浴灭活10min。将正常菌悬液和灭活菌悬液分布与2.1中白细胞悬液按4:1比例混匀，配置成1×10⁶/ml混合细胞悬浮液A和B（白细胞：隐球菌为1:4）。

3.实验样本检测

3.1各取2.2中细胞悬浮液A和细胞悬浮液B0.5ml，将其振荡后进行流式细胞检测调零；

3.2在3.1调零后的样本中加入5μl检测液A，再次上机检测，吸样量为30μl，回避细胞碎片，选取大小正常的细胞群体进行分析进行，采用FL1和FL4通道检测荧光；

3.3在3.2的样本中再加入5μl检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A双参数点图中进行设门调整。

4.结果

细胞悬液A结果为图2A，细胞悬液B结果为图2B。

图2A为小鼠白细胞与未灭活隐球菌1:4混合的细胞悬液，左下象限代表细胞悬液中有活力的白细胞（21.5%），右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌（76.2%），左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞（0.192%），右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌（2.12%）。结果与细胞悬液配置比基本一致。

图2B为小鼠白细胞与灭活隐球菌1:4混合的细胞悬液，左下象限代表细胞悬液中有活力的白细胞（18.3%），右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌（0.791%），左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞（0.638%），右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌（80.3%）。结果与细胞悬液配置比基本一致。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (9)

1.一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒是用流式细胞学方法检测脑脊液、肺泡灌洗液中隐球菌活力和数量，该试剂盒包括下列试剂：

检测液A：3.5％w/v的荧光增白剂，pH值为10；

检测液B：1％w/v的核酸染色剂碘化丙啶；

稀释液C：PBS稀释缓冲液，pH值为7.2。

2.根据权利要求1所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的检测液A：1.75mg荧光增白剂溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存。

3.根据权利要求1所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的检测液B：0.5mg碘化丙啶溶于0.5ml双蒸水中，避光保存。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的稀释液C：磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2。

5.根据权利要求4所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，包括：1ml的检测液A、1ml的检测液B和50ml的稀释液C。

6.一种利用权利要求1所述的隐球菌活力检测试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A、将含隐球菌的样本悬液离心1000转/分钟，5分钟，去上清；用稀释液C将沉淀稀释至10⁶个/ml，制成待测标本；

B、将待测标本振荡后进行流式细胞检测调零，调零后的标本中加入检测液A，上机检测，并进行圈门；

C、在步骤B的样本中加入检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞并加以记录和统计分析。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤B中采用FL1和FL4通道检测荧光。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤C获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A双参数点图中进行设门调整。

9.一种利用权利要求1所述的隐球菌活力检测试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

步骤一试剂制备：

1.1、检测液A为3.5％w/v的荧光增白剂保存液：1.75mg荧光增白剂溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存；

1.2、检测液B为1％w/v的碘化丙啶保存液：0.5mg碘化丙啶溶于0.5ml双蒸水中，避光管保存；

1.3、稀释液C为：磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2，取50ml分装；

步骤二样本标记与检测：

将脑脊液样本1000转/分离心5分钟，弃上清液，加入1.3中稀释液C200μl，重悬，制成待测标本；

步骤三采用流式细胞仪进行检测：

按照流式细胞仪的操作规程，对步骤二中制备的待测标本进行测试，并用Flowjo分析软件进行数据分析，

3.1将重悬的待测标本振荡后进行流式细胞检测，采用二维点图形式进行结果分析：先建立FSC/SSC点图，排除细胞碎片，选取R1区；

3.2在3.1的样本中加入5μl检测液A，再次上机检测，吸样量为50μl，FL1-A/FL4-A双通道检测；

3.3在3.2的样本中加入5μl检测液B，再次上机检测，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/VioBlue-A双参数点图中进行调整。