CN111307694A - 一种活动精子dna碎片流式细胞术检测方法 - Google Patents
一种活动精子dna碎片流式细胞术检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111307694A CN111307694A CN202010145407.9A CN202010145407A CN111307694A CN 111307694 A CN111307694 A CN 111307694A CN 202010145407 A CN202010145407 A CN 202010145407A CN 111307694 A CN111307694 A CN 111307694A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sperms
- sperm
- flow cytometry
- detection method
- cytometry detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 18
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims abstract description 7
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 5
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 3
- 239000011964 heteropoly acid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000000270 postfertilization Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，特点是包括以下步骤：(1)将5～10万个精子加入500μL含有钼酸铵、曲拉通的盐酸缓冲液，混匀30秒后加入罗丹明6G和吖啶橙染色液；(2)流式细胞仪上机检测，收集绿、黄、红等三色发射荧光信号；(3)结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况，优点是实现了一次性流式细胞术检测活动精子DNA碎片情况，且简单、高效。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，尤其是涉及一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法。
背景技术
受精过程中，精子贡献了一半的遗传物质DNA。精子DNA完整性可影响精子受精能力、受精后原核的形成、胚胎着床、胚胎发育及子代的健康，精子DNA碎片化指数(DNAfragmentation index，DFI)已经成为评估男性生育力的重要指标。传统方法是检测了所有精子的DFI，即包括死精子、不活动精子和活动精子的DFI混合情况。无论是自然受孕，还是辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)治疗过程中，只有活动的精子才被分选出来和应用于受精，故理论上活动精子DFI才是隐藏的、被忽视的重点。
精子的活动与精子尾部有关，精子运动靠着精子尾部鞭毛摆动产生动力。目前认为精子运动是按照滑动模式进行的。其基本原理是：动力蛋白水解ATP(三磷酸腺苷)驱动临近微管间的相对滑动。精子尾部鞭毛中动力蛋白ATPase(三磷酸腺苷酶)以ATP作为底物，通过水解ATP成为ADP(二磷酸腺苷)和pi(磷酸)而获得能量，促使鞭毛轴丝中的双联微管中A微管的两行支臂，不断脱离并重新依附于相邻双微管中B微管上连续结合的位点，从而产生双联微管间的滑动并产生一个纵向力；与双联微管有关的各种附属结构形成的滑动抗力，使由支臂产生的纵向力转化为横向弯曲动力，引起浪状波的形成和传播。换句话说，通过检测精子尾部ATP降解成为ADP和pi的情况，可从根源上检测和反应活动精子情况。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、高效地检测和区分活动精子和非活动精子的DNA碎片情况的活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
(1)将精液中5～10万个精子加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；
(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集精子的绿(530nm)色、黄(556nm)色和红(640nm)色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；
(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。
步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X 100(曲拉通)，溶剂为水。主要成分为曲拉通、盐酸、钼酸铵，目的是：A、促使细胞膜通透性增加，使染料容易进入精子细胞；B、提供酸环境便于磷钼杂多酸与罗丹明6G形成缔合物；C、使紧密的DNA变得结构较为松散，以便于吖啶橙染色；D、酸可以固定细胞，阻抑了荧光染料与细胞其他成分如蛋白质、多糖和细胞膜等结合，降低背景信号。
步骤(1)所述的染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水。
优先的，步骤(1)所述的染色液的配方为60mmol/L罗丹明6G、6μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，通过检测精子动力蛋白水解ATP产生的Pi(磷酸)，以及精子DNA碎片酸化处理后产生的单链DNA来实现，精子中pi情况可采用流式细胞术法来检测：运动的精子，其动力蛋白ATP酶水解ATP产生的Pi，Pi与加入的钼酸铵反应产生磷钼杂多酸，与加入的罗丹明6G(R6G)荧光探针结合形成缔合物，该缔合物能被激发出的荧光强度大大下降；而精子细胞中未结合的R6G具有非常高的耐光性，高量子产率，低损耗，最大激发波长为530nm，激发波长范围从555nm至585nm，其最大波长为556nm，从而可通过流式细胞仪激发(激发波长Ex＝530nm)和产生荧光(发射波长Em＝556nm)来定量检测，根据荧光情况区分活动精子(缔合物多荧光弱)和非活动精子(未结合的R6G多荧光强)。精子DNA碎片情况可采用吖啶橙染色后流式细胞仪检测：吖啶橙是一种极灵敏的荧光染料，它可以与精子细胞中双链DNA和单链DNA同时染色而显示不同颜色(波长)的荧光，其激发波长峰为492nm，发射荧光波长峰为530nm(双链DNA)和640nm(单链DNA)，从而可通过流式细胞仪识别检测荧光颜色和计算DNA碎片情况。
综上所述，本发明一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，通过对精子样本进行处理、染色，荧光标记、流式上机检测活动精子中Pi和DNA碎片情况、从而评估活动精子的DNA损伤程度，为不育症检查、辅助生殖治疗方案的选择提供帮助。该方法避免了传统方法不能区分活动和非活动精子DNA碎片情况，实现了一次性完成活动精子DNA碎片检测的简单、高效的目的。
附图说明
图1为精子细胞群图形，图中用圈中区域(方框内)即为精子细胞主群；
图2为精子细胞群黄色荧光表达图，图中分为二群细胞，横轴上左峰(实线杠区间内)即为活动精子，横轴上的右峰(虚线杠区间内)为非活动精子细胞群。
图3为精子细胞群绿色和红色荧光表达图，图中分为二群细胞，靠近纵轴的群(三角框内的为绿色)为DNA完整性好的细胞群，靠近横轴的细胞群(三角框内右侧下方的为红色)为DNA碎片化的细胞群。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，包括以下步骤：
(1)将20份精液自然液化后，于37℃温度下，采用MAKLER精子计数板检测精子浓度和活动精子比率(结果见下表1)；
(2)采用移液器将5-10万个精子加入500μL含有钼酸铵的酸化处理缓冲液，充分混匀；其中酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸(HCl)、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠(NaCl)、0.1％Triton-X 100(曲拉通)，溶剂为水；
(3)混匀，置冰上30秒后加入10μL含有罗丹明6G和吖啶橙的染色液，5-30分钟内上机检测；其中染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，溶剂为水；
(4)清空Calibur流式细胞仪废液桶，断开废液桶管路连接，再加入漂白液(100-200mL的84消毒液或5wt％次氯酸钠溶液)入废液桶，重新连接好废液桶管路，确保连接紧密；检查鞘液桶的液面水平，如果需要，加入鞘液(0.05％Triton-X 100的ddH2O)至3L(鞘液桶容积4L)，盖紧桶盖；检查鞘液过滤器及鞘液管道，确保过滤器和鞘液管路中没有气泡；
(5)打开电源变压器；打开BD FACSCalibur电源开关，在开始检测样本前，使仪器预热30min。
(6)设定Calibur流式细胞仪的参数，包括开启激发激光，设定激发波长信号通道；上机检测，调节电压和信号放大倍数，绿荧光强度中位数处于收集范围的中部为400～600，红荧光强度中位数为50～100；检测红色、绿色荧光时，显示其为“peak signal”(或“heightsignal”)，而不是“area signal”；显示的结果图包括有：双参数散点图(X轴为FSC，Y轴为SSC)(1000channels)；双参数散点图(x轴为红光，Y轴为绿光)(1000channels)；单参数直方图(x轴为黄光)(1000channels)；
(7)在工具栏“Acquisition Control”窗口，点击“Acquire”菜单上的“counter”以观察并调整流速；调整精子浓度和流速，每秒检测约200个精子；每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞流式软件统计分析设定流式细胞仪的校准；
(8)染色后的精子细胞悬液通过流式细胞仪收集精子的红、黄、绿三种荧光信号，通过收集到的红色荧光精子占收集精子总数的比例，判定总体样本的DNA碎片情况(结果见下表)；
(9)通过黄色荧光信号情况计算活动精子比率，并与MAKLER精子计数板检测到的活动精子比率相比较(结果见下表)；
(10)通过收集到的黄色荧光精子占收集精子总数的比例，判定样本的活动精子比率；通过收集到的红色荧光精子占收集精子总数的比例，判定总体样本的DNA碎片化程度；结合三种荧光情况判定活动精子DNA碎片情况，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况；并与总体精子DNA碎片相比较(结果见下表)。
(11)结果判断依据于建立的图像收集模板，如图1所示，为精子细胞群图形，图中用门圈中区域即为精子细胞主群；图2为精子细胞群黄色荧光表达图，图中分为二群细胞，横轴上左峰即为活动精子，横轴上的右峰为非活动精子细胞群。图3为精子细胞群绿色和红色荧光表达图，图中分为二群细胞，靠近纵轴的群即为DNA完整性好的细胞群，靠近横轴的细胞群即为DNA完整性差的细胞群；
(12)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光染料。
上表统计学结果表明，通过常规的MAKLER精子计数板检测的活动精子比率与流式细胞术检测的活动精子比率间没有统计学差异，即通过检测精子中动力蛋白水解ATP产生的Pi来检测活动精子情况；大部分活动精子的DNA碎片率比总体精子样本的DNA碎片率要低，两者检测结果有统计学差异。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将精液中5～10万个精子加入到500μL酸化处理缓冲液中，混匀，置冰上30秒；
(2)在步骤(1)得到的混合液中加入10μL染色液，5-30分钟内上机检测，设定流式细胞仪的参数，包括激发波长和激发波长通道，收集精子的绿色、黄色和红色荧光信号，每管样本至少记录样本主群5000个细胞；
(3)流式软件统计分析：结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。
2.根据权利要求1所述的一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的酸化处理缓冲液的配方为80-800mmol/L盐酸、14-28mmol/L钼酸铵、0.15mol/L氯化钠、0.1％Triton-X 100，溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的染色液的配方为20-400mmol/L罗丹明6G、1-50μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.15mol/L氯化钠，溶剂为水。
4.根据权利要求3所述的一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的染色液的配方为60mmol/L罗丹明6G、6μg/mL吖啶橙、0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.15mol/L氯化钠，溶剂为水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010145407.9A CN111307694A (zh) | 2020-03-04 | 2020-03-04 | 一种活动精子dna碎片流式细胞术检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010145407.9A CN111307694A (zh) | 2020-03-04 | 2020-03-04 | 一种活动精子dna碎片流式细胞术检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111307694A true CN111307694A (zh) | 2020-06-19 |
Family
ID=71149563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010145407.9A Pending CN111307694A (zh) | 2020-03-04 | 2020-03-04 | 一种活动精子dna碎片流式细胞术检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111307694A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114136866A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-03-04 | 桂林优利特医疗电子有限公司 | 一种精子核dna完整性检测方法及检测试剂盒 |
| CN114295596A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 无锡代际生物科技有限公司 | 精子质量多参数检测试剂盒 |
| CN114295595A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 无锡代际生物科技有限公司 | 活动精子dna碎片检测试剂盒及检测方法 |
| CN114324274A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-12 | 重庆市人口和计划生育科学技术研究院 | 特异性核酸荧光染色反应液及其在精子dna完整性检测中的应用 |
| CN116908078A (zh) * | 2023-09-14 | 2023-10-20 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种检测精子dfi的方法、装置、存储介质及设备 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4559309A (en) * | 1982-09-01 | 1985-12-17 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm |
| US6004767A (en) * | 1996-12-24 | 1999-12-21 | Btg International Limited | Assay and kit for determining the condition of cells |
| CN101319251A (zh) * | 2008-05-28 | 2008-12-10 | 山东省计划生育科学技术研究所 | 一种精子染色质扩散实验检测精子dna碎片的方法 |
| CN102051413A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-05-11 | 谌兵来 | 一种人类精子dna碎片检测方法及检测试剂盒 |
| CN103278649A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-09-04 | 深圳市博锐德生物科技有限公司 | 精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN103335933A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-10-02 | 浙江星博生物科技有限公司 | 一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂 |
| CN106932330A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-07-07 | 浙江星博生物科技股份有限公司 | 一种基于流式细胞术的精子dfi检测方法 |
| US20180142283A1 (en) * | 2014-10-29 | 2018-05-24 | Biotium, Inc. | Nucleic acid modifying agents and uses thereof |
| CN108398407A (zh) * | 2018-01-25 | 2018-08-14 | 迈克博（天津）生物科技有限公司 | 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒 |
-
2020
- 2020-03-04 CN CN202010145407.9A patent/CN111307694A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4559309A (en) * | 1982-09-01 | 1985-12-17 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm |
| US6004767A (en) * | 1996-12-24 | 1999-12-21 | Btg International Limited | Assay and kit for determining the condition of cells |
| CN101319251A (zh) * | 2008-05-28 | 2008-12-10 | 山东省计划生育科学技术研究所 | 一种精子染色质扩散实验检测精子dna碎片的方法 |
| CN102051413A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-05-11 | 谌兵来 | 一种人类精子dna碎片检测方法及检测试剂盒 |
| CN103278649A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-09-04 | 深圳市博锐德生物科技有限公司 | 精子酪氨酸磷酸化的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN103335933A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-10-02 | 浙江星博生物科技有限公司 | 一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂 |
| US20180142283A1 (en) * | 2014-10-29 | 2018-05-24 | Biotium, Inc. | Nucleic acid modifying agents and uses thereof |
| CN106932330A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-07-07 | 浙江星博生物科技股份有限公司 | 一种基于流式细胞术的精子dfi检测方法 |
| CN108398407A (zh) * | 2018-01-25 | 2018-08-14 | 迈克博（天津）生物科技有限公司 | 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 孙静波等: "精子DNA完整性与精液参数的相关性研究", 《中国男科学杂志》 * |
| 季相山等: "鱼类精子质量评价研究进展", 《中国水产科学》 * |
| 张宁等: "精子染色质结构分析与精液参数的相关性研究", 《中华男科学》 * |
| 齐文启等: "《环境监测实用技术》", 30 June 2006, 中国环境科学出版社 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114136866A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-03-04 | 桂林优利特医疗电子有限公司 | 一种精子核dna完整性检测方法及检测试剂盒 |
| CN114324274A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-12 | 重庆市人口和计划生育科学技术研究院 | 特异性核酸荧光染色反应液及其在精子dna完整性检测中的应用 |
| CN114324274B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-01-05 | 重庆市人口和计划生育科学技术研究院 | 特异性核酸荧光染色反应液及其在精子dna完整性检测中的应用 |
| CN114295596A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 无锡代际生物科技有限公司 | 精子质量多参数检测试剂盒 |
| CN114295595A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 无锡代际生物科技有限公司 | 活动精子dna碎片检测试剂盒及检测方法 |
| CN114295596B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-04-05 | 无锡代际生物科技有限公司 | 精子质量多参数检测试剂盒 |
| CN114295595B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-04-09 | 无锡代际生物科技有限公司 | 活动精子dna碎片检测试剂盒及检测方法 |
| CN116908078A (zh) * | 2023-09-14 | 2023-10-20 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种检测精子dfi的方法、装置、存储介质及设备 |
| CN116908078B (zh) * | 2023-09-14 | 2023-12-05 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种检测精子dfi的方法、装置、存储介质及设备 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111307694A (zh) | 一种活动精子dna碎片流式细胞术检测方法 | |
| CN108398407B (zh) | 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒 | |
| Evenson et al. | Rapid determination on sperm cell concentration in bovine semen by flow cytometry | |
| Smart et al. | Use of methylene violet staining procedures to determine yeast viability and vitality | |
| Crissman et al. | Rapid, one step staining procedures for analysis of cellular DNA and protein by single and dual laser flow cytometry | |
| US20200141858A1 (en) | Nucleated Red Blood Cell Analysis System and Method | |
| Chan et al. | Rapid image-based cytometry for comparison of fluorescent viability staining methods | |
| CN1880942B (zh) | 粒子分析仪用参照物 | |
| US7674598B2 (en) | Method for a fully automated monoclonal antibody-based extended differential | |
| EP1840571B1 (en) | apparatus and method for measuring a hematological sample | |
| US5928949A (en) | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry | |
| CN109612911B (zh) | 全自动精子细胞检测仪 | |
| US8008029B2 (en) | Method and device for characterizing cellular components of a biological fluid | |
| EP0485945A2 (en) | Method of classifying leukocytes by flow cytometry | |
| EP2705135B1 (en) | Basophil analysis method | |
| CN106932330A (zh) | 一种基于流式细胞术的精子dfi检测方法 | |
| CN101086473A (zh) | 试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法 | |
| Gupta et al. | Inter‐and intra‐laboratory standardization of TUNEL assay for assessment of sperm DNA fragmentation | |
| Dolník et al. | Flow cytometry in assessment of sperm integrity and functionality–a review | |
| Sugiuchi et al. | Measurement of total and differential white blood cell counts in synovial fluid by means of an automated hematology analyzer | |
| CN103361401A (zh) | 海产品中简单异尖线虫的TaqManPCR检测法 | |
| Harding et al. | Using the microcyte flow cytometer to monitor cell number, viability, and apoptosis in mammalian cell culture | |
| CN114324274B (zh) | 特异性核酸荧光染色反应液及其在精子dna完整性检测中的应用 | |
| EP0259833B1 (en) | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry | |
| CN115290875A (zh) | 一种6色tbnk淋巴细胞亚群检测试剂盒和检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200619 |