CN103335933A - 一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂,包括顶体反应诱导液和染色液,还包括精子获能液,精子获能液的pH值7.0~7.8,含有氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、乳酸钠溶液,这样用精子获能液代替目前的精子培养液,获能效果好,便于诱导,可以用流式细胞术检测精子顶体反应,使精子顶体反应检测结果准确、稳定可靠、重复性好、临床易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及精子顶体反应检测试剂,具体涉及一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂。
背景技术
精液分析是不育症检查中不可缺少的一项,主要包括精子浓度、活力和形态学检查等,然而这些检查指标不能全面评估男性生育力;且有部分男性不育患者的精液常规检查未见正常,因此,需要引入新的精子功能检测与评价指标。顶体是精子所特有的结构,在识别、结合卵子透明带的过程中,顶体被诱导发生顶体反应,从而实现精子DNA与卵子DNA融合。因此可通过检测精子发生顶体反应的能力来评估精子受精能力。
目前检测精子顶体反应的方法主要是借助电镜、显微镜(荧光显微镜)等方法,如公告号为CN101865844的发明专利,就公开了包括保存液、荧光结合物和荧光封固液作为检测试剂,检测时先用精子培养液(如NaOH、HTF、BWW、M16等)孵育精子获能,再用Ca2+载体作为顶体反应诱导液诱导,通过荧光结合物(染色液)和荧光封固液在荧光显微镜记录顶体反应的精子数量。但此类方法检测结果过于依赖人为操作,检测结果主观性强;操作过程繁琐,检测效率低下,重复性差;部分染色液的配方对精子的损伤较大,影响检测结果的稳定性;有些方法对精液标本要求过高,不适用于常规检测,难以在临床上推广应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种精子获能效果好、便于诱导的基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂,包括顶体反应诱导液和染色液,还包括精子获能液,所述精子获能液的pH 值7.0~7.8,含有浓度为0.05~0.19mol/L的氯化钠、浓度为0.5~2.0 mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为2.0~10.5 mmol/L的葡萄糖、浓度为2.3~7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为0.2~2.4 mmol/L的七水硫酸镁、浓度为0.8~3.4 mmol/L的二水氯化钙、浓度为0.01~0.04 mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐(Hepes-Na)、浓度为2.4~5.6 mmol/L的碳酸氢钠、浓度为0.1~0.5 mmol/L的丙酮酸钠、质量百分浓度为2~10%的牛血清白蛋白(BSA)、体积百分浓度为0.15~0.75%的乳酸钠溶液,所述乳酸钠溶液的浓度为600g/L。
所述染色液分为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液,所述碘化丙啶染色液的pH值7.0~7.8,含有浓度为50~190mmol/L的氯化钠、浓度为2.3~7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为3.2~10mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为0.5~2.0mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为100~1000μg/mL的碘化丙啶(PI)。FITC-PSA荧光染色液的pH值也为7.0~7.8,含有浓度为50~190mmol/L的氯化钠、浓度为2.3~7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为3.2~10mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为0.5~2.0mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为0.2~1mg/mL的异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素(FITC-PSA)。
与现有技术相比,本发明优点在于本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂,包括顶体反应诱导液和染色液,还包括精子获能液,精子获能液的pH 值7.0~7.8,含有氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、乳酸钠溶液,这样用精子获能液代替目前的精子培养液,获能效果好,便于诱导,可以用流式细胞术检测精子顶体反应,使精子顶体反应检测结果准确、稳定可靠、重复性好、临床易于推广。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1、一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂,由顶体反应诱导液、精子获能液、FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液四部份组成,其中顶体反应诱导液由在5mg Ca2+载体A23187溶于9.56mL DMSO中得到。精子获能液由氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、七水硫酸镁、Hepes-Na、碳酸氢钠、丙酮酸钠和BSA于试剂瓶中,加入蒸馏水充分溶解混匀,再加入二水氯化钙溶液和浓度为600g/L的乳酸钠溶液,用1M HCl 调pH值为7.4,再22μm滤膜过滤,配成氯化钠浓度为0.12mol/L、磷酸二氢钾浓度为1.2 mmol/L、葡萄糖浓度为6.0 mmol/L、氯化钾浓度为5.2mmol/L、七水硫酸镁浓度为1.2 mmol/L、二水氯化钙浓度为2.0 mmol/L、Hepes-Na浓度为0.02 mol/L、碳酸氢钠浓度为4.2mmol/L、丙酮酸钠浓度为0.3 mmol/L、BSA质量百分浓度为6%、乳酸钠溶液体积为0.45%的精子获能液。碘化丙啶染色液由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4于试剂瓶中,加入蒸馏水充分溶解混匀,1M HCl调节上述溶液pH值为7.4,再加入PI染料,22μm滤膜过滤,配成氯化钠浓度为120mmol/L、氯化钾浓度为4.5 mmol/L、磷酸氢二钠浓度为6.5mmol/L、磷酸二氢钾浓度为1.2mmol/L、PI浓度为500μg/mL的碘化丙啶染色液。FITC-PSA荧光染色液由NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4于试剂瓶中,加入蒸馏水充分溶解混匀,1M HCl调节上述溶液pH值为7.4,再加入FITC-PSA荧光染料,22μm滤膜过滤,配成氯化钠浓度为120mmol/L、氯化钾浓度为4.5 mmol/L、浓磷酸氢二钠度为6.5mmol/L、磷酸二氢钾浓度为1.2mmol/L、FITC-PSA浓度为0.6mg/mL的FITC-PSA荧光染色液。
实施例2、与实施例1基本相同,所不同的只是精子获能液中,氯化钠浓度为0.05mol/L、磷酸二氢钾浓度为0.5 mmol/L、葡萄糖浓度为2.0 mmol/L、氯化钾浓度为2.3 mmol/L、七水硫酸镁浓度为0.2 mmol/L、二水氯化钙浓度为0.8 mmol/L、Hepes-Na浓度为0.01 mol/L、碳酸氢钠浓度为2.4 mmol/L、丙酮酸钠浓度为0.1 mmol/L、BSA质量百分浓度为2%、乳酸钠溶液体积为0.15%。碘化丙啶染色液中,氯化钠浓度为50mmol/L、氯化钾浓度为2.3 mmol/L、磷酸氢二钠浓度为3.2mmol/L、磷酸二氢钾浓度为0.5mmol/L、PI浓度为100μg/mL。FITC-PSA荧光染色液中,氯化钠浓度为50mmol/L、氯化钾浓度为2.3mmol/L、浓磷酸氢二钠度为3.2mmol/L、磷酸二氢钾浓度为0.5mmol/L、FITC-PSA浓度为0.2mg/mL。它们的pH值都为7.0。
实施例3、与实施例1基本相同,所不同的只是精子获能液中,氯化钠浓度为0.19mol/L、磷酸二氢钾浓度为2.0 mmol/L、葡萄糖浓度为10.5 mmol/L、氯化钾浓度为7.8 mmol/L、七水硫酸镁浓度为 2.4 mmol/L、二水氯化钙浓度为3.4 mmol/L、Hepes-Na浓度为0.04 mol/L、碳酸氢钠浓度为5.6 mmol/L、丙酮酸钠浓度为0.5 mmol/L、BSA质量百分浓度为10%、乳酸钠溶液体积为0.75%。碘化丙啶染色液中,氯化钠浓度为190mmol/L、氯化钾浓度为7.8 mmol/L、磷酸氢二钠浓度为10mmol/L、磷酸二氢钾浓度为2.0mmol/L、PI浓度为1000μg/mL。FITC-PSA荧光染色液中,氯化钠浓度为190mmol/L、氯化钾浓度为7.8 mmol/L、浓磷酸氢二钠度为10mmol/L、磷酸二氢钾浓度为2.0mmol/L、FITC-PSA浓度为1mg/mL。它们的pH值都为7.8。
检测例、刚取出的精液放置30~60 分钟,使之完全液化(可通过密度梯度离心等方法优选获得高活力精子团,去除如白细胞、生殖细胞和死精子等污染物)。准备1个对照管和1个检测管,对照管只有精液,检测管中由精子获能液稀释精液成约1mL精子悬液,内含1-2×106个活动精子。将精子悬液在37℃,CO2培养箱内孵育3小时,诱导获能。向检测管中加入10μL浓度为1mmol/L的顶体反应诱导液,使终浓度为10μmol/L,对照管中加入10μL 的DMSO,全部管置于37℃孵育15分钟。检测时管中加10μL PSA-FITC染色液,37℃,染色1小时以上(或4℃染色过夜)。检测管中再加入10μL PI染色液,染色10-15min。流式细胞仪检测,用488nm激发光,检测绿光信号和红光信号,结果分析:对照管精子顶体反应率为5.33%,检测管精子顶体反应率为42.17%;说明通过本发明的精子获能液作用,精子活力和顶体反应能力提高。说明用精子获能液替代精子培养液,精子活力和顶体反应能力提高,并用二种染色液,直接可用流式细胞仪检测精子。
Claims (2)
1.一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂,包括顶体反应诱导液和染色液,其特征在于还包括精子获能液,所述精子获能液的pH 值7.0~7.8,含有浓度为0.05~0.19mol/L的氯化钠、浓度为0.5~2.0 mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为2.0~10.5 mmol/L的葡萄糖、浓度为2.3~7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为0.2~2.4 mmol/L的七水硫酸镁、浓度为0.8~3.4 mmol/L的二水氯化钙、浓度为0.01~0.04 mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、浓度为2.4~5.6 mmol/L的碳酸氢钠、浓度为0.1~0.5 mmol/L的丙酮酸钠、质量百分浓度为2~10%的牛血清白蛋白、体积百分浓度为0.15~0.75%的乳酸钠溶液,所述乳酸钠溶液的浓度为600g/L。
2.如权利要求1所述的一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂,其特征在于所述染色液分为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液,所述碘化丙啶染色液的pH值7.0~7.8,含有浓度为50~190mmol/L的氯化钠、浓度为2.3~7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为3.2~10mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为0.5~2.0mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为100~1000μg/mL的碘化丙啶。
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