CN103335933A

CN103335933A - 一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂

Info

Publication number: CN103335933A
Application number: CN2013102675721A
Authority: CN
Inventors: 江南; 曾桥; 薛志刚
Original assignee: ZHEJIANG CELLPRO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG CELLPRO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2013-10-02

Abstract

本发明公开了一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，包括顶体反应诱导液和染色液，还包括精子获能液，精子获能液的pH值7.0～7.8，含有氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、乳酸钠溶液，这样用精子获能液代替目前的精子培养液，获能效果好，便于诱导，可以用流式细胞术检测精子顶体反应，使精子顶体反应检测结果准确、稳定可靠、重复性好、临床易于推广。

Description

一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂

技术领域

本发明涉及精子顶体反应检测试剂，具体涉及一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂。

背景技术

精液分析是不育症检查中不可缺少的一项，主要包括精子浓度、活力和形态学检查等，然而这些检查指标不能全面评估男性生育力；且有部分男性不育患者的精液常规检查未见正常，因此，需要引入新的精子功能检测与评价指标。顶体是精子所特有的结构，在识别、结合卵子透明带的过程中，顶体被诱导发生顶体反应，从而实现精子DNA与卵子DNA融合。因此可通过检测精子发生顶体反应的能力来评估精子受精能力。

目前检测精子顶体反应的方法主要是借助电镜、显微镜（荧光显微镜）等方法，如公告号为CN101865844的发明专利，就公开了包括保存液、荧光结合物和荧光封固液作为检测试剂，检测时先用精子培养液（如NaOH、HTF、BWW、M16等）孵育精子获能，再用Ca²⁺载体作为顶体反应诱导液诱导，通过荧光结合物（染色液）和荧光封固液在荧光显微镜记录顶体反应的精子数量。但此类方法检测结果过于依赖人为操作，检测结果主观性强；操作过程繁琐，检测效率低下，重复性差；部分染色液的配方对精子的损伤较大，影响检测结果的稳定性；有些方法对精液标本要求过高，不适用于常规检测，难以在临床上推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种精子获能效果好、便于诱导的基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，包括顶体反应诱导液和染色液，还包括精子获能液，所述精子获能液的pH 值7.0～7.8，含有浓度为0.05～0.19mol/L的氯化钠、浓度为0.5～2.0 mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为2.0～10.5 mmol/L的葡萄糖、浓度为2.3～7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为0.2～2.4 mmol/L的七水硫酸镁、浓度为0.8～3.4 mmol/L的二水氯化钙、浓度为0.01～0.04 mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐（Hepes-Na）、浓度为2.4～5.6 mmol/L的碳酸氢钠、浓度为0.1～0.5 mmol/L的丙酮酸钠、质量百分浓度为2～10%的牛血清白蛋白（BSA）、体积百分浓度为0.15～0.75%的乳酸钠溶液，所述乳酸钠溶液的浓度为600g/L。

所述染色液分为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液，所述碘化丙啶染色液的pH值7.0～7.8，含有浓度为50～190mmol/L的氯化钠、浓度为2.3～7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为3.2～10mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为0.5～2.0mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为100～1000μg/mL的碘化丙啶（PI）。FITC-PSA荧光染色液的pH值也为7.0～7.8，含有浓度为50～190mmol/L的氯化钠、浓度为2.3～7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为3.2～10mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为0.5～2.0mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为0.2～1mg/mL的异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素（FITC-PSA）。

与现有技术相比，本发明优点在于本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，包括顶体反应诱导液和染色液，还包括精子获能液，精子获能液的pH 值7.0～7.8，含有氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、乳酸钠溶液，这样用精子获能液代替目前的精子培养液，获能效果好，便于诱导，可以用流式细胞术检测精子顶体反应，使精子顶体反应检测结果准确、稳定可靠、重复性好、临床易于推广。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，由顶体反应诱导液、精子获能液、FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液四部份组成，其中顶体反应诱导液由在5mg Ca²⁺载体A23187溶于9.56mL DMSO中得到。精子获能液由氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、七水硫酸镁、Hepes-Na、碳酸氢钠、丙酮酸钠和BSA于试剂瓶中，加入蒸馏水充分溶解混匀，再加入二水氯化钙溶液和浓度为600g/L的乳酸钠溶液，用1M HCl 调pH值为7.4，再22μm滤膜过滤，配成氯化钠浓度为0.12mol/L、磷酸二氢钾浓度为1.2 mmol/L、葡萄糖浓度为6.0 mmol/L、氯化钾浓度为5.2mmol/L、七水硫酸镁浓度为1.2 mmol/L、二水氯化钙浓度为2.0 mmol/L、Hepes-Na浓度为0.02 mol/L、碳酸氢钠浓度为4.2mmol/L、丙酮酸钠浓度为0.3 mmol/L、BSA质量百分浓度为6%、乳酸钠溶液体积为0.45%的精子获能液。碘化丙啶染色液由NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄于试剂瓶中，加入蒸馏水充分溶解混匀，1M HCl调节上述溶液pH值为7.4，再加入PI染料，22μm滤膜过滤，配成氯化钠浓度为120mmol/L、氯化钾浓度为4.5 mmol/L、磷酸氢二钠浓度为6.5mmol/L、磷酸二氢钾浓度为1.2mmol/L、PI浓度为500μg/mL的碘化丙啶染色液。FITC-PSA荧光染色液由NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄于试剂瓶中，加入蒸馏水充分溶解混匀，1M HCl调节上述溶液pH值为7.4，再加入FITC-PSA荧光染料，22μm滤膜过滤，配成氯化钠浓度为120mmol/L、氯化钾浓度为4.5 mmol/L、浓磷酸氢二钠度为6.5mmol/L、磷酸二氢钾浓度为1.2mmol/L、FITC-PSA浓度为0.6mg/mL的FITC-PSA荧光染色液。

实施例2、与实施例1基本相同，所不同的只是精子获能液中，氯化钠浓度为0.05mol/L、磷酸二氢钾浓度为0.5 mmol/L、葡萄糖浓度为2.0 mmol/L、氯化钾浓度为2.3 mmol/L、七水硫酸镁浓度为0.2 mmol/L、二水氯化钙浓度为0.8 mmol/L、Hepes-Na浓度为0.01 mol/L、碳酸氢钠浓度为2.4 mmol/L、丙酮酸钠浓度为0.1 mmol/L、BSA质量百分浓度为2%、乳酸钠溶液体积为0.15%。碘化丙啶染色液中，氯化钠浓度为50mmol/L、氯化钾浓度为2.3 mmol/L、磷酸氢二钠浓度为3.2mmol/L、磷酸二氢钾浓度为0.5mmol/L、PI浓度为100μg/mL。FITC-PSA荧光染色液中，氯化钠浓度为50mmol/L、氯化钾浓度为2.3mmol/L、浓磷酸氢二钠度为3.2mmol/L、磷酸二氢钾浓度为0.5mmol/L、FITC-PSA浓度为0.2mg/mL。它们的pH值都为7.0。

实施例3、与实施例1基本相同，所不同的只是精子获能液中，氯化钠浓度为0.19mol/L、磷酸二氢钾浓度为2.0 mmol/L、葡萄糖浓度为10.5 mmol/L、氯化钾浓度为7.8 mmol/L、七水硫酸镁浓度为 2.4 mmol/L、二水氯化钙浓度为3.4 mmol/L、Hepes-Na浓度为0.04 mol/L、碳酸氢钠浓度为5.6 mmol/L、丙酮酸钠浓度为0.5 mmol/L、BSA质量百分浓度为10%、乳酸钠溶液体积为0.75%。碘化丙啶染色液中，氯化钠浓度为190mmol/L、氯化钾浓度为7.8 mmol/L、磷酸氢二钠浓度为10mmol/L、磷酸二氢钾浓度为2.0mmol/L、PI浓度为1000μg/mL。FITC-PSA荧光染色液中，氯化钠浓度为190mmol/L、氯化钾浓度为7.8 mmol/L、浓磷酸氢二钠度为10mmol/L、磷酸二氢钾浓度为2.0mmol/L、FITC-PSA浓度为1mg/mL。它们的pH值都为7.8。

检测例、刚取出的精液放置30～60 分钟，使之完全液化（可通过密度梯度离心等方法优选获得高活力精子团，去除如白细胞、生殖细胞和死精子等污染物）。准备1个对照管和1个检测管，对照管只有精液，检测管中由精子获能液稀释精液成约1mL精子悬液，内含1-2×10⁶个活动精子。将精子悬液在37℃，CO₂培养箱内孵育3小时，诱导获能。向检测管中加入10μL浓度为1mmol/L的顶体反应诱导液，使终浓度为10μmol/L，对照管中加入10μL 的DMSO，全部管置于37℃孵育15分钟。检测时管中加10μL PSA-FITC染色液，37℃，染色1小时以上（或4℃染色过夜）。检测管中再加入10μL PI染色液，染色10-15min。流式细胞仪检测，用488nm激发光，检测绿光信号和红光信号，结果分析：对照管精子顶体反应率为5.33%，检测管精子顶体反应率为42.17%；说明通过本发明的精子获能液作用，精子活力和顶体反应能力提高。说明用精子获能液替代精子培养液，精子活力和顶体反应能力提高，并用二种染色液，直接可用流式细胞仪检测精子。

Claims

1.一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，包括顶体反应诱导液和染色液，其特征在于还包括精子获能液，所述精子获能液的pH 值7.0～7.8，含有浓度为0.05～0.19mol/L的氯化钠、浓度为0.5～2.0 mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为2.0～10.5 mmol/L的葡萄糖、浓度为2.3～7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为0.2～2.4 mmol/L的七水硫酸镁、浓度为0.8～3.4 mmol/L的二水氯化钙、浓度为0.01～0.04 mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、浓度为2.4～5.6 mmol/L的碳酸氢钠、浓度为0.1～0.5 mmol/L的丙酮酸钠、质量百分浓度为2～10%的牛血清白蛋白、体积百分浓度为0.15～0.75%的乳酸钠溶液，所述乳酸钠溶液的浓度为600g/L。

2.如权利要求1所述的一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，其特征在于所述染色液分为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液，所述碘化丙啶染色液的pH值7.0～7.8，含有浓度为50～190mmol/L的氯化钠、浓度为2.3～7.8 mmol/L的氯化钾、浓度为3.2～10mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为0.5～2.0mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为100～1000μg/mL的碘化丙啶。