CN105154516A

CN105154516A - 一种灵长类实验动物精子质量检测方法

Info

Publication number: CN105154516A
Application number: CN201510666935.8A
Authority: CN
Inventors: 崔胜�; 潘吉荣; 张丽; 刘佳利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明公开了一种灵长类实验动物精子质量检测方法。本发明提供灵长类动物精子质量检测试剂盒，包括精子获能液；精子获能液按照如下方法制备：将NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、NaH₂PO₄、NaHCO₃、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、Hepes和水混合，得到精子获能液，其中，所述NaCl的浓度为114mM，所述Cl的浓度为3.2mM，所述MgCl₂的浓度为0.5mM，所述CaCl₂的浓度为2.0mM,所述NaH₂PO₄的浓度为0.4mM，所述NaHCO₃的浓度为24.9mM，所述葡萄糖的浓度为5.6mM，所述丙酮酸钠的浓度为0.5mM，所述乳酸钠的浓度为10mM，所述Hepes的浓度为10mM。本方法避免了电刺激采集精液对生殖系统造成的损伤，而且可以在实验动物取材的同时迅速检测精子质量，因而在食品安全评价等研究中具有广泛的应用前景。

Description

一种灵长类实验动物精子质量检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种灵长类实验动物精子质量检测方法。

背景技术

目前常见的精子质量分析方法只适用于人类精液，灵长类实验动物精液采集较为困难，常用的电刺激采集精液的方式容易引起动物组织损伤，影响其他指标的检测。另外，电刺激采集精液需要的时间较长，成功率较低，达不到灵长类实验动物的精子质量分析要求。

精子活力分析是评估雄性生育能力最常用的检查方法,计算机辅助精子分析(computeraidedspermanalysis,CASA)将计算机技术和先进的图像处理技术应用于精子质量分析，通过对精子动态图像分析，提供精子动力学的量化数据，其检测过程迅速，客观精确，分析效率高，不易受检查者技术熟练程度和主观因素的影响。

精子形态学分析可以在光学显微镜下对染色后的精子进行观察，直观地反映出精子发育状态，畸形精子率等，以此判断灵长类实验动物的精子质量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种灵长类动物精子质量检测试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括精子获能液；所述精子获能液按照如下方法制备：将NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、NaH₂PO₄、NaHCO₃、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、BSA、硫酸庆大霉素和纯水混合，得到精子获能液，其中，所述NaCl的浓度为114mM，所述KCl的浓度为3.2mM，所述MgCl₂的浓度为0.5mM，所述CaCl₂的浓度为2.0mM,所述NaH₂PO₄的浓度为0.4mM，所述NaHCO₃的浓度为24.9mM，所述葡萄糖的浓度为5.6mM，所述丙酮酸钠的浓度为0.5mM，所述乳酸钠的浓度为10mM，所述Hepes的浓度为10mM，所述BSA的浓度为3g/L，所述硫酸庆大霉素30mg/L。

上述的试剂盒或上述精子获能液在检测离体灵长类动物精子质量中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒或上述精子获能液在制备检测离体灵长类动物精子质量产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的试剂盒或上述精子获能液在获取离体灵长类动物精子中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒或上述精子获能液在制备获取离体灵长类动物精子产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种检测离体灵长类动物精子质量的方法，包括如下步骤：

1)将离体灵长类动物精子置于是述精子获能液中，反应，得到精子悬液；

2)检测所述精子悬液的精子质量。

上述方法中，所述反应的温度为37度，所述反应的时间为5min。

上述方法中，所述检测包括精子运动指标检测或精子形态检测；

所述精子运动指标检测采用CASA分析系统；

所述精子形态检测采用光学显微镜。

上述方法中，所述灵长类动物精子来源于所述灵长类动物附睾尾。

上述灵长类动物为灵长类实验动物。上述灵长类实验动物具体为猴。上述猴尤其具体为食蟹猴。

本发明的实验证明，本发明的精子获能液可以用来检测食蟹猴精子质量，用其悬浮离体精液，能保持精子活力，用本发明的精子获能液接检测出食蟹猴精子活力高。本发明的精子获能液可以用于检测灵长类实验动物精子质量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、灵长类实验动物精子质量检测方法

1、精子获能液的配制

精子获能液按照如下方法制备：将NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、NaH₂PO₄、NaHCO₃、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、BSA、硫酸庆大霉素和纯水混合，得到精子获能液，其中，各溶质的终浓度如下：NaCl114mM，KCl3.2mM，MgCl₂0.5mM，CaCl₂2.0mM,NaH₂PO₄0.4mM，NaHCO₃24.9mM，葡萄糖5.6mM，丙酮酸钠0.5mM，乳酸钠10mM，Hepes10mM，BSA3g/L，硫酸庆大霉素30mg/L。

2、灵长类实验动物精子质量检测方法

选择性成熟食蟹猴为实验对象，参考WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第五版标准评价为依据。

1)精子悬液的制备

将食蟹猴处死后立即采集一侧附睾尾约100mg，置于37℃预热1.0mL上述1制备的精子获能液中，用眼科剪充分剪碎，置于37℃水浴5min，使精子充分游出获能；收集10μL上层精子悬液，得到待检测精子悬液。

2)检测

将5μL待检测精子悬液滴加在37℃载物台的专用载玻片上，并盖上盖玻片，通过CASA分析系统采集和记录精子运动指标。CASA分析系统(Version.12CEROS,HamiltonThorneResearch)参数设置如下：

最小对比度50，最小细胞大小4pixels，采集频率为60Hz。

每个样本至少统计10个视野，统计到的精子总数不少于500个。分析直线运动精子比例、活精子比例、精子平均运动速度(SpermAveragepathvelocity，VAPμm/s)、精子直线运动速度(Straightlinevelocity，VSLμm/s)、精子曲线运动速度(curvilinearvelocity，VCLμm/s)、精子尾部摆动幅度(LateralAmplitude，ALHμm)和精子尾部摆动频率(Beatfrequency,BCFHz)。

表1精子数量参数

注：A级精子是指快速前向运动；B级精子是指慢或呆滞的前向运动；C级精子是指非前向运动；D级精子是指不动；

表2精子运动参数

测定精子数量参数结果如表1所示，食蟹猴精子密度为211.36*10⁶，精子活动率为80.68％，均在良好状态下。食蟹猴精子运动参数如表2所示，平均路径速度54.17μm/s，直线速度48.85μm/s，曲线速度80.47μm/s，精子头侧摆速度为3.2μm。

在光学显微镜下进行精子形态学分析，取台氏精子获能液中的精子悬液5μL滴载玻片上抹片。待载玻片上液体蒸发后，将载玻片投入甲醇中室温固定10min。吉姆萨染液染色2h，自来水冲洗，晾干后镜检(600倍显微镜下观察)，照相。统计精子畸形率。

精子畸形率一般分为头部畸形和尾部畸形两种：精子畸形率(精子畸形率＝畸形精子数/样品计数精子数*100％)，精子畸形率一般分为头部畸形和尾部畸形两种：1)头部畸形：例如不定形头畸形精子、大头精子和精子颈部胞浆小滴等畸形。2)尾部畸形:精子尾部被称为精子的运动马达，精子尾部异常将直接影响精子的运动速度。无尾精子即精子没有尾部将无运动能力；而尾部弯曲形成的畸形精子通常不能活动；而如果短尾精子过多可能形成无力型精子症；而双尾/多尾精子由于同时存在多根鞭毛，它们活动方向不同，造成精子摆动不能协调同步，因而不能前向运动。

每个样品计数200个精子，结果死精子数为18.2±2.34，平均百分率为9.1％；畸形精子数为26.19±3.43，平均百分率为13.1％。

对比例1、灵长类实验动物精子质量检测方法

与实施例1的2)的方法基本相同，不同的是将精子获能液换成37℃预热0.01MPBS缓冲液，其余步骤不变。

0.01MPBS按照如下方法配制：

配制0.2M磷酸盐贮存缓冲液(PB,pH7.4):

A液0.2MNaH₂PO₄：31.2gNaH₂PO₄·2H₂O，加蒸馏水溶解，定容至1000ml；

B液0.2MNa₂HPO₄：71.632gNa₂HPO₄·12H₂O，加蒸馏水溶解，定容至1000ml；

C液0.2MpH7.4的磷酸盐贮存液：19mlA液加81mlB液混匀，检测并调节其pH值；

0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)：取上述0.2MpH7.4的磷酸盐贮存液50ml，加8.5gNaCl，加蒸馏水定容至1000ml。

表3精子数量参数

A级精子是指快速前向运动；B级精子是指慢或呆滞的前向运动；C级精子是指非前向运动；D级精子是指不动；

表4精子运动参数

测定精子数量参数结果如表3所示，食蟹猴精子密度为17.23*10⁶，精子活动率为34.28％，均在良好状态下。食蟹猴精子运动参数如表4所示，平均路径速度10.73μm/s，直线速度5.73μm/s，曲线速度26.47μm/s，精子头侧摆速度为0.13μm。

精子畸形率(精子畸形率＝畸形精子数/样品计数精子数*100％)，每个样品计数200个精子，大部分精子死亡，无法计数畸形精子数。

可以看出，0.01MPBS缓冲液中释放的食蟹猴精子活力明显下降，但在啮齿动物中未见到显著影响。

因此，可以看出，检测灵长类实验动物精子质量时，本发明中的精子获能液优于0.01MPBS缓冲液。

Claims

1.一种灵长类动物精子质量检测试剂盒，其包括精子获能液；所述精子获能液按照如下方法制备：将NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、NaH₂PO₄、NaHCO₃、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、Hepes、BSA、硫酸庆大霉素和纯水混合，得到精子获能液，其中，所述NaCl的浓度为114mM，所述KCl的浓度为3.2mM，所述MgCl₂的浓度为0.5mM，所述CaCl₂的浓度为2.0mM,所述NaH₂PO₄的浓度为0.4mM，所述NaHCO₃的浓度为24.9mM，所述葡萄糖的浓度为5.6mM，所述丙酮酸钠的浓度为0.5mM，所述乳酸钠的浓度为10mM，所述Hepes的浓度为10mM，所述BSA的浓度为3g/L，所述硫酸庆大霉素30mg/L。

2.权利要求1所述的试剂盒或权利要求1中的所述精子获能液在检测离体灵长类动物精子质量中的应用；

或权利要求1所述的试剂盒或权利要求1中的所述精子获能液在制备检测离体灵长类动物精子质量产品中的应用。

3.权利要求1所述的试剂盒或权利要求1中的所述精子获能液在获取离体灵长类动物精子中的应用；

或权利要求1所述的试剂盒或权利要求1中的所述精子获能液在制备获取离体灵长类动物精子产品中的应用。

4.一种检测离体灵长类动物精子质量的方法，包括如下步骤：

1)将离体灵长类动物精子置于权利要求1中的所述精子获能液中，反应，得到精子悬液；

2)检测所述精子悬液的精子质量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为37度，所述反应的时间为5min。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述检测包括精子运动指标检测或精子形态检测；

所述精子运动指标检测采用CASA分析系统；

所述精子形态检测采用光学显微镜。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述灵长类动物精子来源于所述灵长类动物附睾尾。

8.根据权利要求1所述的试剂盒、权利要求2所述的应用或权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述灵长类动物为灵长类实验动物；所述灵长类实验动物具体为猴；所述猴尤其具体为食蟹猴。