CN109652492A - 精子活动力分级计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了精子活动力分级计数方法，主要涉及精子计数技术领域。方法主要为使用固定稀释液和TBS缓冲液分别稀释精液，并分别计数，从而获得A液精子总数以及B液NP和IM的总数，校验误差后，即可通过计算获得运动活跃型(PR)精子的数量，确定精子的活动力。本发明能够避免精子运动，以及判断精子活动等级对计数的干扰，较大程度降低活动力分级的难度，获得准确的活动力分级结果。
Description
技术领域
本发明涉及精子计数领域，具体是精子活动力分级计数方法。
背景技术
精液分析人工计数不如仪器计数简便，但人工计数仍然是精液分析的金标 准。人工计数虽准确，但操作繁琐，尤其在精子活动力的计数方面，要求检验 者计数要迅速，而且不能重复计数精子，然而精子运动迅速，方向不定，难免 造成误差，不同的检验者可能得出的结果会差异较大。根据WHO《人类精液检 验与处理实验室手册第四版》的要求，对活动力进行abcd分级，而a级与b级 较难区分。如今，WHO出版了《人类精液检验与处理实验室手册第五版》，将 活动力重新分为三级：运动活跃型(PR)：精子运动活跃、线性运动或者在较大的范围内运动(不考虑运动速度)，相当于第四版的a+b级；非运动活跃型(NP)： 精子运动但不活跃，如精子在较小的范围内运动，精子头部轻微移位或只有鞭 毛摆动，相当于第四版的c级；完全不动型(IM)：精子完全不动，相当于第四 版的d级。第五版减少了对活动力的计数难度，但如何才能更准确，且不会重 复计数活动的精子，仍然是人工精子计数操作的存留难题。
发明内容
本发明的目的在于提供精子活动力分级计数方法，它能够避免精子运动， 以及判断精子活动等级对计数的干扰，获得准确的计数。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
精子活动力分级计数方法，包括：
1)备液，
A液：即固定稀释液——使用1000ml纯水溶解50g NaHCO3和10ml 35％的 甲醛溶液，
B液：TBS缓冲液；
2)确定稀释倍数：将液化后的精液制成湿片，根据每×400视野的精子数， 确定稀释倍数，对应的稀释度如下：
3)根据确定的稀释倍数，分别使用A液和B液对精液稀释为同一倍数并混匀 后，分别充入改良的纽鲍尔计数板的计数池，静置3～5分钟；
4)计数：
A液——A液精子被稀释液固定后，基本不动，对A液计数板的中央大方格 进行精子计数，直到至少计得200个精子并数完完整的一行后，得到A液精子总 数；
B液——静置后B液的NP和IM型的精子因活动力不强会沉到底部，PR型的 精子会不定向运动，计数与A液对应方格的B液的NP和IM型精子得出B液NP和 IM的总数；
5)校验差异值：
重复步骤3)和步骤4)，获得第二组计数数据，比较两组数据的差异值是否 在可允许的范围内，如果是则数据有效，如果超过差异值则重复步骤3)和步骤 4)直到两组数据的差异值在允许的范围内，所允许的差异值如下所示(基于95％ 的可信区间)：
6)计算精子活力：
用A液精子总数减去B液NP和IM的总数，即得运动活跃型(PR)精子的数 量。
根据所述步骤2)对精液进行稀释配制和确定评估区域的具体方法如下：
所述步骤4)对于精子的计数方法为：对于改良的Neubauer血球细胞计数板 中央方格，划分为1～9共9个大方格，每个大方格使用如附图1的标号进行区分。 其中中央的5号方格包括25个中方格，1个中方格内含有16个小方格，一行为5个 中方格，计数时，先自第5方格开始计数，在第5方格计数后仍达不到200，再计 数第4和6方格，以精子头部进行计数，为避免重复计数，数左不数右，数上不 数下。
步骤1)中，制作湿片的方法为：将液化后的精液充分混匀、定量吸取10μl 的精液在载玻片上，盖上22mm×22mm的盖玻片，制成湿片。
计算获得的运动活跃型精子数量后，除以A液精子总数得到运动活跃型精子 的比例，分别算出PR、NP、IM的比例，该比例取整数，即可得到精子活动力分 级。
计数应当在射精后1个小时以内完成。且在室温25℃下进行实验。
所述B液：TBS缓冲液为Tris-HCl缓冲盐溶液：配方是NaCL 8克、KCL 0.2克， Trisebase 3克，加纯水800mL，用浓盐酸调pH到7.4，然后加纯水到1000mL。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
通过本方法，通过A液将精子固定，获得精子总数，计数过程中精子被固 定，避免了精子游动对计数的干扰，能够获得准确的计数。再通过B液将精子 稀释同一倍数后，理论上总数与A液总数应当是一致的，由于活跃精子的游动 过于频繁，实在难以计数，故仅对NP和IM型的精子进行计数，能够避开游动 精子的干扰，更容易获得准确的数据。计数完成后，通过对获得数量的加减， 获得活跃精子的数量，从而得知精子的活动力。
这种方法解决了现有技术对精子计数不准确的问题，避免了游动精子对计 数的干扰，避免重复计数和遗漏，大大提高了操作难度和数据准确度。
附图说明
附图1是本发明的改良的纽鲍尔计数板的示意图。
附图2是本发明的附图1中的5号区域大方格的放大图。
附图3是本发明附图2的圈选区域放大图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内 容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所限定的范围。
实施例1：精液活动力分级计数操作
1.实验仪器：BX41奥林巴斯显微镜
改良的Neubauer血球细胞计数板及配套的盖玻片
载玻片
22mm×22mm的盖玻片
2.实验试剂：固定稀释液(A液)：
1000ml纯水中溶解50g NaHCO3和10ml 35％(v/v)甲醛溶液
TBS缓冲液(B液)所述TBS缓冲液为Tris-HCl缓冲盐溶液：配方是NaCL 8克、KCL0.2克，Trise base 3克，加纯水800mL，用浓盐酸调pH到7.4， 然后加纯水到1000mL。
3.计数方法：
如附图1所示，对于计数改良的Neubauer血球细胞计数板中央方格，划分为1～9共9 个大方格，每个大方格使用如附图1的标号进行区分。其中中央的5号方格包括25个中方格， 1个中方格内含有16个小方格，一行为5个中方格。计数时，优先计数第5方格，在第5方格计数后仍达不到200，再计数第4和6方格，以精子头部进行计数，为避免重复计数，数左不数右，数上不数下。
4.计数步骤：
4.1确定稀释倍数：将液化后的精液充分混匀、定量吸取10μl的精液在载玻片上，盖上 22mm×22mm的盖玻片，制成湿片，根据每×400视野的精子数，确定稀释倍数(详见下表： 表1-精液所需稀释度、配制方法、使用的计数板和评估区域统计表)。
经过观察，本次计数每×400视野的精子数为203，根据下表使用稀释倍数为1：20。
表1-精液所需稀释度、配制方法、使用的计数板和评估区域统计表
4.2分别用固定稀释液(A液)和TBS缓冲液(B液)将50μl精液稀释成20倍数后， 各吸取10μl稀释后充分混匀的精液分别充入上下两端计数池，静置3分钟。
4.3 A液精子被稀释液固定后，基本不动。对A液中间大方格逐行进行计数，对包括有5 个中方格的完整一行进行计数，数了4行，分别是54、52、60、58，得出A液的精子总数，为224。
4.4静置后B液的NP和IM型的精子因活动力不强会沉到底部，PR型的精子会不定向运动。计数B液与A液计数对应方格的NP和IM型精子，分别得出B液NP的精子数13和 IM的精子数144，总数为157(13+144)。
所述PR型、NP型和IM型精子的判断方法如下：
PR：精子主动地呈直线或沿一大圆周运动，无论其速度如何；
NP：所有其他非前向运动的形式，如小圆周泳动、尾部动力几乎不能驱使头部移动或 只能观察到尾部摆动。
IM：精子没有运动。
据《正常男性与不育男性的精子运动参数CASA(计算机辅助精子分析系统)分析》所 述，PR(A+B级)的平均路径速度(VAP)为VAP≥10μm/s，NP为0<VAP<10μm/s，IM 为VAP＝0μm/s。改良的纽鲍计数板5号大方格中的小方格(图3)边长为50μm，小方格边长 /NP精子的VAP＝0<NP精子穿过1个小方格的时间<5秒。结论：5秒内不能穿过1个小方格的 均为NP型精子。
在本实施例中使用此标准，但不用于限制本发明的范围。不同CASA系统判定活动力所 用的VAP范围不一样，故在其他实施中适应修正，但所采用的手段仍然等价落于本申请所限 定的范围。
VAP——精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。这个轨迹是根据CASA仪器中 的算法对实际轨迹平整后计算出来的；这些算法因仪器不同而有所不同，故不同CASA系统的 数值不能直接相比较。
4.5上述的4.2～4.4步骤重复一次，获得数据如下：
将上述进行差异值的对比，通过参考下表：表2-两次重复计数的不同总数所允许的差异 值，对两次数据判断在稀释、充池、人工计数方面是否存在人工误差。
A液第一次+第二次的总数为465(224+241),查表可知可接受差异值为42,两次结果的 差为17(241-224)，小于42，该结果可接受。
B液第一次+第二次的总数为329(13+144+18+154)，查表可知可接受差异值为36，两 次结果的差为15，小于36，该结果可接受。
经过对比，上述两次计数在合理可接受的差异值范围内，不存在人工误差。实验数据可 以有效采用。
表2-两次重复计数的不同总数所允许的差异值(基于95％的可信区间)
备注:差异值判断的表来自于《人类精液检验与处理实验室手册第五版》48页
在差异值的判断上，可以直接参考表格，该表引用自《第五版》48页，《第五版》39页2.10说明了该差异值是如何得来：两个相对独立数值的理想差异值为0，其标准差等于两个数值之和的平方根。因此在95％的可信区间内应该小于1.96。
如果与表格进行比对，方法如下：
如果两个数值之间的差异值小于或等于表中给出的数值，则评估可被接收，可采用两个 数值的均值。
当两个数值之间的差异值大于可接受值时，应放弃这两个数值，重新准备两次新的精液 稀释并予以评估。
示例：A液第一次计数在4行中共有203个精子，第二次计数时在4行内共有247个精子，两次合计450(203+247)个精子，差异值是44(246-203)，从表中可看出这个值已经超 出了偶然概率所允许的差异值(42)，因此需要重新双份稀释。
B液同理，用NP和IM的总数来比较差异。
4.6计算精子活动力：A液的精子数(N)—B液非运动活跃型精子(NP)—完全不动型精子(IM)＝运动活跃型(PR)。
实施例2：使用实施例1的步骤与WTO推荐方法的分级结果比较
实验目的：为了验证该专利的方法与WHO推荐的方法，哪种在分析精子活动力时重复 性更好，结果更精确，现试验如下：
实验方法：
在同一实验条件下，4名检验人员分成AB两组，每组2人，同时检测同一份标本，总共检测10份标本，为了排除检验人员间的技术误差，在第6-10份标本时，AB两组检验人员互换。
A组使用WHO《人类精液检验与处理实验室手册第五版》推荐的方法：在室温25℃的条件下，精液样本液化后，充分混匀精液样本，吸取10μl的定量精液滴于载玻片上，盖上22mm×22mm的盖玻片，避免产生气泡。静置1分钟。重复上述步骤，制作第二份标本。使 用400倍率的相差显微镜来评估精子活动力，评估应当在射精后1小时内完成。评估方法：1)首先数所选区域内的运动活跃型精子(PR)，然后是非运动活动活跃型精子(NP)，最后是完全不动型精子(IM)。2)至少数5个不同的区域，所数的精子总数不低于200个。3)分别计 算两份标本的PR、NP和IM的比例，然后计算各自的均值和差值(差值必须在可接受的范 围内，具体可参考《人类精液检验与处理实验室手册第五版》24～25页)。4)观察区域选择 应随机，计数应迅速，避免因计数时间过长，将计数时游进网格的活动精子也计算入内，导 致运动精子的数量估计比实际值多。
B组使用实施例1的操作步骤进行计数和评估精子活动力。(具体的步骤、方法、算法 相同不再赘述，数据统一在下表)
最后，通过独立样本T检验分析两种方法在检验同一份标本时的变异系数，来比较哪种 方法更精确，重复性更好。
实验数据及比较：
表3.A组与B组的结果
表4.A组与B组间变异系数的比较
实验结论：
通过该表可知，用WHO推荐的方法分析精子活动力，同一份标本不同检验人员间的结 果变异系数更大。造成变异系数大的主要原因是未经稀释的精液的精子密度大，PR精子活动 力强，方向不定，无法避免计数时游进网格的活动精子造成计数不准，精子相互之间的撞击 会改变精子原本的位置以及移动方向，容易重复计数，计数难度大，不同检验人员所做结果 相差大，检验结果难以重现。而使用该专利的方法分析精子活动力，即使不同检验人员，因 为不再需要计数PR型精子，计数难度降低很多，所以结果变异系数更低，重复性更好，更 精确。WHO的方法需要使用相差显微镜，而该专利的方法只需普通显微镜即可，更适于推 广。
Claims (7)
1.精子活动力分级计数方法，其特征在于，包括：
1)备液，
A液：即固定稀释液——使用1000ml纯水溶解50g NaHCO3和10ml 35％的甲醛溶液，
B液：TBS缓冲液；
2)确定稀释倍数：将液化后的精液制成湿片，根据每×400视野的精子数，确定稀释倍数，对应的稀释度如下：
3)根据确定的稀释倍数，分别使用A液和B液对精液稀释为同一倍数并混匀后，分别充入改良的纽鲍尔计数板的计数池，静置3～5分钟；
4)计数：
A液——A液精子被稀释液固定后，基本不动，对A液计数板的中央大方格进行精子计数，直到至少计得200个精子并数完完整的一行后，得到A液精子总数；
B液——静置后B液的NP和IM型的精子因活动力不强会沉到底部，PR型的精子会不定向运动，计数与A液对应方格的B液的NP和IM型精子得出B液NP和IM的总数；
5)校验差异值：
重复步骤3)和步骤4)，获得第二组计数数据，比较两组数据的差异值是否在可允许的范围内，如果是则数据有效，如果超过差异值则重复步骤3)和步骤4)直到两组数据的差异值在允许的范围内，所允许的差异值如下所示(基于95％的可信区间)：
6)计算精子活力：
用A液精子总数减去B液NP和IM的总数，即得运动活跃型(PR)精子的数量。
2.根据权利要求1所述精子活动力分级计数方法，其特征在于：根据所述步骤2)对精液进行稀释配制和确定评估区域的具体方法如下：
。
3.根据权利要求1所述精子活动力分级计数方法，其特征在于：所述步骤4)对于精子的计数方法为：对于改良的Neubauer血球细胞计数板中央方格，划分为1～9共9个大方格，每个大方格使用如附图1的标号进行区分。其中中央的5号方格包括25个中方格，1个中方格内含有16个小方格，一行为5个中方格，计数时，先自第5方格开始计数，在第5方格计数后仍达不到200，再计数第4和6方格，以精子头部进行计数，为避免重复计数，数左不数右，数上不数下。
4.根据权利要求1所述精子活动力分级计数方法，其特征在于：步骤1)中，制作湿片的方法为：将液化后的精液充分混匀、定量吸取10μl的精液在载玻片上，盖上22mm×22mm的盖玻片，制成湿片。
5.根据权利要求1所述精子活动力分级计数方法，其特征在于：计算获得的运动活跃型精子数量后，除以A液精子总数得到运动活跃型精子的比例，分别算出PR、NP、IM的比例，该比例取整数，即可得到精子活动力分级。
6.根据权利要求1所述精子活动力分级计数方法，其特征在于：计数应当为射精后60min以内完成，确保计数环境为室温下25℃。
7.根据权利要求1所述精子活动力分级计数方法，其特征在于：所述B液：TBS缓冲液为Tris-HCl缓冲盐溶液：配方是NaCL 8克、KCL 0.2克，Trise base 3克，加纯水800mL，用浓盐酸调pH到7.4，然后加纯水到1000mL。
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