CN108333021A - 一种基于量值溯源的c反应蛋白多系统定值方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法。本发明所提供的基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法，包括如下步骤：采用C反应蛋白国际标准物质进行量值传递的方式对候选C反应蛋白标准物质进行定值，具体是采用人CRP低值血清的混合液稀释国际有证标准物质ERM‑DA474/IFCC制作校准曲线，采用10个检测系统为候选参考物质定值。实验证明，定值结果准确一致，本发明为CRP的标准化和一致化工作提供新思路。

Description

一种基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法
技术领域
本发明涉及标准物质定值领域，具体涉及一种基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法。
背景技术
C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是由肝脏合成的一种经典的急性时相反应蛋白，在机体发生创伤、急性炎性时其水平明显增高，创伤和炎性修复或清除后下降，是机体炎性反应的标志物，是目前临床较常用的诊断炎性反应的标志；随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的体内微量CRP，被称为“超敏CRP(high sensitive C-reactiveprotein，hs-CRP)，hs-CRP对于低水平的慢性炎性反应更加准确及灵敏。
正常人血中的CRP浓度很低，在机体突遇紧张、组织创伤和各种炎症刺激时合成快速增加并从肝细胞中分泌入血液，其浓度可急剧升高；在感染发生后12-18小时即可检测到高水平的CRP，而在感染发生后的12-14天升高的CRP可降至基线水平。因此多年来一直是评价炎症性疾病的指标之一，异常升高的水平是感染的重要指标，其升高幅度与感染的程度呈相关。CRP作为诊断细菌感染的重要标志物之一，已广泛应用于临床。hsCRP还是一个评估心脏病发生率、复发率、死亡率的临床重要指标。近年来的研究发现，炎症在动脉粥样硬化及肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。
检测CRP的常用方法多种多样，其中包括散射比浊法、透射比浊法，放射免疫测定、化学发光法、ELISA法及床旁CRP检测(POCT)等。目前临床实验室测定血清中CRP的方法主要是免疫浊度法，包括乳胶增强透射比浊法和速率散射比浊法，这两种方法主要用于自动化分析系统，速率散射比浊法多用于免疫检测领域的封闭检测系统，乳胶增强透射比浊法多用于生化检测领域的开放的检测系统。放射免疫测定方法(Radioimmunoassay，RIA)敏感性高，但存在放射性同位素损伤和污染、不稳定等弊端，容易对操作人员造成伤害。ELISA法稳定性好且简便易操作，但敏感性不及RIA法。也有少部分实验室应用化学发光法测定。为适应在患者身边作监测的需要，目前应用比较广泛的还有床旁CRP检测(POCT)的小型全血CRP测定仪及商品试剂盒，该法灵敏、特异，可用末梢血，患者易接受，可随身携带，操作简便，5分钟即可测得结果。
虽然CRP/hsCRP测定具有重要的临床意义，但是当前国内检测方法很多，CRP的检测结果一致化现状不很理想，各实验室采用的CRP检测系统较多，结果间差异较大，不同实验室检测系统CV％差别较大。卫生部临床检检中心发布的2016年CRP第二次室间质评数据表明，同一个浓度测定不同组均值差异很大(23.64～28.63mg/L)，不同的检测方法实验室间精密度重现性差异较大(CV％5.42％～12.35％)，国外Roberts等人的研究中也证明不同检测系统对同一浓度样本的检测数值差别较大。
实现检验结果一致性的必然途径是检测方法的标准化，其关键是保证检测结果的溯源性。为了实现CRP检测的标准化，1987年，WHO研制出第一种CRP国际标准物质WHO IS85/506，它是一个纯物质，CRP浓度是98mg/L。1989年，国际临床化学学会(IFCC)血浆蛋白委员会(C-PP)开始研制通用参考物质。该参考物质包含15种血清蛋白，其中包括CRP。1993年，通过欧洲共同体标准物质局(European Community Bureau of Reference，BCR)认证发布了这种通用参考物质命名为CRM470，其中为CRP定值时采用国际标准物质WHO IS 85/506进行校准。CRM 470是在预处理血清基质中加入纯化蛋白所制成。CRM470较过去的参考物质还有一明显不同，即不再使用IU作为单位，而改用mg/L。之后正式命名为ERM DA-470。在发布了ERM-DA470之后，体外诊断试剂厂商们开始使用该标准物质为他们的校准品和质控品赋值，各个实验室之间的室间测量结果差异明显变小。
2004年，参考物质与测量研究所(IRMM)联合IFCC开始研制ERM-DA470k。于2008年正式发布了该物质。该物质在制备前进行了预试验。预试验数据显示加入纯化CRP，冻干和复溶会导致CRP在2种检测方法中出现不完全回收，使检测值出现约20％的缺失。最终新参考物质ERM-DA470k/IFCC中并未加入CRP的定值。2009年，参考物质与测量研究所(IRMM)联合IFCC研制出ERM-DA472/IFCC。ERM-DA472/IFCC与ERM-DA470k/IFCC使用相同的血清池，但由于冻干会影响CRP检测结果，因此ERM-DA472/IFCC对血清直接进行液态冷冻。2011年，参考物质与测量研究所(IRMM)联合IFCC研制出ERM-DA474/IFCC。研制过程与ERM-DA472/IFCC大致相同。
目前国内没有人血清基质的CRP标准物质，由于国际标准物质价格昂贵，运输周期长，运输条件无法保证等原因，不能用于室间质量评价机构的正确度验证，同时也不能满足我国日益增多的民族企业对CRP高阶标准物质的需要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法。
本发明所提供的基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法，可包括如下步骤：采用C反应蛋白国际标准物质进行量值传递的方式对候选C反应蛋白标准物质进行定值。
这里的“系统”包括用于定量检测C反应蛋白的仪器和所使用的试剂。如临床实验室C反应蛋白检测系统。
进一步地，所述方法具体可包括如下步骤：
(a1)将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释，得到系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液，并计算获得各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度。
(a2)采用N个C反应蛋白定量检测系统分别测定步骤(a1)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的浓度。
(a3)针对所述N个C反应蛋白定量检测系统中的每个C反应蛋白定量检测系统，均采用步骤(a1)获得的各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度和步骤(a2)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的测定浓度进行线性拟合，得到C反应蛋白定值标准曲线；即N个C反应蛋白定量检测系统得到N个C反应蛋白定值标准曲线。
(a4)采用所述N个C反应蛋白定量检测系统分别测定所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度。
(a5)针对所述N个C反应蛋白定量检测系统中的每个C反应蛋白定量检测系统，均将步骤(a4)获得的所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的测定浓度代入到步骤(a3)获得的相应的C反应蛋白定值标准曲线的方程，从而获得所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度。
即将步骤(a4)中某一C反应蛋白定量检测系统测得的所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度值代入到步骤(a3)中获得的该C反应蛋白定量检测系统对应的C反应蛋白定值标准曲线的方程，从而获得所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度值，该浓度值即为该C反应蛋白定量检测系统对所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度的定值结果。针对N个C反应蛋白定量检测系统会得到N个定值结果。
其中，所述C反应蛋白定值标准曲线的横坐标(X)为理论浓度，纵坐标(Y)为测定浓度。步骤(a5)中是将所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的测定浓度代入所述C反应蛋白定值标准曲线方程的Y值，计算得到的X值为所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度。
(a6)将步骤(a5)获得的针对所述N个C反应蛋白定量检测系统的全部所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度进行求平均处理，所得均值即为所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白浓度的最终定值结果。
该方法中的所述N可为2以上的自然数，具体如N为3-20的自然数，更加具体的，N为10。
更进一步地，所述(a1)具体可按照包括如下步骤的方法实现：
(A)配制系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液：将稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质按照不同体积比混合，从而获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液；在配制每份所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的过程中，均对组成所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的所述稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质分别进行称重。
(B)系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度测定：分别测量步骤(A)中配制的系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的各自的密度。
(C)获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度：按照如下公式计算所述系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中的每份稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度，
式中，C1表示所述C反应蛋白国际标准物质中C反应蛋白的浓度；ρ1表示所述C反应蛋白国际标准物质的密度；M1表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述C反应蛋白国际标准物质的质量；C2表示所述稀释液中C反应蛋白的浓度；ρ2表示所述稀释液的密度；M2表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量；ρ3表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度；C表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的理论浓度。
更加具体地，步骤(B)中，可按照包括如下步骤的方法测定所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度：
(b1)称出容器和加样枪枪头的质量，记为m1；
(b2)用(b1)中的所述加样枪枪头吸取体积为常数v的待测样本，然后置于(b1)的所述容器中(之前包括“擦去所述加样枪枪头外面粘附的所述待测样本”的步骤)，并整体称重，记为m2；
(b3)按照如下公式计算所述待测样本的密度：ρ待测＝(m2-m1)/v。
其中，步骤(b1)和(b2)根据需要可进行3-5次重复。相应的，步骤(b3)中的公式等号右边的参数m1和m2取3-5次重复的平均值。
在本发明中，所述C反应蛋白国际标准物质具体选用的是ERM-DA474/IFCC。
在本发明中，步骤(a1)中，将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释时，采用的稀释液具体为低值血清；所述低值血清更加具体的为含有浓度为0.27mg/L的C反应蛋白的血清(浓度0.27mg/L是经超敏方法测定的)。
所述血清为外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状，除外HIV、甲肝、乙肝、丙肝等病毒感染性的人血清。
其中，所述C反应蛋白定量检测系统在正式试验前均须通过精密度、正确度、系统线性、携带污染等一系列的测量系统的性能验证。性能验证通过后，一周内进行正式定值实验。
在本发明中，所述系统对C反应蛋白的定量检测原理为透射比浊法或散射比浊法。所述系统如临床实验室C反应蛋白检测系统。
实验证明，本发明采用人CRP低值血清的混合液稀释国际有证标准物质ERM-DA474/IFCC制作校准曲线，采用10个检测系统为候选参考物质定值，定值结果准确一致，为CRP的标准化和一致化工作提供新思路。由本发明定值方法所研制得到的人血清来源的CRP候选标准物质与国际标准物质相比，原料来源丰富。该候选标准物质经过多个检测系统联合定值，采用国际标准物质ERM-DA474进行量值传递，有望用于临床实验室常规检测方法的校准或校准验证，以及试剂厂家常规校准品的定值，还可在常规检测系统的室间质量评价和正确度验证计划中发挥作用，提高和监测不同实验室、不同检测系统的CRP检测结果的准确性及一致性。该研究可为推进北京地区乃至全国范围内CRP的临床检验质量、提高防病治病工作的有效性、节约和有效利用卫生资源提供必要的数据支持，将来可能产生一定的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为增强透射比浊法定值标准曲线(8系统)。
图2为速率散射比浊法定值标准曲线(2系统)。
图3为高浓度(L1)样本CRP正确度验证结果。
图4为低浓度(L2)样本CRP正确度验证结果。
图5为2015年CRP正确度验证调查评价结果。其中，靶值为(27.1，109.9)mg/L；评价标准为允许偏差(1/2TEa)12.5％；图中的“米”字形符号是标识靶值坐标。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法的建立
一、材料与方法
1.候选标准物质制备材料和方法
1.1.材料
1.1.1.血清
收集于北京某三甲医院检验科(2016年6月-2016年8月)。遵照国际标准化组织(ISO)指南35及世界卫生组织(WHO)关于制备标准物质血清原料的收集指南，收集健康体检者及住院病人血清置于50ml聚乙烯密闭离心管中，外观澄清透明，除外黄疸、溶血、脂血及乳糜等异常性状，除外HIV、甲肝、乙肝、丙肝等病毒感染性的人血清，不加任何添加物或防腐剂。分别收集CRP高(80.1-200mg/L)和低(10.1-80mg/L)两个浓度)范围的患者血清，每个浓度范围共收集约800ml。
1.1.2.收集管
50ml具螺旋帽聚乙烯洁净塑料管，用于收集血清。1ml具螺旋帽聚乙烯管，环氧乙烷消毒后作为血清分装管。
1.1.3.贝克曼Immage800全自动免疫分析仪(SN:9372)以及配套的试剂定标品，批号是M310472。伯乐液体蛋白两个浓度水平的室内质控品，批号是52482-52483，以上试剂、定标品及质控品均在有效期范围内使用。
1.1.4.过滤装置，滤膜孔径大小分别为0.45μm、0.20μm等。配有真空抽吸泵(美国HENGAO公司)。
2.1.方法
2.1.1.候选标准物质的配制和过滤分装
将收集好的两个浓度范围的血清，每个浓度范围血清约800ml。从-80℃冰箱取出两个浓度范围的所有血清，置于室温融化。然后将分别将两个范围融化后的血清，充分混匀后，取出约0.5ml。使用Beckman Immage800全自动免疫分析仪分别初步测定。混合后高、低两个不同CRP浓度水平大致如下：
水平1(L1)为800ml CRP高值样本，为503例血清样本混合而成，不添加任何物质，采用贝克曼Immage800分析仪检测结果CRP浓度约为110.0mg/L。
水平2(L2)为817ml CRP低值样本，为524例血清样本混合而成，不添加任何物质，采用贝克曼Immage800分析仪检测结果CRP浓度约为25.3mg/L。
将两个浓度混合血清的过滤和分装步骤委托给“北京康彻斯坦生物技术有限公司”进行处理，血清的过滤和分装严格按公认的标准化操作规程(SOP)的要求进行；每管1ml，密封；制备出高、低两个浓度的标准物质分别为754支和743支，分别用不同颜色的管帽区分，分别是绿帽(高水平L1)、白帽(低水平L2)。将这些候选标准物质均放在冷冻盒中，放入-80℃冰箱中保存，每日监测记录冰箱温度情况。
2.多系统联合定值实验的材料、方法和实验步骤
2.1.材料
2.1.1.检测系统
根据2015～2016年度卫生部及北京市血清学CRP室间质评的数据资料，从CRP测定占主流测量仪器和品牌试剂中选择2家实验室的共10个CRP血清学检测系统来作为CRP候选标物的定值系统，具体包括：
北京朝阳医院检验科的4个透射比浊法和1个散射比浊法共5个检测系统(表1)：
A.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国西门子原厂试剂、校准品及质控品；
B.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配德国德赛试剂、校准品及质控品；
C.西门子ADVIA 2400全自动生化仪配国产利德曼试剂、校准品及质控品；
D.西门子ADIVA 2400全自动生化仪配德国罗氏试剂、校准品及质控品；
E.贝克曼Immage800全自动免疫分析仪配原厂试剂、校准品及伯乐质控品。
北京潞河医院检验科的4个透射比浊法和1个散射比浊法共5个测定系统(表2)：
F.贝克曼AU5821全自动生化仪配贝克曼原厂试剂、校准品及质控品；
G.贝克曼AU5821全自动生化仪配北京九强试剂、校准品及质控品；
H.贝克曼AU5821全自动生化仪配日本积水试剂、校准品及质控品；
I.贝克曼AU5821全自动生化仪配宁波美康试剂、校准品及质控品；
J.西门子BNⅡ全自动免疫分析仪配原厂试剂、校准品及质控品。
表1北京朝阳医院检验科5个检测系统试剂、校准品、质控品批号及货号
表2北京潞河医院检验科5个检测系统试剂、校准品、质控品批号及货号
2.1.2.检测材料及样本
2.1.2.1.试剂：所有测定系统的试剂和校准品及室内质控品均在有效期内使用。
2.1.2.2.样本及耗材：经过均匀性、稳定性检测良好的高、低两个浓度的候选CRP标准物质分装好的样品，每支1毫升(步骤1制备)；购买自IFCC的ERM-DA474国际标准物质，批号为：003095；稀释液为CRP低值混合人体检验后血清(后简称低值血清)，经超敏方法检测为0.27mg/L。经校准且有效期范围内的分析天平、加样枪以及烧杯、枪头等辅料。
2.2.方法
2.2.1.原理：经过一系列的预试验的总结，最终决定采用北京市三级医院中的两家检验科实验室的10个定值系统对候选标物CRP高、低两个浓度的候选标物进行联合定值，利用IFCC的ERM-DA474国际标准物质进行量值传递。重量法称取低值血清和国际标准物质ERM-DA474，用低值血清准确配制一系列已知浓度的ERM-DA474的标准工作液，并用此法对高值候选标物进行稀释配制高值标物工作液，分别使用已通过性能验证的10个检测系统对同一批配置ERM-DA474标准工作液和候选标准物质的样本进行检测。用ERM-DA474标准工作液的CRP实际检测浓度与相应理论值绘制标准曲线。通过标准曲线，经计算得到高、低两个浓度的候选标物样本中的血清CRP浓度。
2.3.实验步骤
2.3.1.测量系统定值前准备
a)熟练使用仪器；并在实验当天约原厂技术支持人员一名全程陪同指导并参与检测，最大程度减少测量误差及突发状况。
b)性能验证：所有参与联合定值的检测系统在正式试验前均须通过精密度、正确度、系统线性、携带污染等一系列的测量系统的性能验证。性能验证通过后，一周内进行正式定值实验。
2.3.2.国际标准物质的稀释
根据IFCC的ERM-DA474国际标准物质说明书。每瓶ERM-DA474血清CRP浓度为41.2±2.5mg/L。取ERM-DA474冰冻人血清标准物质6支，严格按照说明书进行复溶和混合。混匀后用加样枪取样，用低值血清(CRP浓度为0.27mg/L)作为稀释液，用分析天平称量法测重量，精确配制工作曲线分析溶液；最终用称重法将ERM-DA474稀释成4个浓度水平,具体配制如表3所示，标记为W1-W4，-80℃冻存备用。
表3称重法稀释ERM-DA474国际标准物质
注：1.共用ERM-DA474国际标物4940μl，实际理论浓度采用相应公式计算；2.W1-W4每种共配2400μl，均分为4支，每支600μl，放-80℃冻存备用，每日每实验室取一份检测。
表3中实际理论浓度具体计算方法如下：
第一步，用低值血清(CRP浓度为0.27mg/L)作为稀释液，将ERM-DA474稀释为表3中的W1-W4共计四份稀释溶液，期间用分析天平称量法准确测量出配制W1-W4四份稀释溶液时所用的稀释液和ERM-DA474的具体重量；
第二步，W1-W4四份稀释溶液的密度测量
(1)采用鉴定合格的天平，先称出小瓶和加样枪枪头的质量，记为m1。
(2)采用无菌橡胶手套，从小瓶中小心拿出加样枪枪头。
(3)采用经校准的加样枪，准确吸取200μl待测样本，然后擦去加样枪枪头外表面的液体后，将装待测样本的加样枪枪头置于小瓶中，整体称重，记质量为m2。
(4)如此反复称量3次，并作详细记录。
(5)根据液体的密度计算公式为ρ＝(m2-m1)/v1，其中，v1为200μl，求得密度的平均值。
(6)按照(1)～(5)的步骤，算出W1-W4四份稀释溶液的密度。
第三步，W1-W4四份稀释溶液的理论浓度计算
根据作为稀释液的低值血清中CRP的浓度(0.27mg/L)，以及ERM-DA474中CRP的浓度(41.2±2.5mg/L)，计算W1-W4四份稀释溶液的理论浓度。如对于某管W1稀释溶液，ERM-DA474的浓度为C1g/L，密度为ρ1，称取的质量为M1，低值血清的浓度为C2g/L，密度为ρ2，称取的质量为M2，某管本身的密度为ρ3，利用公式得到W1的理论浓度：
2.3.3.CRP候选标准物质的血清样品的制备
水平2(L2)候选标物理论值(约25mg/L)在工作曲线线性范围内，因此不需要稀释，U2即是L2候选标准物质；水平1(L1)候选标物理论值(约110mg/L)超出在工作曲线线性范围，考虑到高值候选标物的实际使用和赋值的准确性，故将L1标物用低值血清稀释成两个浓度即U3和U4后，再进行赋值，U3和U4与ERM-DA474的稀释液(W1-W4)的配制采用同一低值血清(0.27mg/L)，具体配制见表4，U2-U4每种共配制18000μl，每种均分为12支，每支1500μl，放-80℃冻存备用。
表4称重法稀释候选标准物质
注：U2为L2，未被稀释；U3和U4为L1按体积比1：4和1：3稀释配制，用称重法计算(具体参见前文“表3中实际理论浓度具体计算方法”进行)。
2.3.4.所有定值样本的密度测定
由于CRP的准确赋值计算过程中需要各种工作液的密度，所以在配置完成分装冻存前用称重法准确测定各种工作液密度：公式：p＝m/v，吸200μl，分析天平称重测量后计算，每份测定三次，取均值计算，具体见表5。
表5称重法测定样本密度
2.3.5.CRP候选标物定值实验
2.3.5.1.室内质控
定值分别在两家实验室10个已经通过性能验证的测量系统上进行，并在通过性能验证后一周内完成所有测定，所有系统在测定当天保养、定标，然后两个水平的室内质控均在2SD范围以内，再进行样品测定。
2.3.5.2.测量操作
在多系统联合定值中，每个实验室均分两天进行，每天测定前将事先分装好的待测样本逐一从-80℃冰箱中取出，实验室间采用冰袋运送，一小时内送达定值实验室，放置室温待完全复融后开始检测。两家实验室10个测量系统，每天每个实验室取W1-W4各1支，U2-U4各3支，室温下复融。每个实验室每个检测系统W1-W4每支连续测3次/天，U2-U4每支每个系统测定6次*3支＝18次/天。每天测定前每个测量系统室内质控均达到规定标准后(即质量控制合格，仪器可以正常工作)，依次对W1-W4，U2-U3开始测定，测定过程中注意室内温湿度的稳定，在所有系统测定过程中、后期各加做室内质控和系统精密度性能验证中的检测样本，从而保证测定系统的稳定。
2.3.5.3.定值的统计方法
用直线拟合的方法给候选标准物质定值。用国际标准物质稀释后的理论浓度和实际测定浓度，每个系统做出一条直线。将候选标物样本测出的实际数值的均值代入直线方程，得出X值，即为候选标准物质工作液的浓度，通过运算后得出每一个测定系统对L1、L2候选标物的准确的定值数据，然后把10个系统的定值结果取均值得出最终候选标准物质的浓度。
2.3.5.4.不确定度的统计方法
根据ISO指南35文件，总不确定度由候选标准物质的定值测量、均匀性、长期稳定性和测量工具如分析天平等引入的不确定度合成，计算公式： 其中式中u2 ver为测量不确定度，它包括了标准曲线、测定重复性和ERM-DA474的不确定度；u2 bb为不均匀性引入的不确定度；u2 lts为长期稳定性引入的不确定度，u2 grav为分析天平等测量工具引入的不确定度。国际标准物质ERM-DA474的说明书给出的扩展不确定度是2.5mg/L，所以在计算中应加以考虑。分析运算包括A类和B类不确定度，本次实验中除A类外，还考虑了分析天平的B类不确定度。
3.候选标准物质正确度验证
3.1.实验室及检测系统
3.1.1.实验室
北京地区42家医疗机构临床实验室。
3.1.2.检测系统
常规CRP血清学免疫检测系统或生化检测系统，如日立、西门子、Roche，Beckman系列分析仪及其可以配套的试剂、校准品及质控品。
3.2.正确度验证的方法
3.2.1.分发样本
两个浓度水平CRP候选标准物质，每个浓度水平各2支，分发至北京地区42家临床实验室。
3.2.2.测定方法
分别于2日测定(间隔2日)，每天测定1支，测定当天将样本在室温放置30分钟，待其完全融化，平衡至室温后，轻轻上下颠倒10次混匀，避免产生气泡。每支样本CRP在每家实验室现有CRP血清学检测系统连续测定3次，测定前保证检测系统稳定且室内质控达标(即质量控制合格，仪器可以正常工作)。
3.2.3.运输
运输过程中将样本放置于有冰袋的保温容器中，以保证样本处于冰冻状态。若样本不能及时检测，应存放在2-8℃冰箱冷藏，一周内必须完成检测，且将数据上报至北京市临检中心邮箱。
3.2.4.剔除离群值
用合适的方法剔除离群值，即国家标准《GBT 4883-2008数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理》中推荐的Grubbs法。
3.2.5.数据处理
用Excel 2007软件计算每个实验室6次结果均值和标准偏差，以赋值结果为靶值，以卫生部临床检验中心1/2允许总误差(1/2TEa)为允许限，绘制正确度验证示意图；对42家实验室的均值结果采用国家标准(GBT 4883-2008)剔除离群值，采用SPSS17.0对数据就行正态性检验，最后将所有方法的均值(x1)和标准差(sd1，相当于U1)与标准物质认定值(x2)和不确定度(U2)，采用效能函数验证定值的准确性。
3.2.6.室间调查统计方法
偏倚(％)＝(医院临床实验室结果-定值)/定值×100％
二、结果
1.多系统定值结果
1.1.10个检测系统定值标准曲线
如图1和图2所示。由图可见：各系统的线性关系好，候选标准物质的定值在标准曲线的定值范围内。
1.2.CRP候选标准物质10系统定值结果
CRP候选标准物质10系统定值结果如表6所示。由表可见：各检测系统的均值很接近，U2，U3和U4分别为26.24～27.64mg/L，21.45～22.53mg/L，27.41～28.6mg/L。
表6 CRP候选标准物质10系统定值结果
1.3.CRP候选标准物质多系统定值结果
候选标物最终定值为10系统定值的均值，定值过程中的不确定度分量取10个系统总不确定度的均值。具体结果过见表7。由表可见：两水平候选标准物质的定值及不确定度分别为109.9±9.1mg/L和27.1±2.3mg/L。
表7 CRP候选标准物质多系统定值结果
1.4.总不确定的评估及最终定值结果
具体结果见表8。由表可见：CRP候选标准物质的不确定度拟合了定值过程，均匀性，稳定性和天平称量的误差，并进行了扩展(扩展因子k＝2)，两水平最终的不确定度分别为9.1mg/L和2.3mg/L。
表8 CRP候选标准物质总不确定度评估及最终定值结果
综上，CRP冰冻混合人血清候选标准物质经过ERM-DA474国际标准物质量值传递，经2家实验室，10个主流检测系统联合定值，最终定值结果为：水平1(L1)：109.9±9.1mg/L；水平2(L2)：27.1±2.3mg/L，不确定度水平与国际标准物质ERM-DA474相当。
2.正确度验证结果
2.1.正确度验证
CRP候选标准物质样本共分发北京市46家实验室，42家实验室回报结果，其中三级医院30家，二级医院12家。
2.2.CRP候选标准物质水平1(L1)正确度验证结果经处理
42个L1回报结果中，总体均值为114.19mg/L，标准差为19.10，中位值：109.58,最大值为162.07mg/L，最小值为70.1mg/L。根据Grubbs法，所有结果有1个离群值(33.37mg/L)，剔除后的结果见图3，CRP项目室间质量评价允许偏差为±25％，上下限为±12.5％(1/2TEa)。从图3中可以看出高于上限有8家实验室，低于下限有3家实验室，北京市有73.8％的实验室L1测定结果合格。
2.3.CRP候选标准物质水平2(L2)正确度验证结果经处理
42个L2回报结果中，所有方法均值为26.51mg/L，标准差为3.23，中位值：25.65,最大值为33.90mg/L，最小值为20.02mg/L。根据Grubbs法，所有结果无离群值。如图4所示。CRP项目室间质量评价允许偏差为±25％，上下限为±12.5％(1/2TEa)。从图4可以看出，高于上限有5家实验室，低于下限有5家实验室，北京市有76.1％的实验室L2测定结果合格。
经SPSS 17.0Kolmogorov-Smirnov Z检验，实验室回报的L1和L2数据成正态分布，效能函数分别为0.18和0.20，均小于1。
2.4.临床实验室正确度验证结果评价示例
以某家医院为例，其使用贝克曼Immage800全自动免疫分析仪测定CRP样本，本次发放的2个水平样本检测结果均值与定值偏倚分别为5.49％、-2.45％，可以认为其测量结果在允许偏倚≤±12.5％的评价标准下，该常规测量系统CRP测量结果正确，结果见表9。
表9北京某医院CRP正确度评价结果
样本批号 均值 靶值 偏倚％ 标准差 变异系数％ 仪器 方法
2015L1 109.67 109.9 5.49 0.99 3.85 贝克曼 速率散射比浊法
2015L2 25.67 27.1 -2.45 3.33 3.03 贝克曼 速率散射比浊法
2.5. 2015年CRP正确度验证调查评价结果的U顿图见图5。在可接受限内的实验室为30家，占所有回报结果的实验室的比例为71.4％。从图中可以看到位于左下角和右上角的点分别存在和负偏倚和正偏倚，但是图中位于方框外左上方的一点则存在低值过低，高值过高的问题，可能与方法学本身的原因或实验室的操作不当有关。
标准物质的定值是对标准物质特性量定值的全过程。标准物质作为计量器具的一种，要做到这一点就必须保证标准物质的量值具有溯源性，即标准物质的量值能通过连续的比较链以给定的不确定度与国家的或国际的基准联系起来。给标准物质定值有很多种方式，由于C反应蛋白的检测至今没有参考方法，本发明采用目前国际上通用的CRP的标准物质IFCC生产的ERM DA-474作为标准，进行量值传递，在两家实验室的10个目前国内实验室占主流的CRP血清测定系统，用多系统联合定值的方法，最终给两个水平的候选CRP标准物质进行定值。
利用IFCC的ERM DA-474国际标准物质进行量值传递，准确配制一系列已知浓度的ERM DA-474的标准工作液，分别使用已通过性能验证的10个测定系统对标准工作液和两个浓度的CRP标准物质进行测定。用ERM DA-474标准工作液的CRP浓度(C)与相应理论值绘制标准曲线。通过标准曲线，计算两个浓度的候选标物样本中的血清CRP浓度。
本发明证实了用低值血清作为稀释液对于>10mg/L的CRP样本测定是可行的。在最终的CRP的定值试验中也证明了这一点，虽然10个不同的测试系统在测量值上不尽相同，但是经过ERM DA-474的量值传递，每个系统对CRP候选标物的低、高两个浓度定值数据都较为理想。这也与某些文献上描述的相似，同时证明采用ERM DA-474进行溯源，能够保证了在不同时间与空间CRP量值的准确性与一致性。
本发明用国际标准物质量值传递的方式给候选标准物值定值，对于没有参考方法的C反应蛋白，是一种准确可行的方法。本课题研制出两个浓度水平的CRP候选标准物质各750支左右；多系统联合定值实验是本次研究的一个突破，本发明采用了2家实验室10种CRP血清学测量系统对制备的冰冻混合人血清候选标准物质进行联合定值，此种方式和规模在国内很少见，定值过程科研，结果可靠。两个水平候选标准物质定值的结果分别是水平1：109.9±9.1mg/L,水平2：27.1±2.3mg/L，不确定度与国际标准物质ERM-DA 474相当，最终不确定度的计算中拟合了国际标准物质、长期稳定性、均匀性、重复性、多系统定值差异以及天平等分量。
众所周知，CRP是重要的炎症指标，在临床上被广泛应用于感染性疾病的诊断及监测。它还是一个评估心脏病发生率、复发率、死亡率的临床重要指标。本发明制备CRP候选标准物质正确度评价实验中，选择的北京市42家实验室均是二甲医院以上的实验室，它们均有良好的室内质控和室间质评的质量管理体系，都能很好地服务于临床。CRP项目室间质量评价允许偏差为±25％，上下限为±12.5％(1/2TEa)。42家实验室中，在可接受限内的实验室为30家，占所有回报结果的实验室的比例为71.4％,成绩可判断为“满意”。这说明本发明正确度验证计划有极其重要的意义。
在这次试应用过程中，制备的2水平候选标准物质在北京地区临床实验室的适用情况良好，两个水平的定值结果分别为109.9±9.1mg/L和27.1±2.3mg/L。42家实验室测定的L1均值为114.19mg/L，标准差为19.10mg/L，L2均值为26.51mg/L，标准差为3.23mg/L。定值结果与所有参加实验室的均值无显著差异，效能函数En均小于1。反过来也验证了本研究中定值结果的可靠性。
综上所述，本发明采用人CRP低值血清的混合液稀释国际有证标准物质ERM-DA474/IFCC制作校准曲线，采用10个检测系统为候选参考物质顶值，定值结果准确一致，为CRP的标准化和一致化工作提供新思路。
本发明研制的人血清来源的CRP候选标准物质与国际标准物质相比，原料来源丰富。该候选标准物质经过多个检测系统联合定值，采用国际标准物质ERM-DA474进行量值传递，有望用于临床实验室常规检测方法的校准或校准验证，以及试剂厂家常规校准品的定值，还可在常规检测系统的室间质量评价和正确度验证计划中发挥作用，提高和监测不同实验室、不同检测系统的CRP检测结果的准确性及一致性。该研究可为推进北京地区乃至全国范围内CRP的临床检验质量、提高防病治病工作的有效性、节约和有效利用卫生资源提供必要的数据支持，将来可能产生一定的经济效益和社会效益。

Claims (7)

1.一种基于量值溯源的C反应蛋白多系统定值方法，包括如下步骤：采用C反应蛋白国际标准物质进行量值传递的方式对候选C反应蛋白标准物质进行定值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(a1)将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释，得到系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液，并计算获得各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度；
(a2)采用N个C反应蛋白定量检测系统分别测定步骤(a1)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的浓度；
(a3)针对所述N个C反应蛋白定量检测系统中的每个C反应蛋白定量检测系统，均采用步骤(a1)获得的各稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度和步骤(a2)中获得的各稀释溶液中C反应蛋白的测定浓度进行线性拟合，得到C反应蛋白定值标准曲线；
(a4)采用所述N个C反应蛋白定量检测系统分别测定所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度；
(a5)针对所述N个C反应蛋白定量检测系统中的每个C反应蛋白定量检测系统，均将步骤(a4)获得的所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的测定浓度代入到步骤(a3)获得的相应的C反应蛋白定值标准曲线的方程，从而获得所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度；
(a6)将步骤(a5)获得的针对所述N个C反应蛋白定量检测系统的全部所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白的浓度进行求平均处理，所得均值即为所述候选C反应蛋白标准物质中C反应蛋白浓度的最终定值结果；
所述N为2以上的自然数。
3.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述(a1)是按照包括如下步骤的方法实现的：
(A)配制系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液：将稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质按照不同体积比混合，从而获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液；在配制每份所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的过程中，均对组成所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的所述稀释液和所述C反应蛋白国际标准物质分别进行称重；
(B)系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度测定：分别测量步骤(A)中配制的系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的各自的密度；
(C)获得系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度：按照如下公式计算所述系列不同浓度的所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中的每份稀释溶液中C反应蛋白的理论浓度，
式中，C1表示所述C反应蛋白国际标准物质中C反应蛋白的浓度；ρ1表示所述C反应蛋白国际标准物质的密度；M1表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述C反应蛋白国际标准物质的质量；C2表示所述稀释液中C反应蛋白的浓度；ρ2表示所述稀释液的密度；M2表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量；ρ3表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度；C表示所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的理论浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(B)中，是按照包括如下步骤的方法测定所述C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液的密度的：
(b1)称出容器和加样枪枪头的质量，记为m1；
(b2)用(b1)中的所述加样枪枪头吸取体积为常数v的待测样本，然后置于(b1)的所述容器中，并整体称重，记为m2；
(b3)按照如下公式计算所述待测样本的密度：ρ待测＝(m2-m1)/v。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(b1)和(b2)进行3-5次重复，步骤(b3)中的公式等号右边的参数m1和m2取3-5次重复的平均值。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述C反应蛋白国际标准物质为ERM-DA474/IFCC。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，将所述C反应蛋白国际标准物质进行稀释时，采用的稀释液为低值血清；所述低值血清为含有浓度为0.27mg/L的C反应蛋白的血清。
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