CN102279227A - 多肽或蛋白质含量标准物质定值方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽或蛋白含量标准物质定值方法，该方法包括如下步骤：高效液相色谱分离待测样品中的主要成分和杂质；收集分离出的各个组分，将各个组分分别水解为氨基酸，得到各个组分的水解液；向所述各个组分的水解液中加入同位素标记的稳定氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定各个组分中氨基酸的质量分数，计算主要成分水解得到的氨基酸的比例系数；将待测样品水解为氨基酸，得到待测样品水解液，向所述待测样品水解液中加入同位素标记的稳定氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定待测样品水解液中氨基酸的质量分数；计算待测样品中多肽和蛋白的质量分数。本发明的多肽或蛋白含量含量标准物质定值方法准确性高，定值结果可最终溯源到SI单位。

Description

多肽或蛋白质含量标准物质定值方法

技术领域

本发明涉及多肽或蛋白质含量标准物质定值方法。

背景技术

近年来，随着生命科学的进步和生物产业的发展，生物分析技术被广泛的应用于食品安全、临床检验、生物医药等领域中。蛋白质作为一类重要的生物大分子，其测量分析技术也在上述领域得到较为广泛的应用。在食品安全中，许多国家标准都提供了食品中蛋白质功能因子的定量测定方法，如《GB 5009.5-2010食品安全国家标准  食品中蛋白质的测定》、《GB/T5413.2-1997婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定》、《BS EN ISO 21572-2004食品.基因改良有机物及衍生产品的检测方法.基于蛋白质的方法》等，都需要对蛋白质进行定量测定。在临床检验中，许多疾病标准物如C-反应蛋白、前列腺特意抗原等都是蛋白质，并且需要准确定量测定。定量结果的准确与否以及是否可比直接影响到贸易的公平和人民大众的身体健康，为了保证蛋白质含量测定结果的准确可比，有必要开展蛋白质计量研究，研制和使用蛋白质标准物质，并使蛋白质标准物质定值结果最终可以溯源到SI单位。

多肽和蛋白质含量测定是多肽和蛋白质计量的基本问题，是实现多肽蛋白质结构和功能计量的前提和基础。保证多肽、蛋白质测量的溯源性是各国计量机构研究的热点之一，许多蛋白质含量的测定依赖于氨基酸水解的方法。蛋白质通过水解为氨基酸或者部分水解为多肽，通过测定氨基酸或者多肽的含量间接计算蛋白质的含量。该方法未分离多肽或蛋白质中的杂质，直接通过水解后的氨基酸浓度确定蛋白质的含量，可能受到杂蛋白水解产生的氨基酸带来的误差影响；并且采用柱前或柱后衍生化进行氨基酸分析，准确度不高，方法不是国际计量界认可的基准方法，不适合标准物质定值；同时未采用国家氨基酸标准物质作为标准，难以保证标准物质定值结果的准确性和溯源性。

发明内容

本发明的目的是提供一种高准确度、并且可以最终溯源到SI单位的蛋白质或多肽含量的标准物质的定值方法。

本发明所提供的多肽或蛋白含量测定方法，包括如下步骤：

高效液相色谱分离待测样品中的主要成分和杂质；

收集分离出的各个组分，将各个组分分别水解为氨基酸，得到各个组分的水解液；

向所述各个组分的水解液中加入同位素标记的氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定各个组分中氨基酸的质量分数，计算主要成分水解得到的氨基酸的比例系数；

将待测样品水解为氨基酸，得到待测样品水解液，向所述待测样品水解液中加入同位素标记的氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定待测样品水解液中氨基酸的质量分数；

根据如下公式计算待测样品中多肽或蛋白的质量分数：

R_AA：氨基酸的比例系数；

MW_AA：氨基酸的相对分子质量；

MW_待测样品：待测样品的相对分子质量；

M_Total：待测样品的质量；

M_AA：待测样品水解液中氨基酸的质量分数；

N：待测样品每个分子中氨基酸的个数。

本发明的多肽或蛋白含量测定方法，其中：所述氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的任一种。

本发明的多肽或蛋白含量测定方法，其中：所述氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的任几种，所述待测样品中多肽或蛋白的质量分数为每种氨基酸计算出的待测样品中多肽或蛋白的质量分数的平均值。

本发明的多肽或蛋白质含量标准物质定值方法通过HPLC将待测多肽或蛋白质样品中的主成份和杂质充分分离，分别进行测定，校正了杂蛋白等杂质对测定结果带来的误差，提高了定值结果的准确性；通过同位素稀释质谱基准方法对杂质、主成份和样品水解液中的氨基酸进行精确测定，保证了结果的准确性和溯源性；以国家氨基酸标准物质为标准，保证了多肽和蛋白质标准物质定值结果的准确性和溯源性。

附图说明

图1为猪胰岛素主成分与杂质分离和组分收集示意图。

图2为组份1同位素稀释质谱测定提取色谱图。

图3为组份2同位素稀释质谱测定提取色谱图。

图4为组份3同位素稀释质谱测定提取色谱图。

具体实施方式

下述以猪胰岛素为例详细阐明本发明的多肽或蛋白质含量标准物质定值方法。

甲醇：色谱纯，德国Merck公司产品；

乙腈：色谱纯，德国Merck公司产品；

超纯水：经Mllipore纯水系统纯化，电阻率达到18.2 MΩ·cm；

甲酸：分析纯，北京化学试剂公司；

盐酸：优级纯，北京化学试剂公司产品；

无水硫酸钠：分析纯，北京益利精细化学品有限公司；

全氟庚酸：美国Sigma-Aldirich公司；

猪胰岛素：中国药品生物制品检定所；

苯丙氨酸、缬氨酸标准物质：中国计量科学研究院；

苯丙氨酸同位素标记物、缬氨酸同位素标记物：美国剑桥同位素实验室；

液相色谱质谱联用仪：Thermo-Finnigan LTQ，美国热电公司；

漩涡混合器：MS2型，德国IKA公司；

掌上离心机：Mlnl-6K，中国珠海黑马公司；

烘箱：UFE500，德国Memmert公司；

台式离心机：3K15，德国Sigma公司；

移液器(10，20，100，200，1000μL)：法国Gilson公司；

天平：ME235S型，感量0.01mg，德国Satorius公司；

天平：UMX2；型，感量0.μg，瑞典Mettler Toledo公司；

0.2mol/L硫酸盐缓冲液的配制：称取无水Na₂SO₄28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7mL，加水800mL，用乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000mL，用0.45μm抽滤后备用。

猪胰岛素样品溶液配制：取猪胰岛素标准物质，在室温平衡1hr后打开样品管，将内装猪胰岛素样品一次性转入离心管中，用新配制的0.01mol/L的HCl将其配制成1mg/mL的溶液。

取7个猪胰岛素样品，每个样品平行分析3次，HPLC纯度测定条件如下：

采用安捷伦1200高效液相色谱仪进行，色谱柱为Vydac C18，250×4.6mm，仪器参数设置如下：检测波长214nm、流速1.0mL/min、柱温40℃，自动进样器温度为2-8℃，进样体积20μL，每个样品重复进样3针。

流动相A：0.2mol/L硫酸盐缓冲液∶乙腈(82∶18)；

流动相B：乙腈∶水(50∶50)；

流动相配完以后用0.45μm的滤膜抽滤，并超声脱气。

洗脱梯度：

时间(分)     流动相A(％)    流动相B(％)

0            78             22

36           78             22

61           33             67

67           33             67

记录色谱图，按面积归一化法计算纯度。

猪胰岛素反相HPLC纯度测定结果如表1所示。

表1.猪胰岛素纯度测定结果(％)

猪胰岛素样品的平均纯度为97.8％。

猪胰岛素中含有蛋白质杂质，如果将猪胰岛素样品水解后得到的缬氨酸和苯丙氨酸根据猪胰岛素的多肽序列直接计算猪胰岛素的含量，势必对猪胰岛素含量的测定引入正误差。为了计算水解溶液中真正来自猪胰岛素的缬氨酸和苯丙氨酸比例，采用液相色谱分离猪胰岛素的主成分和杂质并进行收集，然后分别对收集的组分中缬氨酸和苯丙氨酸的含量进行同位素稀释质谱方法测定，并计算归属于猪胰岛素的缬氨酸和苯丙氨酸比例系数。

色谱分离条件与猪胰岛素纯度测定条件类似，采用安捷伦1200高效液相色谱仪进行分离和组分收集，色谱柱为安捷伦SB300C18反相色谱柱，柱长250×4.6mm。样品采用分析天平(感量为0.01mg)称量，每次称取约3.5mg猪胰岛素样品，用0.01mol/L的盐酸溶解，过滤后上机分离。流动相及梯度、检测波长、柱温、进样量等条件与猪胰岛素纯度测定时的实验条件一致。色谱分离以及组分收集的典型色谱图如图1所示：

组分共收集成3各部分，在猪胰岛素的主成分之前流出的所有组分收集为组分1，流出的主成分收集为组分2，主成分之后流出的所有成分收集为组分3。将收集到的组分中添加适量的缬氨酸和苯丙氨酸的同位素标记物并混匀，真空浓缩后冻干。

组分1、组分2和组分3分别加入6mol/L的盐酸，通氮除氧后密封，在(110.0±0.5)℃的烘箱中进行水解96小时，然后加入苯丙氨酸和缬氨酸的同位素标记物并混匀溶液。氮气吹干后用含有0.1％甲酸的水溶液复溶，溶液经过0.45μm滤膜过滤后，使用Finnigan LTQ质谱仪采用同位素稀释质谱法进行缬氨酸和苯丙氨酸含量测定，所用液相条件如下：

流动相A为含0.8mM全氟庚酸和0.05％TFA的水溶液，B为MeCN。色谱分离采用安捷伦SB-Aq色谱柱(4.6×250mm)，梯度如下：

时间/min       流速(ml/min)         A(％)        B(％)

0.00           1.5                  100.00       0.00

4.00           1.5                  100.00       0.00

9.00           1.5                  86.00        14.00

14.00          1.58                 4.00         16.00

24.00          1.5                  84.00        16.00

32.00          1.5                  70.00        30.00

34.00          1.5                  100.00       0.00

65.00          1.5                  100.00       0.00

质谱信号采用多反应监测模式，对于缬氨酸和苯丙氨酸的检测，分别监测118-＞72(Val)，126-＞80(标记Val)，166-＞120(Phe)和174-＞128(标记Phe)的离子对，通过同位素稀释质谱方法进行定量测定，同位素稀释质谱的测定结果按照下面的公式进行计算：

上式中：

M_AA ：氨基酸的质量分数

P：氨基酸标准物质的纯度；

m_样：称量样品的质量；

R_样：样品中氨基酸和同位素标记氨基酸的峰面积比；

I₁：低标溶液中氨基酸和同位素标记氨基酸的质量比；

I₂：高标溶液中氨基酸和同位素标记氨基酸的质量比；

R₂：高标溶液中氨基酸和同位素标记氨基酸的峰面积比；

R₁：低标溶液中氨基酸和同位素标记氨基酸的峰面积比；

M：样品质量。

分别计算出三个组分中缬氨酸或苯丙氨酸的含量。然后根据下述公式计算组分2中产生的缬氨酸或苯丙氨酸占总的缬氨酸和苯丙氨酸的比例系数：

R_Val＝M_{Val，Fraction 2}/(M_{Val，Insulin}+M_{val，Fraction 1}+M_{val，Fraction 3})

R_Phe＝M_{Phe，Fraction 2}/(M_{Phe，Insulin}+M_{Phe，Fraction 1}+M_{Phe，Fraction 3})

上式中：

R_Val：缬氨酸的比例系数；

M_{Val，Fraction2}：组份2中缬氨酸的质量分数；

M_{val，Fraction1}：组份1中缬氨酸的质量分数；

M_{val，Fraction3}：组份3中缬氨酸的质量分数；

R_Phe：苯丙氨酸的比例系数；

M_{Phe，Fraction2}：组份2中苯丙氨酸的质量分数；

M_{Phe，Fraction1}：组份1中苯丙氨酸的质量分数；

M_{Phe，Fraction3}：组份3中苯丙氨酸的质量分数。

组份1、组份2、组份3的同位素稀释质谱测定典型提取离子色谱图分别如图2、图3和图4所示：

从图2和图4可见，缬氨酸的的提取色谱图上基本上没有明显的色谱峰，因此其比例系数按照1计算。苯丙氨酸在组份1和组份3的同位素稀释质谱提取色谱图上都有明显的色谱峰，因此对苯丙氨酸的比例系数进行重复实验测定。分别进行4次独立测定，结果如表2所示：

表2.主成分中苯丙氨酸比例系数的测定

取7个猪胰岛素样品，分别加入6mol/L的盐酸，通氮除氧后密封，在(110.0±0.5)℃的烘箱中进行水解96小时，然后加入苯丙氨酸和缬氨酸的同位素标记物并混匀溶液。氮气吹干后用含有0.1％甲酸的水溶液复溶，溶液经过0.45μm滤膜过滤后，采用上述的Finnigan LTQ质谱仪和同位素稀释质谱法测定缬氨酸和苯丙氨酸的浓度。每个样品重复分析3次。

根据同位素稀释质谱测定的缬氨酸和苯丙氨酸的浓度，按照下述公式计算猪胰岛素的质量分数：

$M_{\mathrm{Val}}=\frac{M_{\mathrm{Va}1}\×{\mathrm{MW}}_{\mathrm{insulin},\mathrm{pig}}\×R_{\mathrm{Val}}}{4\×{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Val}}\×T_{\mathrm{Total}}}$

$M_{\mathrm{Phe}}=\frac{M_{\mathrm{Phe}}\×{\mathrm{MW}}_{\mathrm{insulin},\mathrm{pig}}\×R_{\mathrm{Phe}}}{3\×{\mathrm{MW}}_{\mathrm{Phe}}\×M_{\mathrm{Total}}}$

式中：

R_Val：缬氨酸的比例系数；

R_Phe：苯丙氨酸的比例系数；

M_Val：同位素稀释质谱法测定的水解液中缬氨酸的质量分数

M_Phe：同位素稀释质谱法测定的水解液中苯丙氨酸的质量分数；

MW_{insulin，pig}：猪胰岛素的相对分子质量；

MW_Val：缬氨酸的相对分子质量；

MW_Phe：苯丙氨酸的相对分子质量；

M_Total：总共称取的猪胰岛素样品的质量。

计算M_Val和M_Phe的平均数即猪胰岛素的质量分数。

7个猪胰岛素样品进行测定，测定结果如表3所示：

表3.猪胰岛素质量分数测定结果

测定的猪胰岛素的质量分数为0.887。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.多肽或蛋白含量标准物质定值方法，包括如下步骤：

高效液相色谱分离待测样品中的主要成分和杂质；

收集分离出的各个组分，将各个组分分别水解为氨基酸，得到各个组分的水解液；

向所述各个组分的水解液中加入同位素标记的稳定氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定各个组分中氨基酸的质量分数，计算主要成分水解得到的氨基酸的比例系数；

将待测样品水解为氨基酸，得到待测样品水解液，向所述待测样品水解液中加入同位素标记的氨基酸，通过高效液相色谱-同位素稀释质谱法，以国家氨基酸标准物质为标准，测定待测样品水解液中氨基酸的质量分数；

根据如下公式计算待测样品中多肽或蛋白的质量分数：

R_AA：氨基酸的比例系数；

MW_AA：氨基酸的相对分子质量；

MW_待测样品：待测样品的相对分子质量；

M_Total：待测样品的质量；

M_AA：待测样品水解液中氨基酸的质量分数；

N：待测样品每个分子中氨基酸的个数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的任一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸中的任几种，所述待测样品中多肽或蛋白的质量分数为每种氨基酸计算出的待测样品中多肽或蛋白的质量分数的平均值。

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