CN110487923A - 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法 - Google Patents

一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110487923A
CN110487923A CN201910221954.8A CN201910221954A CN110487923A CN 110487923 A CN110487923 A CN 110487923A CN 201910221954 A CN201910221954 A CN 201910221954A CN 110487923 A CN110487923 A CN 110487923A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid dna
molecular
linear plasmid
phosphorus
exclusion chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910221954.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110487923B (zh
Inventor
高运华
李春
王志栋
牛春艳
王晶
高颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Metrology
Original Assignee
National Institute of Metrology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Metrology filed Critical National Institute of Metrology
Priority to CN201910221954.8A priority Critical patent/CN110487923B/zh
Publication of CN110487923A publication Critical patent/CN110487923A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110487923B publication Critical patent/CN110487923B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及线性质粒DNA含量的检测方法，包括下述步骤：(1)待测线性质粒DNA样本的纯化；(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；(3)以磷标准物质为标准，以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱‑电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱‑电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。本发明用分子排阻色谱方法对线性质粒DNA进行纯度分析，可有效的将无机磷、核苷酸、寡聚核苷酸与质粒DNA分离开，可有效排除核苷酸、寡聚核苷酸、无机磷等非质粒DNA来源的磷干扰，保障了基于质粒DNA中磷元素定量的质粒DNA定量的准确可靠。

Description

一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性 质粒DNA含量的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术产品、生物医药制品、生物诊断试剂等领域，具体地，本发明涉及用于质粒DNA含量的检测方法。
背景技术
准确可靠地定量DNA，在疾病诊断、食品检测和药物质量评价等领域起到至关重要的作用。DNA序列的改变，如DNA甲基化以及染色体的数量变异和结构变异，都与许多疾病的发生发展密切相关。定量研究不仅可以用来对实验结果进行定量，还可以用来检验科学方法及理论的实际应用。目前，常见的DNA定量方法可分为基于紫外吸收的测定或基于荧光的测定两类。紫外吸收光谱，基于DNA链各个碱基单位的假定平均吸光度和分子特征，并且容易受到杂质干扰。实时荧光定量PCR和液滴式数字PCR等是基于荧光的检测方法。qPCR的基础是外部的DNA校准物，标准的可靠性和一致性极大地影响了qPCR量化未知样品的准确性。液滴式数字PCR与qPCR相比具有更高的准确度，但是假阳性信号等问题可能会影响其检测能力。
DNA是一种由核苷酸的重复单元构成的长聚合物，其主链由脱氧核糖，碱基和磷酸基团通过酯键连接而成。由于磷酸盐对特定DNA分子的化学计量比固定，使用ICP-MS测定磷含量是精确定量DNA的最有效方法之一，核酸有证标准物质(CRM)的生产需要准确且可追溯的测量，以证明制剂中物质的质量分数。对纯化的DNA进行磷测量并结合使用适当的CRM作为校准物，将为DNA含量的认证提供可追溯的方法。测量核苷酸或DNA的磷含量提供了可溯源至国际单位制(SI)的核酸定量方法，可以评估测量程序每个步骤的总体不确定性的贡献，该方法使测量结果具有长期可比性。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)为测定化学元素提供了一种高度灵敏的方法，已经在单核苷酸和DNA定量分析中有诸多报道，提供了更高的准确度。
DNA样本中可能混合含有一些片段DNA和无机磷等成分，需要使用合适的分离技术才能实现DNA定量。分子排阻色谱(SEC)是一种常用的分离分析技术，可用于分离和定量核苷酸及DNA。分子排阻色谱－电感耦合等离子体质谱联用技术(SEC-ICP-MS)是一种非常有效的分离分析技术，具有元素专一性、线性范围宽和检测限低等优点，为快速可靠的多元素形态分析方法的开发提供了很好的基础，在蛋白质、脱氧核苷酸、寡核苷酸杂合物、DNA片段和DNA加合物等的分析检测中有着广泛应用。
以前基于同位素稀释质谱的以核苷酸标准为依据的寡聚核苷酸定量，其重要关键步骤是需要将寡聚核苷酸利用核酸酶酶解成单个的脱氧核苷酸或核苷，酶的效率与酶的质量和反应条件密切相关，消解程度不能有效保障，也导致其适用受到明显限制。其重要的缺陷就是不能有效去除外源脱氧核苷酸、脱氧核苷、碱基的影响，导致其适用领域受到明显限制。
发明内容
在本发明针对现有技术的不足，采用分子排阻色谱来分离质粒DNA，联合电感耦合等离子体质谱技术，研究通过检测质粒DNA中磷含量测量从而定量DNA的方法。
本发明提供一种线性质粒DNA含量的检测方法，包括下述步骤:
(1)待测线性质粒DNA样本的纯化；优选地在所述待测线性质粒DNA样品纯化后对其进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱纯度分析；
(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；
(3)以磷标准物质为标准，即以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。
本发明方法实现线性质粒DNA通过分子排阻液相色谱与无机磷、核苷酸、寡聚核苷酸等进行有效分离，即利用分子排阻液相色谱将线性质粒DNA与无机磷，核苷酸、寡聚核苷酸完全分离开来，核苷酸和寡核苷酸也完全分离，核苷酸、寡核苷酸与无机磷也完全分离开来，一方面可以说明线性质粒DNA的纯度，没有核苷酸、寡聚核苷酸等有机磷和无机磷的干扰，另外也为质粒DNA完全消解成无机磷，从而可以利用无机磷标准物质对质粒DNA消解得到的无机磷进行精确定量奠定基础。
其中，所述分子排阻色谱分析的条件本领域技术人员可以根据需要来确定，而本发明优化的条件为：流动相为含Tris-HCl和EDTA的氯化铵溶液，调pH至7.0-8.0，优选为7.5。
流动相采用含Tris-Hcl和EDTA的氯化铵溶液，进而优选采用对应的碱性溶液氨水进行调节pH值，可避免引入其它离子，避免对分子排阻色谱分离质粒DNA造成干扰，而影响洗脱效果和定量分析。
根据本发明的优选方式，所述分子排阻色谱分析的流动相为0.3M氯化铵含10mMTris-Hcl和1mM EDTA，所述流动相的pH为7.5。
进一步地，上样量为10μl，流速为0.5ml/min，柱温为20-30℃,优选为25℃的室温，检测波长260nm，采集时间30min。
发明人发现，本发明的分子排阻色谱分析采用上述上样量、流速、注温、检测波长和采集时间，能够更有效分离质粒DNA，进一步提高质粒DNA定量的准确度。
通过上述分子排阻液相色谱分离纯化线性质粒DNA之后，进一步包括电感耦合等立体质谱分析确定待测质粒DNA的纯度，本领域技术人员可以根据需要来确定电感耦合等立体质谱分析条件，而本发明优先的条件是：射频发射功率1550W，射频电压1.80V，采样深度8.0mm，雾化气1.0L/min，补偿气35％。更优选地是:四级杆真空度为0.002Pa，雾化室温度为2.0℃，载气流量为1.0L/min，反馈功率为18W，蠕动泵为0.3rps，RF功率为1550W，采样深度为8mm，数据采集模式为TRA，采集时间为20min，积分时间为1.00s。
其中，所述的线性质粒DNA消解方法为：将待消解线性质粒DNA分子加入消解罐，加入0.05至0.15倍的过氧化氢，放入密闭容器中，于130至180℃，消解10至18h，优选地加入0.1倍过氧化氢，放入密闭消解罐中，于150℃，消解14h。
优选地，第(3)步的具体步骤为:使用磷元素国家标准物质制备浓度梯度工作标准，用分子排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱进行分离分析，以浓度梯度工作标准的质量浓度为横坐标，以质谱峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线，因此标准曲线是磷浓度关于峰面积的线性函数；然后测定消解后的线性质粒DNA的峰面积，通过标准曲线计算磷浓度，核酸的分子量和磷的分子量及磷在核酸中的比值计算质粒DNA的含量。
进一步地，其中第(3)步中质粒DNA浓度按下式计算：
式中：c—质粒DNA质量浓度；cs—由标准曲线求得样品液中P的质量浓度；f—质粒DNA的稀释倍数；P％—质粒DNA分子中P元素含量百分比。
进一步地，线性质粒DNA检测的定量限为17mg/kg，因此采用本发明方法时，优选地事先需通过常规方法测定线性质粒DNA的浓度要大于17mg/kg，以确保应用本发明方法能够更加准确的进行定量测定。
本方法首先用分子排阻色谱方法对通过其他已知方法纯化的质粒DNA进行纯度分析，可以有效的将无机磷、核苷酸、寡聚核苷酸与质粒DNA分离开来，可以有效排除了核苷酸、寡聚核苷酸、无机磷等非质粒DNA来源的磷干扰，保障了基于质粒DNA中磷元素定量的质粒DNA定量的准确可靠。然后本方法对经过纯度分析合格的样本，进行消解处理，本发明中的消解方法，可以有效保障质粒DNA中连接的磷元素可以完全解析成无机磷，保障了基于质粒DNA中磷元素定量的质粒DNA定量的准确可靠。以前基于同位素稀释质谱的以核苷酸标准为依据的寡聚核苷酸定量，其重要关键步骤是需要将寡聚核苷酸利用核酸酶酶解成单个的脱氧核苷酸或核苷，酶的效率与酶的质量和反应条件密切相关，消解程度不能有效保障，也导致其适用受到明显限制。本发明的方法克服了现有技术的缺陷，能够更准确的定量线性质粒DNA的浓度。
附图说明
图1.dCMP(实线)、5089bp DNA(双点划线)和磷溶液成分分析标准物质(虚点线)的质谱图。
图2.美国NIST无机磷标准(SRM 3139a)10mg/kg HPLC-ICP-MS测试图。
图3.单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA。
图4. 0.15mg/kg无机磷标准物质的HPLC-ICP-MS测试图。
图5 0.2mg/kg无机磷标准物质的HPLC-ICP-MS测试图。
图6 0.5mg/kg无机磷标准物质的HPLC-ICP-MS测试图。
图7 1.7mg/kg无机磷标准物质的HPLC-ICP-MS测试图。
图8磷溶液成分分析标准物质的标准曲线。
图9消解前的单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA和消解后的单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA的质谱图，10mM Tris，流速为1.0mL/min。
图10含0.35％的硝酸dCMP的HPLC-ICP-MS测试图。
图11含0.0035％的硝酸dCMP的HPLC-ICP-MS测试图。
图12不含硝酸的dCMP的HPLC-ICP-MS测试图。
具体实施方式
下面详细描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一：dCMP、质粒DNA、寡聚核苷酸和无机磷分子排阻色谱分离
实验目的：质粒DNA和dCMP、寡聚核苷酸和无机磷的分子排阻色谱分离
实验材料与仪器：
试剂：脱氧胞嘧啶核苷一磷酸(dCMP)含量标准物质(GBW09806)，片段DNA，质粒DNA，磷溶液成分分析标准物质(GBW(E)080431)，以上试剂来自中国计量科学研究院。Tris(Sigma Aldrich，美国)，盐酸(北京化工厂)，HPLC-ICP-MS实验所用试剂均为分析纯以上，实验用水经超纯水系统制备。
仪器：电子天平、pH酸度计(Mettler Toledo，美国)；Millipore Q超纯水系统(Millipore公司，美国)；Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 8800型电感耦合等离子体质谱仪(Agilent公司，美国)；恒温干燥箱(Memmert，美国)；MS 3涡旋仪(IKA，德国)。
液相条件：色谱柱：YarraTM3μm SEC-4000(LC Column 300mm×7.8mm)，流动相：10mM Tirs(pH＝7.4)，使用超纯水配制(18MΩ·cm电阻率)，并用0.22μm过滤膜过滤。流速：1mL/min，进样体积：20μL.
分子排阻色谱分析的流动相为0.3M氯化铵含10mM Tris-Hcl和1mM EDTA，氨水溶液所述流动相的pH为7.5，上样量为10μl，流速为0.5ml/min，柱温为室温，检测波长260nm，采集时间30min。
电感耦合等离子体质谱条件：射频发射功率1550W，射频电压1.80V，采样深度8.0mm，雾化气1.0L/min，补偿气35％。
更详细的ICP-MS条件见表1。
表1 ICP-MS仪器工作参数
其中上述条件是利用ICP-MS调谐液，和磷标准物质对功率、电压、气流速度等进行优化后得到，保证仪器处于最佳状态。
实验步骤
1、将脱氧胞嘧啶核苷一磷酸(dCMP)含量标准物质(GBW09806)，片段DNA，质粒DNA，无机磷标准物质按磷含量计算配制成浓度约为50mg/kg溶液。
2、按研究确定的实验条件，使用SEC 4000树脂以1.0mL/min的流速，分别对5086bpDNA片段、磷溶液成分分析标准物质、寡核苷酸和dCMP标准物质进行分离检测。
实验结果
使用SEC 4000树脂以1.0mL/min的流速，分别对5086bp DNA片段、磷溶液成分分析标准物质和寡核苷酸dCMP进行分离检测。质谱图(见图1)表明，DNA片段可以与磷溶液成分分析标准物质或寡核苷酸dCMP完全分离，磷溶液成分分析标准物质与寡核苷酸dCMP之间不能完全分离，但是可以发现保留时间有差异。本发明所提出的检测方法，可以很好地将质粒DNA与无机磷、寡聚核苷酸、脱氧核糖核苷等进行有效分离，有效避免这些干扰成分对质粒DNA的定量影响。
实施例二：单增李斯特菌prfA基因检测质粒纯度分析
1实验材料与实验仪器
仪器与试剂：无机磷标准溶液：标准值10.016mg/g±0.033mg/g，美国NIST(SRM3139a)。单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA
液相色谱：Agilent 1290，安捷伦。
电感耦合等离子体质谱仪：Agilent 8800，安捷伦。超纯水处理器：Milli-QAdvantage A10型，法国密理博仪器公司。
2实验方法
(1)将单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA配制成约60mg/kg，无机磷标准物质配制成约5mg/kg浓度溶液。
(2)按上述实施例中描述的实验条件(具体条件下仪器工作参数)，用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法对单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA，无机磷标准物质进行分离检测。
3实验结果
(1)用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法分离分析磷工作溶液。
实验结果如图2所示。由图2可以看出，无机磷标准物质出峰时间在9.021min左右，在质粒DNA出峰位置4.3min左右未见色谱峰。
(2)用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法分离分析单增李斯特菌prfA基因检测质粒。
实验结果如图3所示。由图3可以看出，在无机磷标准物质出峰保留时间9.021min左右未检测到峰，在4.386min处检测到质粒DNA峰。在无机磷和质粒DNA之间未检测到其他杂质峰。因此，单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA样本中未检测到无机磷的存在，说明该方法可以将质粒DNA样本与无机磷有效的分离。
实施例三：方法的检出限的确定
以无机磷标准物质为标准，对方法的检出限进行测量。
1、配制磷工作溶液:用标准值为10.016mg/g±0.033mg/g磷标准物质，重量法梯度稀释，配制成0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.7mg/kg磷工作溶液。
2、用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法分离分析磷工作溶液。
实验结果分别如图4至7所示。由图4至图7可以看出，0.15mg/kg的无机磷标准物质该方法不能有效检测，而0.2mg/kg的无机磷标准物质本方法可以检测到峰，0.5mg/kg的无机磷标准物质信噪比达到3.0。因此，按信噪比3.0标准判定，本方法磷的检出限为0.5mg/kg。1.7mg/kg的无机磷标准物质信噪比达到10。因此，按信噪比9.0标准判定，本方法磷的定量限为1.7mg/kg。质粒DNA为脱氧核糖一磷酸核苷寡聚而成，脱氧核糖一磷酸核苷平均分子量为312，磷元素的分子量为30.974，二者的比例约为10:1，因此，磷的定量限为1.7mg/kg，相对与质粒DNA而言约为17mg/kg。因此事先需通过常规方法测定线性质粒DNA的浓度要大于17mg/kg，以确保应用本发明方法能够更加准确的进行定量测定。
实施例四：磷标准曲线的制作
标准曲线的制作：配制质量分数分别为以2、5、10、20、50PPM的一系列磷溶液成分分析标准物质的标准溶液，在上述优化的实验条件下，以磷溶液成分分析标准物质中磷的质量分数为横坐标(x)，质谱信号丰度为纵坐标(y)绘制标准曲线(见图8)，得到标准曲线方程以及线性相关系数r2。结果表明，在磷溶液成分分析标准物质的浓度范围内线性关系较好，线性相关系数r2均在0.997。
实施例五：单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA的消解
取200μL质粒DNA，加入20μL过氧化氢，放入密闭容器中，150℃，消解14h。同时按相同方法做试剂空白对照。消解后平衡至室温，重量法定容220μL待测。
其中，质粒DNA消解前后分子排阻色谱分离分析图如图9所示。
此外，硝酸消解是ICP-MS最常使用的消解方法，本发明人也尝试研究了利用硝酸对样本进行消解，结果表明，硝酸会显著影响ICP-MS的分析性能。不同硝酸含量的dCMP质谱图，10mM Tris，流速为1.0mL/min。(见图10至12分别是经过150℃硝酸，A含0.35％的硝酸，B含0.0035％的硝酸，C不含硝酸的质谱图)。
实施例六：单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA定量分析
1、取200μL质粒DNA样本，该样本用微量分光光度法测定浓度63mg/kg，加入20μL过氧化氢，放入密闭容器中，于150℃，消解14h。同时按相同方法做试剂空白对照。消解后平衡至室温，重量法定容220μL待测。平行处理另外一份样本，通过添加磷标准物质(30mg/kg)的方法进行法准确性验证。
2、按实施例四制作标准曲线。
3、用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法分离分析质粒DNA、空白对照和磷工作溶液。
4、根据实施例二来设定仪器分析参数，对实验数据进行分析。
配制质量分数分别为2、5、10、20、50、100PPM的一系列磷溶液成分分析标准物质的标准溶液，在优化的实验条件下，以磷溶液成分分析标准物质中磷的质量分数为横坐标(x)，质谱信号丰度为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到标准曲线方程以及线性相关系数R2。线性相关系数R2均在0.999以上(见表1)。
表1磷溶液成分分析标准物质的回归方程和相关系数
质粒DNA经过消解后，有机磷全部转化为无机磷，利用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法得到质粒DNA消解后溶液中的无机磷的峰面积，代入线性回归方程，计算出对应的磷浓度。
质粒DNA浓度按下式计算：
式(1)中：c—质粒DNA质量浓度；cs—由标准曲线求得样品液中P的质量浓度；f—质粒DNA的稀释倍数；P％—质粒DNA分子中P元素含量百分比。
同一样本重复测量8次，结果见表1。
表1单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA分子排阻色谱-电感耦合等立体质谱定量分析结果
利用公式(1)计算待测量的质粒DNA浓度为62.3mg/kg。
通过加标回收的方法证明方法的定量准确性，结果如表2所示。
表2单增李斯特菌prfA基因检测质粒DNA分子排阻色谱-电感耦合等立体质谱定量准确性分析(n＝3)
利用公式(1)计算待测量的质粒DNA和添加了标准浓度为30mg/kg磷标准物质后的样本浓度为91.2mg/kg，利用公式(2)计算回收率为98.8％，由此说明本方法定量结果准确可信。
回收率计算：p＝cs/(cs+C0)×100％………(2)
式(1)中：p—回收率；cs—磷标准溶液；C0-质粒DNA本底浓度。

Claims (9)

1.一种用于线性质粒DNA含量的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)待测线性质粒DNA样本的纯化，并用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱纯度分析；
(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；
(3)以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述分了排阻液相色谱分析的条件是：
流动相为氯化铵，含Tris-Hcl和EDTA，调pH至7.0-8.0，上样量为10μl-20μl，流速为0.4-0.6ml/min，柱温为20-30℃,检测波长260nm，采集时间30min。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述分了排阻液相色谱分析的条件是：
流动相为0.3M氯化铵，含10mM Tris-Hcl和1mM EDTA，用氨水溶液调pH至7.5，上样量为10μl，流速为0.5ml/min，柱温为25℃的室温，检测波长260nm，采集时间30min。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述电感耦合等立体质谱分析条件是：射频发射功率1550W，射频电压1.80V，采样深度8.0mm，雾化气1.0L/min，补偿气35％。
5.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述的线性质粒DNA消解方法为：将待消解线性质粒DNA分子加入消解罐，加入0.05至0.15倍的过氧化氢，放入密闭容器中，于130至180℃，消解10至18h。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的线性质粒DNA消解方法为：将待消解线性质粒DNA分子加入消解罐，加入0.1倍过氧化氢，放入密闭消解罐中，于150℃，消解14h。
7.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，第(3)步具体为：使用磷元素国家标准物质制备浓度梯度工作标准，用分子排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱进行分离分析，以浓度梯度工作标准的质量浓度为横坐标，以质谱峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线；然后测定消解后线性质粒DNA的峰面积，通过标准曲线计算磷浓度，核酸的分子量和磷的分子量及磷在核酸中的比值计算质粒DNA的浓度。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中第(3)步中质粒DNA浓度按下式计算：
式中：c—质粒DNA质量浓度；cs—由标准曲线求得样品液中P的质量浓度；f—质粒DNA的稀释倍数；P％—质粒DNA分子中P元素含量百分比。
9.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，线性质粒DNA检测的定量限为17mg/kg。
CN201910221954.8A 2019-03-22 2019-03-22 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法 Active CN110487923B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910221954.8A CN110487923B (zh) 2019-03-22 2019-03-22 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910221954.8A CN110487923B (zh) 2019-03-22 2019-03-22 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110487923A true CN110487923A (zh) 2019-11-22
CN110487923B CN110487923B (zh) 2023-04-07

Family

ID=68545804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910221954.8A Active CN110487923B (zh) 2019-03-22 2019-03-22 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110487923B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113984943A (zh) * 2021-10-29 2022-01-28 哈尔滨医科大学 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102279227A (zh) * 2010-06-08 2011-12-14 中国计量科学研究院 多肽或蛋白质含量标准物质定值方法
CN103063783A (zh) * 2012-12-13 2013-04-24 中国计量科学研究院 质粒dna定量检测用标准品的制备方法
CN103484557A (zh) * 2013-10-15 2014-01-01 上海市计量测试技术研究院 一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量pcr检测的质粒标准分子
CN103898238A (zh) * 2014-01-26 2014-07-02 中国计量科学研究院 一种甲肝病毒定量检测用质粒标准分子
US20160097089A1 (en) * 2006-02-13 2016-04-07 Fluidigm Canada Inc. Methods of Using Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy Systems for Analyzing a Cellular Sample
US20170073756A1 (en) * 2014-03-13 2017-03-16 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160097089A1 (en) * 2006-02-13 2016-04-07 Fluidigm Canada Inc. Methods of Using Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy Systems for Analyzing a Cellular Sample
CN102279227A (zh) * 2010-06-08 2011-12-14 中国计量科学研究院 多肽或蛋白质含量标准物质定值方法
CN103063783A (zh) * 2012-12-13 2013-04-24 中国计量科学研究院 质粒dna定量检测用标准品的制备方法
CN103484557A (zh) * 2013-10-15 2014-01-01 上海市计量测试技术研究院 一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量pcr检测的质粒标准分子
CN103898238A (zh) * 2014-01-26 2014-07-02 中国计量科学研究院 一种甲肝病毒定量检测用质粒标准分子
US20170073756A1 (en) * 2014-03-13 2017-03-16 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLDEN MJ 等: "Traceable phosphorus measurements by ICP-OES and HPLC for the quantitation of DNA", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
LOPEZ-FERNANDEZ 等: "Determination of specific DNA sequences and their hybridisation processes by elemental labelling followed by SEC-ICP-MS detection", 《ANALYST》 *
李妍 等: "HR-ICP-MS定磷法在定量检测DNA分子中的应用", 《实验室研究与探索》 *
沈萍: "《微生物遗传学》", 30 September 1995, 武汉大学出版社 *
王菊英 等: "《海洋生态环境监测技术方法培训教材 化学分册》", 30 September 2018, 海洋出版社 *
田京城 等: "《仪器分析》", 31 August 2007, 哈尔滨地图出版社 *
高运华 等: "荧光标记DNA高分辨电感耦合等离子体质谱定量分析", 《高等学校化学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113984943A (zh) * 2021-10-29 2022-01-28 哈尔滨医科大学 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法
CN113984943B (zh) * 2021-10-29 2023-12-22 哈尔滨医科大学 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110487923B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106483232A (zh) 一种土壤中多种农药残留的快速检测方法
CN104212803A (zh) 用于汞离子定量快速检测的核酸适配体序列及其检测方法
CN107941980A (zh) 水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法
CN110231375A (zh) 一种标准加入法对磷酸及其磷酸盐中氟含量的检测方法
CN110455961B (zh) 一种保健酒中多成分的高通量检测方法
CN105372371A (zh) 同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法及应用
CN110487923A (zh) 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法
CN108152425B (zh) 一种高效液相色谱检测芝麻油木脂素的方法
CN108760920B (zh) 一种基于hplc-msms法测定氰霜唑及其代谢物残留量的方法
CN105606435A (zh) 一种测定土壤中汞含量的前处理方法及使用其的检测方法
CN109239236A (zh) 一种同时测定玄参中10种核苷类成分的方法
CN101349637A (zh) 烟草中非蛋白质氮含量的测定方法
Compain et al. Improved method to quantify intracellular zidovudine mono‐and triphosphate in peripheral blood mononuclear cells by liquid chromatography‐tandem mass spectrometry
CN106018608A (zh) 加速溶剂萃取-液相色谱串联质谱法测定烟用接装纸中高氯酸根的方法
Gill et al. Adult/Pediatric Nutritional Formula by Liquid Chromatography: First Action 2011.20
CN113866318A (zh) 一种(6-氨基吡啶-2-基)(1-甲基哌啶-4-基)甲酮双盐酸盐的检测方法
CN106053654A (zh) 测定食醋中乙酸δ13C值的方法
CN111337611A (zh) 水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法
CN109324140A (zh) 一种烟叶中玉米素核苷固相萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法
CN104297400B (zh) 同时测定轻工产品中三种吡咯烷酮残留量的快速检测方法
CN103994981A (zh) 一种快速测定蜂蜜制品中铝离子含量的方法
CN103808836B (zh) 一种尿液中3-烷化腺嘌呤dna加合物的测定方法
CN108776113A (zh) 一种双核铀酰配合物在atp分析中的应用
CN113640401B (zh) 一种土壤中马兜铃酸的检测方法
CN117517543A (zh) 一种土壤中多种有机磷阻燃剂含量的同步检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant