CN103063783A - 质粒dna定量检测用标准品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次建立了一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段后，进行酶解，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量。本发明提供了超声波处理质粒DNA的优选条件和高效液相色谱法分离四种核苷酸的条件。本方法精密度好，准确度高：采用核苷酸标准品，不依赖于DNA标准品，因此测量结果可溯源至核苷酸有证标准物质，从而保证测量结果的可靠和可溯源。由于用本方法可对质粒DNA进行绝对定量，可用于质粒DNA定量检测用标准品的制备。

Description

质粒DNA定量检测用标准品的制备方法

技术领域：

本发明属于生化分析领域，涉及一种可溯源的质粒DNA定量方法，具体涉及质粒DNA定量检测用标准品的制备方法。

背景技术

质粒DNA是游离于染色体外的小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。

质粒DNA定量在分子生物学领域有广泛的需求，如进行克隆文库构建时的酶切和连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA的浓度进行准确测定。

现有的测定DNA的技术虽然有些可以用于测定质粒DNA，但都有不足。有的需要的DNA样品量非常大，比如ICP-OES方法；有的成本较高，如digital PCR方法耗材太贵；有的准确度达不到要求，例如PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量时具有以下两个缺点：一是目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，一般是通过紫外吸收（OD260）确定的，不同厂家不同批次数值都不同，也没有相关的不确定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准（48.5K）。有报道称：以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。

因为目前没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此需要要研制质粒DNA标准品。

而得到质粒DNA标准品必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。

利用液相色谱－同位素稀释质谱法(LC-IDMS)测定寡核苷酸的文献已有报道，是通过酶解寡核苷酸，测定水解后的单核苷酸浓度来测算核酸的浓度。然而，与寡核苷酸不同的是，单纯利用酶对基因组或质粒DNA进行完全水解非常困难。

本发明人曾经通过将超声波处理结合酶解实现对基因组DNA（Lambda DNA）的定量（参见Analytical bioanalytical chemistry,2012，402，2079-2088.）。采用超声波+酶解+LC/MS方法；超声波强度为7，使用了两种酶，实现了对大片段的基因组DNA定量测定。

但是，该文章公开的方法测定的对象是分子量较大的基因组DNA，并不是质粒DNA。因为基因组DNA分子量更大，而且结构有差异，不象质粒DNA那样的环状，所以此方法的超声波条件、酶解条件等并不适用于质粒DNA定量。

发明内容：

本发明的目的是提供一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，该方法应准确度高，精密度好，相对扩展不确定度2.3%。

本发明首次建立了质粒DNA超声波-同位素稀释质谱定量方法，达到了上述发明目的。

本发明的技术方案是：

将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量；

其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段后，进行酶解，条件为：

1）所述超声波处理条件如下：强度：5，时间：25min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C；

2）所述酶是磷酸二酯酶（SVP）；

3）磷酸二酯酶的活性浓度为0.02-0.025U/μL，最佳活性浓度为0.022U/μL；

4）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为100min以上，最佳时间是120min。

酶解时用磷酸二酯酶工作缓冲液将质粒样品制成溶液，所述缓冲液的组成为：

Tris-HCl（pH=8.8)100mM，

NH₄Ac            10mM，

Mg(Ac)₂           2300mM

酶解质粒DNA样品体系见表1：

表1酶解质粒DNA样品体系组成

成分	μL/每次反应
		SVP	5.0
SVP工作缓冲液	5.0
		超声处理的质粒DNA	50
同位素标记核苷酸LdNMP混合液	5

表中，同位素标记核苷酸（LdNMP）混合液的制备方法是，加一定量的13-C、15-N同位素标记的核苷酸标记物，使溶液中LdNMP含量与质粒分子样品中dNMP含量的比值接近1:1。

高效液相色谱分析中，色谱条件为：流动相A：20mM醋酸铵，pH=3.5；流动相B：乙腈。

具体的，本发明人进行了如下研究工作：

1．对超声波处理质粒DNA的条件进行了优化

采用声波聚焦样本处理仪，对处理强度（intensity)、上样量、处理时间等进行了优化。优化结果见图1，其中2和3泳道为处理时间15min，处理强度5，4和5泳道为处理时间15min，处理强度为4；6和7泳道为处理时间25min，处理强度为5。由图可知，处理时间25min，处理强度为5时，所得到的质粒DNA片段比较均匀，且小于200bp。因此最终确定的处理条件为强度：5；时间25min；上样量100μL；Duty Cycle：10%，Cycle per Burst：200，温度：4℃。DNA浓度范围：10-50ng/μl。

2．对磷酸二酯酶酶解质粒样品的条件及体系进行了优化

1）对磷酸二酯酶的浓度进行优化

将磷酸二酯酶稀释成活性单位分别为0.010unit/μL、0.014unit/μL、0.018unit/μL、0.022unit/μL、0.026unit/μL以及0.030unit/μL共6个水平，每个水平3次平行的SVP稀释液。向50μL破碎后的质粒DNA中分别加入5μL SVP溶液及5μL SVP缓冲液。37℃进行酶解3h，然后85℃变性20min。4℃保存。利用4种dNMP标准物质做外标的高效液相色谱（HPLC）对酶解样品进行分析（色谱条件见下面第四点），确定单核苷酸的质量浓度，最大单核苷酸量对应的酶浓度即为酶解反应的最佳活性浓度，如图2所示，图中横坐标为SVP酶的活性浓度，即平均每微升的SVP溶液具有的酶活性单位数；纵坐标为4种单核苷酸相对于最大测定含量（设其值为1）时的相对百分含量。可见，在SVP酶的活性单位浓度在0.02-0.025U/μL之间时，4种单核苷酸的浓度分别达到最高。而达到0.025U/μL时4种单核苷酸的浓度反而降低，表明SVP酶过量对水解反应产生了抑制。因此，实验过程中最佳的解酶SVP酶的活性浓度确定为0.022U/μL。

2）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间优化

酶解时间分别为30、60、120、240及360min时，酶解反应依照最大化单核苷酸浓度进行优化的结果见图3。图中横坐标为SVP酶的酶解时间；纵坐标为4种单核苷酸相对于最大测定含量（设其值为1）时的相对百分含量。当酶解时间从30min到60min时，4种单核苷酸的浓度呈上升趋势。当酶解时间为120min时，4中单核苷酸的浓度达到最高，此后的360min之内变化很小，因此可以认为在120min时达到了完全水解，所以最佳的酶解时间确定为120min。

3．高效液相色谱（HPLC）分离4种单核苷酸条件优化

通过调整缓冲液的pH和盐浓度，对四种单核苷酸得到最大程度的分离。色谱条件为:流动相A：20mM醋酸铵，pH=3.5；流动相B：乙腈。进样量10μL，流速0.2mL/min。检测器：DAD，检测波长254nm。洗脱梯度见表2，分离结果见图2，其中横坐标为时间，纵坐标为DAD检测器的响应信号强度（毫吸光度mAu）。由图可知，4种单核苷酸标准物质的保留时间（按出峰先后顺序）分别为dCMP3.2min、dTMP4.7min、dGMP5.3min、dAMP6.8min。将酶解后的样品于12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分析。

表2HPLC洗脱梯度

4.超声波处理结合酶处理对质粒DNA进行完全水解

超声波处理后的质粒DNA进行磷酸二酯酶处理，酶解条件按照上述优化的条件进行，同时将不经超声波处理的质粒DNA直接进行酶解。采用高效液相色谱对水解后的产物进行分离分析，见图3和4。图3为超声波处理后的质粒DNA样品进行酶解的产物分析，图3与图2相比，除了有和图2中单核苷酸标准物质对应的核苷酸，并没有其他杂峰，说明经过超声破碎以及SVP酶解处理后，质粒DNA完全消化成了4种单核苷酸，酶解完全。

图4为未经超声波处理的质粒DNA直接进行酶解的产物分析，没有经过超声处理而直接使用SVP酶解的DNA中，只发现有dCMP的峰，且强度较弱，说明不经过超声处理，仅有部分DNA被水解。因此可见，经过超声处理的酶解质粒DNA能够完全消化成为4种单核苷酸；未经超声处理的酶解质粒DNA没有得到有效的分解，不能用于后续定量。超声处理有助于SVP酶对质粒分子DNA进行完全酶解。

5．三重串联四级杆质谱定量4种单核苷酸条件

为获得最佳的质谱条件以获得更准确地结果，进行了以下实验：

分别使用4种单核苷酸的标准物质（中国计量科学研究院）及其对应的C、N标记同位素（Sigma Aldrich.Inc.）对三重串联四级杆质谱（QqQ）条件进行优化。根据HPLC的酸性环境，采用正离子模式，电喷雾离子源（ESI）条件见表3。

表3QqQ质谱ESI源参数

对于4种单核苷酸及其对应同位素的定量检测，QqQ需要优化的主要参数为碎裂电压（Fragmentor）以及碰撞能量（Collision Energy，CE），确定各种单核苷酸及其同位素的母离子与子离子的质荷比（m/z），进而利用多重反应监测（MRM）模式下对每种单核苷酸及其同位素在碰撞前母离子、以及碰撞碎裂后特定大小的碎裂子离子的精确捕捉，确定不同单核苷酸及其同位素的精确含量，进而实现对目标质粒分子DNA的定量。

需要确定在最优条件下的母离子m/z及子离子的m/z，优化碎裂电压（Fragmentor）及碰撞能量（CE）。全扫描下的总离子流色谱图见图5，说明4种单核苷酸得到了有效的分离。

1)母离子的确定

分别使用dCMP、dTMP、dGMP、dAMP4种单核苷酸的纯品标准物质及其纯品同位素，在MS Scan模式下对全部m/z进行扫描，并依照文献，从中选定各种核苷酸的母离子。结果见表4，图7为选定的各单核苷酸及其同位素经优化的选择离子流色谱图。

2）Fragmentor值的优化

Fragmentor为施加到毛细管出口端的输入电压，作用是使母离子有效的传输到碰撞池。因此为了使dCMP、dTMP、dGMP、dAMP4种单核苷酸的传输效率最大，对Fragmentor进行优化，在SIM模式下，选定各单核苷酸的m/z，通过不断改变Fragmentor值，以求响应最大，优化结果见图9和表4。图中Y轴以每种单核苷酸最大强度响应信号为1，其他响应信号为相对于最大响应信号的百分比；X轴为主要优化的Fragmentor参数值。

3）子离子的选择

在子离子扫描模式下，输入确定好的母离子、Fragmentor值，通过施加碰撞能量CE，将单核苷酸打碎，观察破碎离子，不断改变CE值，判断破碎离子的稳定程度与相应强度，选择相应好、稳定高的碎片离子为子离子，过程见图10、11、12、13。结果见表5。

dAMP在改变CE打碎母离子的过程发现，主要存在两种较为稳定的碎片离子。如图10，m/z为81碎片离子峰较低，响应较弱；m/z为136的碎片离子峰较高，响应强，故选择后者为子离子。

dCMP在改变CE打碎母离子的过程发现，仅存在一种较为稳定的碎片离子。如图11，m/z为112的碎片离子峰较高，响应强，即为选定子离子。

dGMP在改变CE打碎母离子的过程发现，主要存在两种较为稳定的碎片离子。如图12，m/z为81碎片离子峰较低，响应较弱；m/z为152的碎片离子峰较高，响应强，故选择后者为子离子。

dTMP在改变CE打碎母离子的过程发现，碎片离子强度较弱，不易明显捕获，依照文献^[39]，选定m/z为81的碎片离子，得到较为稳定的碎片，如图13，故选为子离子。

同位素的优化方法同单核苷酸，结果见表4。

4)CE值的优化

CE为碰撞能量，能量过小则不能形成足够的碎片离子，子离子响应差，难以满足定量要求；能量过大则碎片离子进一步发生破碎，破坏了对应子离子的完整，也不能准确定量。因此，在MRM模式下输入选定的母离子、子离子、F绕过，Fragmentor值，通过不断改变CE值，以求得到最佳响应，见图14。图中Y轴以每种单核苷酸最大强度响应信号为1，其他响应信号为相对于最大响应信号的百分比；X轴为主要优化的CE参数值。最终质谱条件见表4：

表44种单核苷酸及其同位素的质谱MRM定量反应条件

6．IDMS方法线性及灵敏度

根据质粒DNA浓度，选择dNMP工作标准溶液浓度在1-100μg/g的范围内考察测定峰面积比与含量比的线性关系。同时，按照仪器响应的信噪比（S/N）=3计算检出限，S/N=10计算定量限，结果见表5。

表5IDMS方法的线性及灵敏度

可见，在1-100μg/g的工作区间内，4种单核苷酸与其标记物的质量比与峰面积比呈良好的线性关系，其量值范围能够满足定量需求。

7．IDMS方法回收率测定

利用测得加标样品的dNMP浓度减去对照组的dNMP浓度，即为实际测量标准溶液的浓度，与理论溶液浓度相比较，即可得到方法回收率，结果见表6。

表64种单核苷酸的加标回收率

实验表明，采用不同的单核苷酸测定时有不同的回收率，采用dCMP测定的回收率为97.52%-101.75%，采用dTMP测定的回收率为89.54%-95.23%，采用dGMP测定的回收率为95.25%-100.23%，采用dAMP测定的回收率为97.75%-100.0%。

8．同位素稀释法测定质粒DNA样品的质量浓度

1）质粒DNA中4种核苷酸的质量浓度计算

将经前处理的待测质粒样品分为3组，每组3个平行待测样，进行IDMS测定。采用公式（1）计算样品中4种核苷酸的浓度：

$w_X=w_Z\&CenterDot;\frac{m_Y\&times;m_Z}{m_X\&times;m_{Y,c}}\&CenterDot;\frac{R_B}{R_{\mathrm{BC}}}\&CenterDot;P\&CenterDot;D----\left(1\right)$

其中，w_X：质粒样品中选定的dNMP的含量(μg/g)；

w_z：标准溶液中dNMP的质量分数；

R_B：样品中的dNMP与相应标记的LdNMP峰面积比；

R_BC’：标准溶液中的dNMP与相应标记的LdNMP峰面积比；

m_Y：样品中加入的LdNMP的量；

m_Yc：标准溶液中加入LdNMP的质量(g)；

m_x：样品的质量(g)；

m_z：标准溶液中加入dNMP的质量(g)；

P：dNMP标准物质的纯度；

D：水解效率。

2）质粒分子的DNA浓度计算

根据（1）计算得到了样品中的4种单核苷酸的质量浓度信息，根据质粒序列信息及已得到的dNMP质量浓度，可以换算为质粒DNA的质量浓度，计算公式如下：

$w_{\mathrm{plasmid}}=\frac{{\mathrm{dw}}_x\&times;M_{\mathrm{plasmid}}}{M_{\mathrm{dNMP}}\&times;A}----\left(2\right)$

其中，w_x：质粒分子DNA的质量浓度(μg/g)；

M_plasmid：质粒分子的相对分子质量；

M_dNMP：选取的dNMP的相对分子质量；

A：对应dNMP在质粒分子中的个数；

d：酶解等实验操作引起的稀释因子。

本方法的创新点和优点是：

1、本方法首次对质粒DNA进行精确定量；

2、开创了超声波-酶解-同位素稀释质谱法进行质粒DNA定量的方法，找到了合适的超声波和酶解处理的条件；

3、方法精密度好：相对标准偏差为低于2%；

4、方法准确度高：采用核苷酸标准品对DNA进行定量，不依赖于DNA标准品，因此测量结果可溯源至核苷酸有证标准物质，从而保证测量结果的可靠和可溯源。

5、由于用本方法可对质粒DNA进行绝对定量，从而可用于质粒DNA定量检测用标准品的制备；

6、比现有技术方法需要样品量较少、成本较低。

附图说明：

图1超声波处理后的质粒DNA条件优化图；

图2磷酸二酯酶水解浓度优化图；

图3磷酸二酯酶水解时间优化图；

图44种核苷酸标准品高效液相色谱分离图；

图5经超声波处理的质粒DNA经磷酸二酯酶水解产物色谱分离图

图6未经超声波处理的质粒DNA经磷酸二酯酶水解产物色谱分离图

图7质粒DNA超声水解后质谱总离子流色谱图

图8四种核苷酸和相应的同位素标记物选择离子流色谱图，其中(I)dCMP，(II)LdCMP，(III)dTMP，(IV)LdTMP，(V)dGMP，(VI)LdGMP，(VII)dAMP，(VIII)LdAMP；

图9三重四级杆质谱Fragmentor优化图

图10dAMP选定不同碎片离子为子离子时的响应

图11dCMP选定不同碎片离子为子离子时的响应

图12dGMP选定不同碎片离子为子离子时的响应

图13dTMP选定不同碎片离子为子离子时的响应

图14三重四级杆质谱CE优化图

图15超声波处理质粒pNK603结果图

图16超声波同位素稀释质谱法与数字PCR测定pNK603结果比较

图17超声波处理质粒pBAZS结果图

图18超声波同位素稀释质谱法与数字PCR pBAZS结果比较

具体实施方式

实施例1超声波－同位素稀释质谱对转基因质粒pNK603的定量

一材料与方法：

1．转基因质粒pNK603，大小3307bp，由中国计量科学研究院研制，通过在载体pEASY-T3上连接2个外源基因片断（zSSIIb和NK603）得到，具体的定性扩展引物序列见表7。

表7引物序列

2.超声波处理

采用声波聚焦超声波破碎仪（Covaris S2），处理条件为强度：5；时间25min；上样量100μL；Duty Cycle：10%，Cycle per Burst：200，温度：4℃。DNA浓度范围：30-40ng/μl。

3.dNMP标准溶液的配制

配制的具体过程同上所述，所不同的是需要根据质粒pNK603样品完全水解dNMP的大致浓度（由紫外分光光度法及序列分子量信息得到）进行标准品溶液的配制。取dNMP标准物质储备液及LdNMP标记物储备液，分别稀释至所需浓度，将2种溶液按照浓度比约1:1均匀混合，配制工作标准溶液，且该加标工作标准溶液的浓度应尽量与待测质粒中dNMP的浓度相近。

4.酶解质粒样品溶液的配制

将经过超声及酶解处理的质粒DNA样品，待其平衡0.5h，称取50μL样品，向样品中添加与标准溶液中加入的等量的C、N同位素的LdAMP标记物，使质粒分子样品中dNMP含量与溶液中LdAMP标记物含量的比值接近1:1。

5.HPLC分离4种单核苷酸

色谱条件如上所述，具体的洗脱梯度见表2。将酶解后的样品于12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分析。

6.HPLC-MS定量

质谱条件扫描的参数见表3和4。将质谱测得的峰面积和标准品以及加入同位素的量根据公式（1）进行计算，得到的四种核苷酸的浓度，然后在根据质粒DNA的序列信息和公式（2）计算得到质粒DNA的浓度。质粒分子信息见表8。

表8pNK603质粒分子单链DNA信息

7.dPCR定量质粒pNK603

1)DNA模板的制备

将质粒DNA由紫外法测定的浓度根据公式从ng/μl换算成copy/μl，然后将DNA通过天平称量用TE_0.1稀释至1200copies/μl备用。

2）dPCR体系及扩增条件

dPCR扩增所用引物和探针见表7，扩增体系和扩增条件见表9和表10。

表9NK603转化体特异性及玉米内标准基因的荧光定量PCR扩增体系

表10dPCR扩增条件

3）数据处理

通过空压机压至芯片将配制好的反应体系压到芯片内，然后运行PCR反应程序，最后通过软件分析得到最终结果。根据得到的阳性分子个数，利用公式（3）计算质粒DNA浓度。

$T=\frac{D}{N\&times;V_p}\&times;\frac{\left(\log (1-\frac{H}{N})\right)}{\left(\log (1-\frac{1}{N})\right)}-----\left(3\right)$

二、实验结果

1.超声波处理质粒DNA的结果

pNK603质粒DNA经过超声波处理（9个重复）后的结果见图15。由图可见，经过超声波处理后，所有的质粒DNA都破碎成了200bp以下的小片段，有利于下一步的酶解。

2.酶解和HPLC分离

标准品的HPLC分离图见图4，经过超声波处理后酶解的样品色谱图见图5，除了四种核苷酸的色谱峰外，没有其它峰出现，所以可证明质粒DNA完全水解。

3.核苷酸浓度测定

根据公式（1）和测定吸收峰的峰面积，计算得到的核苷酸浓度见表11。由表中数据可知，该方法对4种核苷酸的测定的相对标准偏差<2%.

表11四种核苷酸的浓度及不确定度

结果表明dCMP、dTMP、dGMP和dAMP四种核苷酸的浓度分别为9.20、9.16、10.50和9.58μg/g，相对标准偏差(RSD)为1.54%、1.74%、1.04%、0.94%。其中最低相对标准偏差为dAMP。

4.质粒DNA浓度计算

根据质粒DNA分子量和上面计算的核苷酸浓度计算DNA的含量，见公式（2），结果见表12。由四种核苷酸的浓度根据公司（2）分别计算得到的质粒DNA浓度分别为36.80μg/g、39.73μg/g、37.18μg/g和40.429μg/g。四种核苷酸计算的平均值及扩展不确定度为（38.53±0.89）μg/g，与将四种核苷酸加和计算的结果（（38.44±0.88）μg/g）一致性很好。因此表明该方法测定的DNA浓度既可以根据分子量信息和核酸序列信息通过公式（2）计算得出，也可根据四种核苷酸浓度进行加和得出。

表12.根据核苷酸浓度计算的质粒DNA浓度

5.dPCR测定质粒DNA浓度

对样品同时进行三个平行梯度稀释，每个梯度进行4个重复，测定结果如下表。三个重复结果在不确定度范围内一致性较好。

表13dPCR测定结果及不确定度

6.两种方法测定结果比较

为了验证同位素稀释质谱法测定的DNA结果是否准确，对同一样品进行了数字PCR方法测定。测定结果比较见图16，其中圆点表示超声波－同位素稀释质谱法结果，三角形表示数字PCR结果。两种方法测定结果一致性在其不确定度范围内很好，但测量同位素稀释质谱法的精密度要优于数字PCR方法，表明建立的超声波同位素稀释质谱法可用于基因组DNA等大片段的核酸的定量测定。

实施例2超声波-同位素稀释质谱对质粒pBAZS的定量

一材料与方法：

1．质粒pBAZS，大小5206bp，由中国计量科学研究院研制，通过在载体pEASY-T3上连接4个外源基因片断（扩增所用引物见下表）得到；具体扩增引物序列见表14。

表14引物序列

2.超声波处理

采用声波聚焦超声波破碎仪，处理条件为强度：5；Duty cycle:20%；cycle/burst:200；时间25min；上样量0.1mL；DNA浓度范围：30ng/μl左右。

3.dNMP标准溶液的配制

将dNMP标准物质按照使用说明置于烘箱烘干，dAMP、dCMP、dGMP于80℃烘4h，dTMP于40℃烘4h。精确称量一定质量的dAMP、dTMP、dCMP、dGMP标准物质纯品，溶于一定体积的超纯水，配制成浓度为1mg/g的dNMP标准储备溶液（浓度计算时应考虑到标准物质的纯度）。同时精确称量一定质量的C、N标记的LdAMP、LdTMP、LdCMP、LdGMP同位素纯品，溶于一定体积的超纯水，配制成1mg/g的LdNMP标记物储备溶液（浓度计算时应考虑到同位素的纯度）。

根据质粒pBAZS样品完全水解dNMP的大致浓度（由紫外分光光度法及序列分子量信息得到），取dNMP标准物质储备液及LdNMP标记物储备液，分别稀释至所需浓度，将2种溶液按照浓度比约1:1均匀混合，配制工作标准溶液，且该加标工作标准溶液的浓度应尽量与待测质粒中dNMP的浓度相近。

4.酶解质粒样品溶液的配制

将经过超声及酶解处理的质粒DNA样品，待其平衡0.5h，秤取50μL样品，向样品中添加与标准溶液中加入的等量的C、N同位素的LdAMP标记物，使质粒分子样品中dNMP含量与溶液中LdAMP标记物含量的比值接近1:1。具体的酶解体系的配置见表1。

5.高效液相色谱（HPLC）分离水解产物4种单核苷酸

色谱条件如上所述，具体的洗脱梯度见表2。将酶解后的样品于12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分析。

6.HPLC－MS定量

质谱条件扫描的参数见表3和4。将质谱测得的峰面积和标准品以及加入同位素的量根据公式（1）进行计算，得到的四种核苷酸的浓度，然后在根据质粒DNA的序列信息和公式（2）计算得到质粒DNA的浓度。质粒分子信息见表15。

表15pBAZS质粒分子单链DNA信息

7.数字PCR定量pBAZS质粒DNA

1)DNA模板的制备

将质粒DNA由紫外法测定的浓度根据公式从ng/μl换算成copy/μl，然后将DNA通过天平称量用TE_0.1稀释至1200copies/μl备用。

2）dPCR体系及扩增条件

dPCR扩增体系见表16，扩增条件同上述pNK603的条件（见表10）。

表16dPCR扩增体系

3）数据分析

通过空压机压至芯片将配制好的反应体系压到芯片内，然后运行PCR反应程序，最后通过软件分析得到最终结果。根据得到的阳性分子个数，利用公式（3）计算质粒DNA浓度。

二、实验结果

1.超声波处理质粒DNA的结果

pBAZS质粒DNA经过超声波处理（3个重复）后的结果见图17。由图可见，经过超声波处理后，所有的质粒DNA都破碎成了200bp以下的小片段，有利于下一步的酶解。

2.酶解和HPLC分离

样品的水解产物与标准品的色谱峰相比，除了四种核苷酸的色谱峰外，没有其它峰出现，所以可证明质粒DNA完全水解（图略）。

3.核苷酸浓度测定

根据公式（1）和测定吸收峰的峰面积，计算得到的核苷酸浓度见表17。由表中数据可知，该方法对4种核苷酸的测定的相对标准偏差<2%.

表17.四种核苷酸的浓度及不确定度

结果表明dCMP、dTMP、dGMP和dAMP四种核苷酸的浓度分别为7.58、7.05、8.32和7.33μg/g，相对标准偏差(RSD)为0.59%、1.13%、1.59%、1.47%。其中最低相对标准偏差为dCMP。这与其在质谱上的信号响应正相关。

4.质粒DNA浓度计算

根据质粒DNA分子量和上面计算的核苷酸浓度计算DNA的含量，见公式（2），结果见表18。由四种核苷酸的浓度根据公司（2）分别计算得到的质粒DNA浓度分别为30.30μg/g、30.59μg/g、29.43μg/g和30.93μg/g。四种核苷酸计算的平均值为30.31μg/g，与将四种核苷酸加和计算的结果（30.27μg/g）一致性很好。因此表明该方法测定的DNA浓度既可以根据分子量信息和核酸序列信息通过公式（2）计算得出，也可根据四种核苷酸浓度进行加和得出。可见采用同位素稀释质谱法测定核酸浓度时，序列信息不一定要知道，这也是该方法的优点之一。

表18.根据核苷酸浓度计算的质粒DNA浓度

5.dPCR测定质粒DNA浓度

对样品同时进行三个平行梯度稀释，每个梯度进行4个重复，测定结果如下表。三个重复结果在不确定度范围内一致性较好。

表19dPCR测定结果及不确定度

6.两种方法测定结果比较

为了验证同位素稀释质谱法测定的DNA结果是否准确，对同一样品进行了数字PCR方法测定。测定结果比较见图18，其中圆点表示超声波－同位素稀释质谱法结果，三角形表示数字PCR结果。两种方法测定结果一致性在其不确定度范围内很好，但测量同位素稀释质谱法的精密度要优于数字PCR方法，表明建立的超声波同位素稀释质谱法可用于基因组DNA等大片段的核酸的定量测定。

Claims (8)

1.一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解。

2.权利要求1所述的方法，所述前处理条件为：

1）超声波处理：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：25min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C；

2）所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为0.02-0.025U/μL；

3）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为100min以上。

3.权利要求1所述的方法，酶解时使用磷酸二酯酶工作缓冲液，所述缓冲液的组成为：Tris-HCl100mM，NH₄Ac10mM，Mg(Ac)₂300mM，其中Tris-HCl的pH为8.8。

4.权利要求1所述的方法，所述酶解质粒DNA样品体系组成为：磷酸二酯酶5.0μL，磷酸二酯酶工作缓冲液，超声处理的质粒DNA50μL，同位素标记核苷酸LdNMP混合液5.0μL。

5.权利要求4所述的方法，所述同位素标记核苷酸混合液的制备方法是，加入13-C、15－N同位素的核苷酸，使溶液中同位素标记核苷酸含量与使质粒分子样品中dNMP含量的比值接近1:1。

6.权利要求1所述的方法，所述高效液相色谱分析中，色谱条件为：流动相A：20mM醋酸铵，pH=3.5；流动相B：乙腈。

7.权利要求1～6中任一所述的方法，磷酸二酯酶活性浓度为0.022U/μL。

8.权利要求1～6中任一所述的方法，磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为120min。

Images