CN109234413A

CN109234413A - 一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器

Info

Publication number: CN109234413A
Application number: CN201811427150.5A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 罗云波; 黄昆仑; 田晶晶; 张媛; 贺晓云; 商颖
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明公开了一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器，该传感器的制备方法包括以下步骤：提取动物DNA；优化RPA反应的引物；优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；优化TdT反应条件。通过本发明的方法设计的无标记和可视化的用于灵敏的和选择性的检测猪源性成分的级联放大的功能核酸传感器，可以在较短的时间内完成对猪源性成分的特异性检测，具有可视化、高灵敏度和通用性强等优点。

Description

一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，国内外市场上的肉类掺假事件频发。在肉类掺假事件，使用廉价猪肉冒充昂贵的牛羊肉极为常见。这不但损害了消费者利益、破坏了贸易公平，更引发了食品安全与宗教信仰的担忧。

在打击肉及肉制品掺假行为中，聚合酶链式反应(PCR)技术因具有高效、准确、灵敏等优点，渐渐成为鉴定动物源性成分的主流方法。然而，该技术需要仪器配备高温-低温-中温的温度控制模块，这不仅使仪器成本高昂、不利于现场快速检测，而且只能依赖仪器配备的光学空间实现检测信号的输出、无法裸眼观察检测结果。

与PCR技术相比，恒温扩增技术能够在恒温状态下进行，不需要昂贵的温度控制设备，适合检测样品的现场快检。其中，重组酶聚合酶扩增(RPA)技术与其他恒温技术相比，如：环介导等温扩增、多重链置换扩增、基于螺旋的扩增，具有反应速度快、引物设计简单的优势，适合应用于食品安全的现场快速检测。但由于RPA技术的检测结果仍然无法通过裸眼观察，因此，迫切建立一种裸眼可视的、定量检测的RPA检测-传感技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法，包括以下步骤：

1、提取动物基因组DNA；

2、优化RPA反应的引物；

3、优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；

4、优化TdT反应条件；

5、选择DSN反应缓冲液并优化反应时间；

6、优化DSN的浓度并进行特异性分析。

作为本发明进一步的方案：步骤2中，开发与筛选RPA反应的方法为：设计2对引物，选出最适引物，2对引物的序列为：

Zhu-F1：TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGC

Zhu-R1：GTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTG

Zhu-F2：AGATCGGGAGCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA

Zhu-R2：TAGGGGCAATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG

作为本发明进一步的方案：步骤3中，优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度的方法为：将反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，经过RPA反应后，再进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过对比不同反应时间条带的亮度确定反应时间和引物浓度。

作为本发明进一步的方案：步骤4中，优化TdT反应条件的方法为：将反应时间梯度设置为：10min、20min、30min、40min，比较不同反应时间的延伸产物与TMB作用的显色结果和吸光值确定反应时间。

作为本发明进一步的方案：步骤5中，选择DSN反应缓冲液并优化反应时间的方法为：将RPA扩增产物用1U/mL的DSN在37℃温度下进行切割，反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析切割产物，确定反应缓冲液和反应时间。

作为本发明进一步的方案：步骤6中，优化DSN的浓度的方法为：将产物在不同DSN反应浓度进行TdT延伸20min，形成G-四联体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，通过凝胶电泳图条带亮度确定DSN的最优浓度。

作为本发明进一步的方案：基于上述方法制备的功能核酸传感器，用于食品现场安全评估。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本发明的方法设计的无标记和可视化的用于灵敏的和选择性的检测猪源性成分的级联放大的功能核酸传感器，可以在较短的时间内完成对猪源性成分的特异性检测，该级联放大的功能核酸传感器具有以下几个优点：

(1)双酶放大模块的设计：经过RPA扩增后，生成的猪源性成分DNA被DSN切割形成大量具有3’-OH的dsDNA，可作为TdT延伸的模板，通过双酶的作用将猪源性成分的含量转化为视觉信号输出，并伴随着检测信号的级联扩增；

(2)可视化：TdT在核酸尾部延伸后形成富G序列，然后诱导形成G-四联体结构与TMB结合可生成肉眼可见的蓝色实现定性分析，加入终止液后在450nm处进行吸光度的测量可以实现定量分析；

(3)检测时间短和高灵敏度：我们构建的检测平台可以在100min左右实现对猪源性成分的检测。并且猪源性成分浓度在0.1-100ng/μL范围内线性响应，可以实现0.05ng/μL的检测；

(4)通用性：我们构建的功能核酸传感器可以通过改变引物的序列，实现对其他动物源性成分的检测，其操作简单，检测时间短和肉眼可定性判断等优点，该功能核酸传感器具有良好的食品现场安全评估前景。

附图说明

图1为本发明中不同引物进行RPA扩增的电泳图；

图2为本发明中不同反应时间进行RPA扩增的电泳图；

图3为本发明中不同浓度引物进行RPA扩增的电泳图；

图4为本发明中不同反应温度进行RPA扩增的电泳图；

图5为本发明中将RPA扩增产物作为模板进行不同时间下TdT延伸的吸光值结果图；

图6为本发明中将RPA扩增产物稀释4倍后作为模板进行不同时间下TdT延伸的吸光值结果图；

图7为本发明中将RPA扩增产物稀释8倍后作为模板进行不同时间下TdT延伸的吸光值结果图；

图8为本发明中不同条件下进行DSN切割的电泳图；

图9为本发明中不同浓度DSN反应生成G-四联体的电泳图；

图10为本发明中对RDTG反应的特异性分析的吸光度结果图；

图11为本发明中检测猪源性成分的灵敏度分析的吸光度结果图；

图12为本发明的方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验准备：

1、DNA的提取

采用离心柱法对动物组织进行基因组DNA提取，具体为：

用液氮研磨成粉末，取50mg放入2mL离心管，待用。

向离心管的底部加入裂解液(0.2M氯化钠，3M盐酸胍，2％ CTAB,0.1M Tris,0.02MEDTA，0.1％β-巯基乙醇，1％ Triton x-100，pH5.5)450μL，将沉淀吹打悬浮，加入蛋白酶K30μl，充分颠倒均匀15s，66℃水浴40min.每隔10分钟左右颠倒混匀样品，充分混合。

向离心管中加入200uL无水乙醇，充分混匀15s。将管内液体和絮状沉淀全部转移到吸附柱中。将吸附柱放入收集管，12000×g,离心1min。倒掉收集管内的废液。

将吸附柱放入收集管。向吸附柱中加入500μL的漂洗液A(0.5M Nacl，5M盐酸胍)，12000×g,离心1min。倒掉收集管内的废液。

将吸附柱放入收集管。向吸附柱中加入500uL的漂洗液B(0.02M Tris)，12000×g,离心1min。倒掉收集管内的废液。

再次将吸附柱放入收集管。向吸附柱中加入500uL的漂洗液B(0.02M Tris)，12000×g,离心1min。倒掉收集管内的废液。

晾干柱子中的残余的漂洗液。

将吸附柱放入新的2mL离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加TE缓冲液50-150μL,室温放置5min。12000×g,离心2min.离心管中即为DNA溶液。可用于进一步的检测。

2、琼脂糖凝胶电泳

将2％的琼脂糖溶于TAE缓冲液里，微波加热至缓冲溶液，待缓冲液冷却到室温时加入适量EB，混匀后缓慢倒入固定的胶板中，待琼脂糖凝胶冷却后，拔掉梳齿，取出胶板于缓冲液中，将DNA上样缓冲液与样品混匀，点样，在120V电压下电泳25min；

3、非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳

首先取7.5mL的40％的丙烯酰胺，加入5mL的5×TBE缓冲液、0.016mL的四甲基乙二胺、0.18mL 10％的过硫酸铵和12.3mL的水混合，总体积为25mL，配制成12％的PAGE胶，迅速将待凝结的溶液用移液管转移到灌注凝胶的玻璃板中，立刻插入梳齿，放于37℃条件下1h，以确保完全聚合，凝胶后可转移到4℃保存，上样样品准备，2μL上样缓冲液与10μL的样品混合，在120V电压下凝胶电泳约2h，当电泳完成时，将凝胶从电泳仪中取出，小心去除玻璃上的凝胶，在1×TBE缓冲液中以1∶10000的比例稀释核酸凝胶染色剂，室温下将凝胶于上述溶液中避光摇床染色10min，随后换用1xTBE缓冲液清洗，重复两次，每次10min。

实施例一，重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA)引物的开发与筛选

RPA扩增是使用TwistAmp Basic试剂盒进行的，每个反应的体系为50μL，具体添加量如表1所示，将除去280mM乙酸镁的混合物加入有冻干酶粉的TwistAmp Basic反应管中，使管中粉末完全溶解。

表1，RPA凝胶检测反应体系

RPA反应体系	体积(μL)
		反应缓冲液	29.5
RPA-上游引物(10μM)	2.4
		RPA-下游引物(10μM)	2.4
DNA模板	1
		乙酸镁(280mM)	2.5
ddH<sub>2</sub>O	12.2
		总计	50

设计2对引物进行较优引物的筛选，选择相对较好的一对引物进行接下来的实验。RPA引物通常长30至35个核苷酸，扩增产物长度在500bp以内，长度为100-200bp较好。5’端应该避免长序列的G，3’端的G、C会对酶识别的稳定性更有益，并且吉布斯能应该低一些，5’、3’都应该在4kcal/mol左右。RPA的引物按照5碱基平移的方法进行筛选，选出最适引物进行后续试验。

表2，RPA扩增所用的引物序列

名称	编号	序列(5’—3’or N—C)
			Zhu-F1	SEQ ID No.1	TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGC
Zhu-R1	SEQ ID No.2	GTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTG
			Zhu-F2	SEQ ID No.3	AGATCGGGAGCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA
Zhu-R2	SEQ ID No.4	TAGGGGCAATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG

应注意的是加入乙酸镁后则立即开始RPA反应，因此最后分别向反应管中加入乙酸镁溶液，盖上盖子并充分混匀离心后，立即将管在37℃下在热循环仪中孵育30min，反应结束后使用2％琼脂糖凝胶电泳分析产物，反应结果如图1所示。

可以看出有两对引物成功实现了RPA扩增，在230bp左右有目的条带产生，其中第二对引物扩增有目的条带产生，故选择第二对引物作为RPA扩增引物进行后续实验。

实施例二，RPA反应时间和引物浓度的优化

将反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，经过RPA反应后，再进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过对比不同反应时间条带的亮度，选择合适的RPA反应时间进行后续实验。

图2示意了反应15min、25min和35min的凝胶电泳图，其中，泳道1、2反应时间为15min，泳道3、4反应时间为25min，泳道5、6反应时间为35min。能够看出随着反应时间的增加，条带亮度逐渐增加，表明RPA的产物量逐渐增加，15min就有产物生成，产物量足以进行后续实验，考虑到时间问题，最终选择反应时间为15min。

图3示意了不同反应浓度的凝胶电泳图，其中，泳道1到泳道7的引物浓度分别为：0.1μM、0.5μM、1μM、3μM、5μM、8μM、10μM。从图中可以看出随着引物浓度的增加，产物条带的亮度逐渐增加，说明RPA的产物量逐渐增加，为了提高反应的特异性，综合考虑，选择引物浓度为1μM作为反应的最终条件。

实施例三，RPA反应温度的优化

RPA是在单一温度条件下进行核酸扩增，不像PCR可以通过加热循环避免引物之间的结合产生非目的条带的扩增，特别是当处于无模板或低浓度模板的情况下，反应最终会产生非特定的信号，降低反应效率，影响实验结果。

图4示意了不同反应温度的凝胶电泳图，其中，泳道1、2反应温度为36℃，泳道3、4为39℃，泳道5、6反应温度为42℃。从图中可以看出反应温度的变化对产物量的影响不大，但对产物非特异性的条带的产生有的一定的影响，随着反应温度的增加，非特性杂带逐渐减少，故选择反应温度选择为42℃。

实施例四，TdT反应条件的优化

由于RPA扩增出的猪源性成分DNA片段大于3个碱基，可以作为TdT延伸的模板链。为了缩短传感器的整体反应时间，在反应温度为37℃的条件下，对TdT反应时间进行了优化，反应时间梯度设置为：10min、20min、30min、40min。通过比较不同反应时间的延伸产物与TMB作用的显色结果和吸光值的大小来选择合适的反应时间。同时，为了验证是否RPA反应体系中的酶是否会影响TdT的延伸效果，将RPA的扩增产物做不稀释、稀释4倍、稀释8倍三种处理，进行不同反应时间的比较。

G-四联体由于其特殊的结构，与Hemin孵育后有辣根过氧化物酶活性，可催化TMB显色。根据TMB的颜色变化可间接的反映反应出生成G-四联体的多少，图5、图6、图7示意了将RPA产物直接进行TdT延伸、将RPA产物稀释4倍后进行TdT延伸和将RPA产物稀释8倍后进行延伸的结果，比较不同反应时间下的吸光值的大小和与TMB反应后的比色响应。

可见，不经过稀释直接进行TdT延伸的实验组吸光值较低而且与TMB显色颜色较浅，而稀释后进行TdT的延伸的实验组，最终产物的颜色有明显变化，450nm测得的吸光度也有一定的提高，说明RPA反应中使用的酶可能对TdT的延长有抑制作用，由于反应时间为20min-40min,TMB显色后测得的吸光度差不大，故选择20min作为构建的功能核酸传感器TdT的延长时间。

实施例五，DSN反应缓冲液的选择和反应时间的优化

由于整个功能核酸传感器包含两种酶进行反应，为了减少DSN的反应缓冲液对TdT延伸产生影响，尝试使用TdT反应缓冲液代替DSN的反应缓冲液，验证使用不同的buffer是否对DSN切割作用有影响。

RPA扩增产物用1U/mL的DSN在37℃温度下进行切割，反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析切割产物，选择最适的反应缓冲液和反应时间进行接下来的试验。

经过预实验发现DSN会抑制TdT的延伸，因此为了使反应尽量多的生成G-四联体，对DSN的浓度进行优化，用不同浓度的DSN切割RPA产物，然后再用TdT进行延伸以生成G-四联体。DSN的反应浓度梯度设置为：0.1U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1U/mL。

图8为不同反应缓冲液和不同反应时间用DSN对RPA产物进行切割的结果图，其中，泳道1为没有进行DSN切割时的RPA产物，泳道2、泳道4和泳道6在DSN切割反应中使用的是TdT酶的反应缓冲液，泳道3、泳道5、泳道7使用的是DSN的反应缓冲液；泳道2和3的反应时间为15min、泳道4和5的反应时间为25min、泳道6和7的反应时间为35min。从图中能够看出反应15min就可以对RPA产物进行很好的切割，从切割效果来看，使用TdT的反应缓冲液进行DSN反应的结果更好，并且也可以减少由于反应缓冲液的不同而造成的TdT延伸的抑制。因此，选择15min作为DSN的切割时间，TdT的反应缓冲液作为DSN反应时所使用的缓冲液。

实施例六，DSN浓度的优化和特异性分析

图9示意了不同DSN反应浓度进行TdT延伸20min形成G-四联体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中泳道1-4的浓度分别为0.1U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1U/mL，能够看出DSN浓度为0.25U/mL时反应产物条带最亮，说明产物量最多。因此选择0.25U/mL作为DSN的反应浓度。

图10示意了不同来源肉制品在450nm波长的吸光值，可见猪源性成分在450nm处波长出的吸光值变化明显高于其他肉类，说明构建的功能核酸传感器检测猪源性成分具有较好的特异性。

实施例七，RDTG反应的灵敏度分析

在上述实施例确定的条件下，加入不同浓度的猪源性成分样品，经过DSN切割、TdT延伸和显色反应后进行了紫外-可见吸收光谱分析，测定波长范围为400-500nm(间隔为5nm)。

图11示意了不同浓度猪源性样品的吸光值，可见，吸光值随着猪源性样品浓度的增加而增加，根据标准曲线可知，猪源性成分可视化功能核酸传感器的检测浓度的线性范围为0.1-100ng/μL，线性方程为y＝0.1478x+0.2475，R²为0.9873，最低基因组浓度的检测限为0.05ng/μL。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器

<130> MP1830154Z

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagc 34

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt g 31

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatcgggag cctaaatctc ccctcaatgg ta 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taggggcaat gaaagaggca aatagatttt cg 32

Claims

1.一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取动物基因组DNA；

2)优化RPA反应的引物；

3)优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度；

4)优化TdT反应条件；

5)选择DSN反应缓冲液并优化反应时间；

6)优化DSN的浓度并进行特异性分析。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：步骤1中，优化RPA反应的方法为：设计2对引物，选出最适引物，2对引物的序列为：

Zhu-F1：TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGC

Zhu-R1：GTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTG

Zhu-F2：AGATCGGGAGCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA

Zhu-R2：TAGGGGCAATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG。

3.根据权利要求1所述的一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：步骤3中，优化RPA反应的反应时间、反应温度，确定引物浓度的方法为：将反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，经过RPA反应后，再进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过对比不同反应时间条带的亮度确定反应时间和引物浓度。

4.根据权利要求1所述的一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：步骤4中，优化TdT反应条件的方法为：将反应时间梯度设置为：10min、20min、30min、40min，比较不同反应时间的延伸产物与TMB作用的显色结果和吸光值确定反应时间。

5.根据权利要求1所述的一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：步骤5中，选择DSN反应缓冲液并优化反应时间的方法为：将RPA扩增产物用1U/mL的DSN在37℃温度下进行切割，反应时间梯度设置为：15min、25min、35min，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析切割产物，确定反应缓冲液和反应时间。

6.根据权利要求1所述的一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的制备方法，其特征在于：步骤6中，优化DSN的浓度的方法为：将产物在不同DSN反应浓度进行TdT延伸20min，形成G-四联体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，通过凝胶电泳图条带亮度确定DSN的最优浓度。

7.根据权利要求1所述的一种检测猪源性成分的功能核酸传感器的应用，其特征在于：经过所述方法制备的功能核酸传感器用于食品现场的安全评估。