CN102980878A - 一种质粒dna定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明首次提供了一种质粒DNA定量检测试剂盒，具有采用高准确度的超声波-同位素稀释质谱法准确定量的质粒DNA标准品，弥补了现有试剂盒不能对质粒DNA进行定量的缺点。本发明还提供了一种质粒DNA定量检测方法，分别测定不同浓度的质粒DNA标准品的荧光信号强度，绘制浓度—荧光信号强度标准曲线；然后测定待测质粒DNA样品荧光信号强度，根据所绘制标准曲线可准确计算出待测样品的DNA浓度。本方法和试剂盒首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准进行定量，灵敏度高，可检测低至1pg的DNA；线性范围广，可检测0.25ng/mL~1000ng/mL的质粒DNA；对标准质粒采用超声波-同位素稀释质谱方法定量，得到的量值不确定度低，准确度高。

Description

一种质粒DNA定量检测试剂盒

技术领域：

本发明属于生化分析领域，具体涉及一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

质粒DNA是游离于染色体外的小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。它通常编码一些酶基因，如产生抗生素、抗生素抗性、限制酶、修饰酶等有利于宿主的酶基因。由于它分子小、能够自主复制并且稳定遗传，因此是分子生物学、基因工程技术中常用的载体。在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对质粒DNA进行准确定量，如进行克隆文库构建时的酶切和连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA的浓度进行准确测定。因此对质粒DNA定量有着广泛的应用。

采用PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料法在对DNA进行定量时的局限性表现为，第一，方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，即？ng/ml，这个值一般是通过紫外吸收（OD260）确定的，该值也没有相关的不确定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准（48.5K）。有报道称：以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。

因为PicoGreen荧光染料法对质粒DNA定量需要具有准确量值的质粒DNA标准物质，而目前并没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此要研制质粒DNA标准品，必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。对质粒DNA进行绝对定量的方法有基于单分子扩增的数字PCR方法、有依赖于磷元素标准的电感耦合等立体发射光谱法。我们建立了一种基于核苷酸标准品的超声波-同位素质谱法，可对质粒DNA进行绝对定量，从而为PicoGreen荧光染料法提供DNA标准。

发明内容：

本发明的目的是提供一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。

本发明首次建立了质粒DNA荧光染料法定量检测方法，采用质粒DNA标准，利用PicoGreen法对质粒DNA进行准确定量，本发明人进行了如下研究工作：

1、质粒DNA浓度与荧光信号强度是否存在线性关系（见实施例1）

将构建的5k大小的质粒稀释成不同浓度的DNA样品，稀释后的质粒DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号。

结果发现：质粒DNA浓度与荧光信号成正比，线性相关系数为0.99。因此可以以荧光信号强度测算质粒DNA浓度。

本研究为确定本方法的可行性打下了基础。

2、不同分子量大小的DNA与荧光信号强度的线性关系差别（见实施例3）

选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，分别将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号。

结果发现：4种不同分子量的DNA，浓度与荧光信号均成正比，且线性相关性都很好，相关系数均>0.99。但不同分子量大小的DNA与荧光信号的线性关系（斜率）不同，分子量越大，直线的斜率越大。

以商业化试剂盒lambda DNA作为标准（48k）测定2k～10k的质粒DNA，结果偏差较大，具体见表2。

此研究结果表明，测定质粒DNA浓度应选择分子量差别不大的质粒DNA标准品。

3、研究了对质粒DNA定量的线性范围（见实施例2）

将质粒DNA稀释至0.01ng/mL~10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在0.25ng/mL~1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比。

此研究确定了荧光染料法定量检测DNA的浓度范围是0.25ng/mL~1000ng/mL。

3、研究了对质粒DNA的检测灵敏度（见实施例2）

由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为0.01ng/mL，加样量100μL，因此计算出该方法的灵敏度为1pg。

4、定量限（见实施例2）

根据最低定量的线性范围，定量限为25pg。

根据上述实验结果，本发明提供了一种质粒DNA荧光染料法定量检测方法，其特征为：

用不同浓度的质粒DNA标准品与PicoGreen荧光染料混合，分别测定荧光信号强度，绘制浓度—荧光信号强度标准曲线；然后将待测质粒DNA样品稀释至0.25ng/mL~1000ng/mL，与荧光染料混合后，测定荧光信号强度；根据所绘制标准曲线计算待测质粒DNA样品的DNA浓度。

待测质粒DNA的分子大小为2k～10k。

具体操作步骤如下：

1）配制合适浓度的荧光染料

用工作液稀释PicoGreen荧光染料至0.6~1.0μM浓度；

2）制备不同浓度的标准品检测液

用工作液对标准品进行梯度稀释，得到4～8个浓度的稀释液；

如浓度为1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL；

取每一种浓度的标准品稀释液100μL分别与100μL步骤1）得到的荧光染料混匀；

3）制备待测物检测稀释液

A将待测质粒DNA样品用紫外法测定大致浓度范围后，用工作液稀释至浓度为0.25ng/mL~1000ng/mL；

B取稀释好的样品100μL与100μL步骤1）得到的荧光染料混匀；

4）测定不同浓度标准品的荧光信号，绘制浓度—荧光信号强度曲线

A将上述不同浓度的标准品检测稀释液转移至同一个96孔酶标板上，利用酶标仪分别读取每种浓度标准品的荧光信号强度；设置酶标仪激发波长480nm，吸收波长为520nm；

B以标准品每种DNA浓度为横坐标，以相应的荧光信号值为纵坐标绘制“荧光信号值-DNA浓度”标准曲线；

5）测定待测物荧光信号

方法同步骤4）A；

6）计算待测样品浓度

将待测样品荧光信号值代入步骤4）B得到的标准曲线，得出待测样品的浓度。

以上方法中，所述工作液的成分是10mM Tris-HCl，含1mM EDTA，pH=8.0。

本发明用超声波－同位素稀释质谱方法验证了本方法的准确度（见实施例3）。

本方法的创新点是：

1、首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准对质粒样品进行定量；

2、灵敏度高：可检测低至1pg的DNA；

3、方法线性范围广：可检测0.25ng/mL～1000ng/mL的DNA，跨越4个数量级；

4、准确度高：首次采用高准确度的超声波-同位素稀释质谱法对标准质粒进行定量，得到的量值不确定度低，准确度高。

本发明还提供了一种质粒DNA荧光染料定量检测试剂盒，试剂盒中包括质粒DNA标准品，PicoGreen荧光染料和工作液，其特征为：

工作液成分为10mM Tris-HCl，含1mM EDTA，pH=8.0；

质粒DNA标准品为具有准确浓度定量值的环状质粒分子DNA，浓度范围是1ng/μL～300ng/μL

本发明中所用的质粒DNA标准品用超声波-酶解-同位素稀释质谱法确定量值，方法为：

将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量；

所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解，条件为：

1）超声波处理：强度：5，时间：25min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C；

2）所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为0.02-0.025U/μL；

3）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为100min以上。

本试剂盒的优点是：

1、弥补了现有商业化荧光染料试剂盒中不能对质量DNA进行定量的缺点；

2、灵敏度高：可检测低至1pg的DNA；

3、检测范围广：可检测0.25ng/mL～1000ng/mL的DNA，跨越4个数量级；

4、操作简便、需要的检测仪器设备常规；

5、标准品准确度高。

附图说明：

图1为质粒DNA浓度（0.25ng/mL～1000ng／mL)与PicoGreen荧光信号强度的关系；

图2为质粒DNA浓度（0.01ng/mL～10000ng／mL)与PicoGreen荧光信号的关系；

图3为PicoGreen荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围；

图4为PicoGreen荧光染料法对不同分子大小的DNA定量的线性相关性；

图5为超声波处理质粒pNK603的结果图；

图6为标准品色谱分离图；

图7为质粒经过超声和水解后样品的色谱分离图；

图8水解样品的总离子流图；

图9提取离子色谱图（(I)dCMP，(II)LdCMP，(III)dTMP，(IV)LdTMP，(V)dGMP，(VI)LdGMP，(VII)dAMP，(VIII)LdAMP）；

图10为两种方法（PicoGreen荧光染料法与超声波-同位素稀释质谱法）测定结果比较。

具体实施方式

实施例1质粒DNA与PicoGreen荧光信号的关系

一、实验目的：

探索质粒DNA浓度与PicoGreen荧光信号是否有线性关系

二、材料与方法：

1.质粒DNA pBAZS：通过在载体pEASY-T3上连接4个外源基因片断（扩增所用引物见表1）得到。

2.PicoGreen荧光染料：购自life technology公司。用1xTE按照1：200进行稀释。

3.将质粒DNA配置成10000ng/mL的保存浓度，然后用1xTE稀释至1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL。

4.取稀释好的DNA溶液0.1mL与0.1mL的稀释好的PicoGreen染料混合，转移至96孔酶标板。

5.将酶标板置于酶标仪上，选择激发波长480nm，发射波长520nm进行荧光信号的采集。

6.标准曲线的绘制：以质粒DNA浓度为横坐标，以荧光信号为纵坐标进行曲线绘制，所得到的标准曲线见图1。

三、实验结果：

由图1可知，质粒DNA与PicoGreen荧光染料结合后，DNA浓度与荧光信号成正比，线性相关系数为0.996。

四、实验结论

质粒DNA浓度与荧光强度具有线性关系，证明PicoGreen荧光染料法可以对质粒DNA进行定量。

其他的实例不用包括试验目的、结论等全部写么？

实施例2PicoGreen法对质粒DNA定量的线性范围及定量限和检测灵敏度的确定

一、材料与方法

1.将质粒DNA配置成10000ng/mL的保存浓度，然后用1xTE稀释至5000ng/mL、2500ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.05ng/mL、0.01ng/mL。

2.取稀释好的DNA溶液0.1mL与0.1mL的稀释好的PicoGreen染料混合，转移至96孔酶标板。其它操作同实施实例1中的5和6。

二、实验结果：

1.PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的线性范围

为了测定PicoGreen荧光染料法测定质粒定量的线性范围，将DNA进行了14个不同浓度梯度的稀释，所有DNA浓度与荧光信号的关系见图2，由图2可知，在实验的范围内荧光轻度与DNA浓度不完全成正比，当浓度超过1000ng/mL或0.25ng/mL时，荧光强度与DNA浓度已经不再是直线关系了。因此将浓度超过1000ng/mL和浓度低于0.25ng/mL的点去掉后所得到的即为PicoGreen对质粒DNA的定量线性范围，即0.25ng/mL~1000ng/mL，见图3。

2.PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的定量限

根据上述的线性范围，最低定量浓度0.25ng/mL，加样量为0.1mL，因此可计算出PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的定量限为25pg。

3.PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的检测灵敏度

由于可检测的最低信号值对应的浓度为0.01ng/mL，加样量为0.1mL，因此可计算出PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的检测限为1pg。

实施例3对不同分子大小DNA采用PicoGreen荧光染料法进行定量

一、实验目的：

研究市售检测试剂Lambda DNA是否可作为荧光染料法测定质粒DNA的标准品。

二、材料与方法：

1．选择不同分子大小的DNA：lambda基因组DNA，大小48502bp，购自TAKARA公司，9000bpDNA：采用EcoRI限制性内切酶将Lambda基因组DNA进行酶切，通过琼脂糖凝聚电泳回收纯化得到；pBAZS质粒DNA，如上所述。nosZPCR产物：以构建的质粒为模板，以引物nosZ-F/R扩增得到，具体的引物序列见表1。

表1引物序列

2．PicoGreen荧光染料：购自life technology公司。用1xTE按照1：200进行稀释。

3．将1中提到的四种不同分子大小的DNA配置成10000ng/mL的保存浓度，然后用1xTE稀释至2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、20ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL。

4．取稀释好的DNA溶液0.1mL与0.1mL的稀释好的PicoGreen染料混合，转移至96孔酶标板。其它操作同实例1中的5和6。

三、实验结果

1、PicoGreen荧光染料对不同分子大小的DNA定量的线性相关性

由图4和表2可知，PicoGreen对四种DNA样品的线性相关系数均>0.99，表明PicoGreen染料对四种不同大小的DNA定量各自的线性相关性都很好（图4，表1），但不同分子量大小的DNA与荧光染料结合率有差异，表现为相同浓度下，DNA分子量越大，与染料的结合率越高，荧光强度越强。具体体现在线性方程上：分子量越大，线性方程的斜率越大。

表2PicoGreen荧光染料对不同分子大小的DNA定量的线性方程及相关性

2、PicoGreen荧光染料法以Lambda基因组DNA为标准时对不同分子大小DNA定量差异

由表2可知，PicoGreen荧光染料法对不同分子大小的DNA定量的线性关系不同，因此如果选择LambdaDNA作为标准对质粒DNA进行定量，测定的结果会有偏差。具体的偏差见表3。由表3可知，如果以LambdaDNA作为标准对5k的质粒DNA进行定量，结果会平均偏低32%。因此如果对质粒DNA进行PicoGreen法定量，不能采用现有商业化试剂盒。

表3不同DNA样品以lambda为标准时在不同浓度下测定的结果偏差

四、实验结论

以上数据证明市售检测试剂Lambda DNA不适于为荧光染料法测定质粒DNA的标准品，开发质粒DNA检测试剂盒，应研制更为准确的标准品。

实施例4采用PicoGreen法以质粒DNA为标准对待测质粒样品进行定量

一、实验目的

1．用专利中的方法对待测质粒DNA样品进行测定，同时采用高准确度的超声波－同位素稀释质谱法对同一质粒进行测定，以此证明本专利方法的可行性和准确性。

二、材料与方法

2．待测质粒DNA分子大小3.3k，由中国计量科学研究院研制。

3．采用超声波-同位素稀释质谱法对待侧质粒进行定量

（1）超声波处理：采用声波聚焦超声波破碎仪，处理条件为强度：5；时间25min；上样量0.1mL；DNA浓度范围：10-50ng/ul。

（2）dNMP标准溶液的配制

将dNMP标准物质按照使用说明置于烘箱烘干，dAMP、dCMP、dGMP于80℃烘4h，dTMP于40℃烘4h。精确称量一定质量的dAMP、dTMP、dCMP、dGMP标准物质纯品，溶于一定体积的超纯水，配制成浓度为1mg/g的dNMP标准储备溶液（浓度计算时应考虑到标准物质的纯度）。同时精确称量一定质量的C、N标记的LdAMP、LdTMP、LdCMP、LdGMP同位素纯品，溶于一定体积的超纯水，配制成1mg/g的LdNMP标记物储备溶液（浓度计算时应考虑到同位素的纯度）。

根据质粒样品完全水解dNMP的大致浓度（由紫外分光光度法及序列分子量信息得到），取一定体积的dNMP标准物质储备液及LdNMP标记物储备液，分别稀释至所需浓度，将2种溶液按照浓度比约1:1均匀混合，配制工作标准溶液，且该加入同位素标记物的标准溶液的浓度应尽量与待测质粒中dNMP的浓度相近。

（3）酶解质粒样品溶液的配制

将经过超声及酶解处理的质粒DNA样品，待其平衡0.5h，称取100μL样品，向样品中添加与标准溶液中加入的等量的C、N同位素的LdAMP标记物，使质粒分子样品中dNMP含量与溶液中LdAMP标记物含量的比值接近1:1。

（4）高效液相色谱（HPLC）分离4种单核苷酸

将酶解后的样品于12000g离心2min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分析。流动相A：20mM醋酸铵，pH=3.5；流动相B：乙腈。进样量10μL，流速0.2mL/min。检测器：DAD，检测波长254nm。洗脱梯度见表4。

表4HPLC洗脱梯度

（5）三重串联四级杆质谱测定4种单核苷酸条件

分别使用4种单核苷酸的标准物质（中国计量科学研究院）及其对应的C、N标记同位素（Sigma Aldrich.Inc.）对三重串联四级杆质谱（QqQ）条件进行优化。根据HPLC的酸性环境，采用正离子模式，电喷雾离子源（ESI）条件见表5。

表5QqQ质谱ESI源参数

对于4种单核苷酸及其对应同位素的定量检测，QqQ需要优化的主要参数为碎裂电压（Fragmentor）以及碰撞能量（Collision Energy，CE），确定各种单核苷酸及其同位素的母离子与子离子的质荷比（m/z），进而利用多重反应监测（MRM）模式下对每种单核苷酸及其同位素在碰撞前母离子、以及碰撞碎裂后特定大小的碎裂子离子的精确捕捉，确定不同单核苷酸及其同位素的精确含量，进而实现对目标质粒分子DNA的定量。

（6）同位素稀释法测定质粒DNA样品的质量浓度

a.质粒DNA中4种核苷酸的质量浓度计算

将经前处理的待测质粒样品分为3组，每组3个平行待测样，进行IDMS测定。采用以下公式计算样品中4种核苷酸的浓度：

$w_X=w_Z\&CenterDot;\frac{m_Y\&times;m_Z}{m_X\&times;m_{Y,c}}\&CenterDot;\frac{R_B}{R_{\mathrm{BC}}}\&CenterDot;P\&CenterDot;D---\left(1\right)$

其中，w_X：质粒样品中选定的dNMP的含量(μg/g)；

w_z：标准溶液中dNMP的质量分数；

R_B：样品中的dNMP与相应标记的LdNMP峰面积比；

R_BC’：标准溶液中的dNMP与相应标记的LdNMP峰面积比；

m_Y：样品中加入的LdNMP的量；

m_Yc：标准溶液中加入LdNMP的质量(g)；

m_x：样品的质量(g)；

m_z：标准溶液中加入dNMP的质量(g)；

P：dNMP标准物质的纯度；

D：水解效率。

b.质粒分子的DNA浓度计算

根据（1）计算得到了样品中的4种单核苷酸的质量浓度信息，根据质粒序列信息及已得到的dNMP质量浓度，可以换算为质粒DNA的质量浓度，计算公式如下：

$w_{\mathrm{plasmid}}=\frac{{\mathrm{dw}}_x\&times;M_{\mathrm{plasmid}}}{M_{\mathrm{dNMP}}\&times;A}---\left(2\right)$

其中，w_x：质粒分子DNA的质量浓度(μg/g)；

M_plasmid：质粒分子的相对分子质量；

M_dNMP：选取的dNMP的相对分子质量；

A：对应dNMP在质粒分子中的个数；

d：酶解等实验操作引起的稀释因子。

3.对待侧质粒样品采用PicoGreen法进行定量

样品稀释：将待测样品用1xTE稀释至1000ng/mL左右，取0.1mL与0.1mL荧光染料混匀。

标准品稀释：将试剂盒中标准质粒进行梯度稀释，稀释的浓度为1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、20ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL，取0.1mL与0.1mL荧光染料混匀。

荧光信号采集：将混合好的待测样品与标准品转移至96孔酶标板进行荧光信号采集，具体操作同实例1。

标准曲线的绘制：以标准品DNA浓度为横坐标，以荧光信号为纵坐标进行曲线绘制，待测DNA对应荧光信号和标准曲线见图4。

待测样品浓度：根据标准曲线线性方程和待测样品荧光信号值计算待测样品浓度。

三、实验结果

1、PicoGreen荧光染料法测定结果：采用该方法进行3次重复测定，标准曲线产生的线性方程为:y=22.95x-576.4。经5次重复所测得样品的荧光信号值分别为17436、17141,、17297、17545、17665。根据方程计算所得浓度的平均值为：784ng/mL，该值乘以稀释倍数（49.9），得到原始样品的浓度为39.1ng/μL，测量结果的相对标准偏差为1%，DNA标准品引入的不确定1.5%，标准曲线引入的不确定度1.8%，合成相对不确定度为2.6%，扩展不确定度为5.2%。

表6PicoGreen荧光染料法测定质粒pNK603结果

2、超声波-同位素稀释质谱测定结果

1）超声波处理质粒DNA的结果

pNK603质粒DNA经过超声波处理（9个重复）后的结果见图5。由图可见，经过超声波处理后，所有的质粒DNA都破碎成了200bp以下的小片段，有利于下一步的酶解。

2）酶解和HPLC分离

标准品的HPLC分离图见图6，经过超声波处理后酶解的样品色谱图见图7，样品的水解产物与标准品的色谱峰相比，除了四种核苷酸的色谱峰外，没有其它峰出现，所以可证明质粒DNA完全水解。

3）质谱检测

根据上述条件对水解产物四种核苷酸进行检测，得到的总离子流色谱图见图8，由图可知，四种核苷酸分离效果很好，彼此间不存在信号干扰，有利于后续的定量分析。提取离子色谱图见图9，每个子离子的信号强度均为最大，从而保证了定量的准确性。

4）核苷酸浓度测定

根据公式（1）和测定吸收峰的峰面积，计算得到的核苷酸浓度见表5。由表中数据可知，该方法对4种核苷酸的测定的相对标准偏差<2%.

表5四种核苷酸的浓度及不确定度

结果表明dCMP、dTMP、dGMP和dAMP四种核苷酸的浓度分别为9.20、9.16、10.50和9.58μg/g，相对标准偏差(RSD)为1.54%、1.74%、1.04%、0.94%。其中最低相对标准偏差为dAMP。

5）质粒DNA浓度计算

根据质粒DNA分子量和上面计算的核苷酸浓度计算DNA的含量，见公式（2），结果见表12。由四种核苷酸的浓度根据公司（2）分别计算得到的质粒DNA浓度分别为36.80μg/g、39.73μg/g、37.18μg/g和40.429μg/g。四种核苷酸计算的平均值及扩展不确定度为（38.53±0.89）μg/g，与将四种核苷酸加和计算的结果（（38.44±0.88）μg/g）一致性很好。因此表明该方法测定的DNA浓度既可以根据分子量信息和核酸序列信息通过公式（2）计算得出，也可根据四种核苷酸浓度进行加和得出。

表6.根据核苷酸浓度计算的质粒DNA浓度

经过计算最终得到的质粒DNA浓度为38.5ng/μL±0.89ng/μL。

两种方法的可比性：将两种方法得到的结果及不确定度进行比较分析，见图10。可见两种方法测定结果在95%的置信水平上，一致性很好。因此采用标准质粒作为PicoGreen荧光染料法的标准，对质粒DNA进行定量测定，结果重复性好，准确度高。

Claims (6)

1.一种质粒DNA定量检测试剂盒，试剂盒中具有标准品、工作液和染料，其特征为：

1）所述标准品为具有准确DNA浓度定量值的环状质粒分子DNA，浓度范围是1ng/μL～300ng/μL；

2）所述工作液成分为10mM Tris-HCl，含1mM EDTA，pH=8.0；

3）所述染料是PicoGreen荧光染料。

2.权利要求1所述的试剂盒，所述标准品浓度的定量方法为：将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解。

3.权利要求2所述的试剂盒，所述前处理条件为：

1）超声波处理：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：25min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C；

2）所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为0.02-0.025U/μL；

3）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为100min以上。

4.一种质粒DNA荧光染料法定量检测方法，其特征为：

用不同浓度的质粒DNA标准品与PicoGreen荧光染料混合，分别测定荧光信号强度，绘制浓度—荧光信号强度标准曲线；然后将待测质粒DNA样品稀释至0.25ng/mL~1000ng/mL，与荧光染料混合后，测定荧光信号强度；根据所绘制的标准曲线计算待测质粒DNA样品的DNA浓度。

5.权利要求4所述的方法，具体操作步骤如下：

1）配制合适浓度的荧光染料

用工作液稀释PicoGreen荧光染料至0.6~1.0μM浓度；

2）制备不同浓度的标准品检测液

用工作液对标准品进行梯度稀释，得到4～8个浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液100μL分别与100μL步骤1）得到的荧光染料混匀；

3）制备待测物检测稀释液

A将待测质粒DNA样品用紫外法测定大致浓度范围后，用工作液稀释至浓度为0.25ng/mL～1000ng/mL；

B取稀释好的样品100μL与100μL步骤1）得到的荧光染料混匀；

4）测定不同浓度标准品的荧光信号，绘制浓度—荧光信号强度曲线

A将上述不同浓度的标准品检测稀释液转移至同一个96孔酶标板上，用酶标仪分别读取每种浓度标准品的荧光信号强度；

B以标准品每种DNA浓度为横坐标，以相应的荧光信号值为纵坐标绘制“荧光信号值—DNA浓度”标准曲线；

5）测定待测物荧光信号

方法同步骤4）A；

6）计算待测样品浓度

将待测样品荧光信号值代入步骤4）B得到的标准曲线，得出待测样品的浓度；

所述工作液的成分是10mM Tris-HCl，含1mM EDTA，pH=8.0。

6.权利要求5所述的方法，测定荧光信号时，设置酶标仪激发波长480nm，吸收波长为520nm。

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