KR101198655B1 - 배추 원산지 판별용 바이오마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배추 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 원산지 별 배추 대사체의 발현 빈도를 NMR 분석을 통해 원산지 별 감식 바이오마커를 선정함으로써 간단하고, 신속하며 높은 정확도로 배추 원산지를 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 배추 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 원산지 별 배추 대사체의 발현 빈도를 NMR 분석을 통해 원산지 별 감식 바이오마커를 선정함으로써 간단하고, 신속하며 높은 정확도로 배추 원산지를 판별할 수 있는 배추 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것이다.
최근 미국산 쇠고기 전면 수입이 사회문제로 이슈화되었고, 이에 대하여 정부에서는 시중에서 유통되는 모든 농축산물에 대한 원산지 표시를 의무화하고 단속을 강화하는 일련의 조치를 강력히 시행하고 있지만, 상표를 제거한 농축산물의 원산지를 단속하는 것은 현실적으로 매우 어려운 문제이다. 이에 농축산물을 재배하는 농가의 피해를 최소화하고, 원산지를 속여 파는 상행위를 근절하기 위해서는 국민적 관심이 높은 농축산물의 원산지를 과학적으로 판별할 수 있는 방법을 개발하는 것이 무엇보다도 시급하다. 그러나 농축산물의 원산지 판별은 자국의 수출입물품에 대한 통제에 보다 객관적인 기준인 "과학적 판별 방법의 확보"가 필수적임에도 아직 국내에서는 이에 대한 체계적인 연구가 거의 수행되지 못하였다. 무엇보다도 국제적으로 인정될 수 있는 표준화된 과학적인 원산지 판별법의 확립이 필요하며 이는 국가의 과학적 위상을 나타낼 수 있는 중요한 수단이다.
정확하고 객관적인 원산지 판별방법을 확립하고 있지 못하면 우리 농축산물에 대한 국제적인 보호망을 확보할 수 없고 경제적으로도 큰 타격을 입게 된다. 국제적으로 인정되는 원산지 판별법의 확보는 경제적으로 보다 좋은 품질의 제품을 확보할 수 있으며 통상에 따른 잡음을 없앨 수 있다. 우리나라와 FTA가 성립되지 않은 인접국가에서 생산된 물품이 위장 수입되는 것을 막지 못하면 우리나라의 수출기업은 보호되지 못하고, 외국의 불법 수출회사는 적발하지 못하므로 대무역 손실이 크게 되며 FTA의 경제적 이익을 취할 수 없다. 원산지 판별법을 완성할 경우 FTA 상대국과의 기술적 논쟁에서도 앞설 수 있으며 차후 협상이 진행될 일본, 중국 등 최대 교역국간의 FTA 협상에서도 우위를 확보할 수 있게 된다.
십자화과 채소인 배추는 그 재배 면적이 2004년 기준 44,623 ha로 국내 전체 채소 재배 면적 341,000 ha의 13%를 점유하고 있고 생산 수입 판매 신고된 708개 품종이 유통되고 있어 종자 산업에서 차지하는 비중이 큰 중요한 작물이다.
배추에 대한 분자 유전학적 연구 동향을 살펴보면, 외국의 경우 국제 브라시카 게놈 프로젝트(Brassica genome project)가 수행되어 유전자 지도, 분자 표지 정보 등을 D/B화하여 이를 공개하고 있다. 국내에서도 농촌 진흥청 농업생명공학원에서는 배추 게놈 프로젝트를 수행하면서 여러 가지 종류의 분자 표지를 개발하여 고밀도 유전자 지도 작성에 활용하고 있다. 국립종자원의 경우 2002년도에 AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 분석 방법을 이용하여 배추 59개 품종에 대한 품종 식별 방법을 제시한 바 있다. 그러나, AFLP 분석은 마커의 분리 양상이 우성(dominant)을 나타내기 때문에 배추 F1 품종의 식별에 적합하지 않은 것으로 보고되고 있다. 또한, '55POV에서도 AFLP 마커의 경우 분석의 반복 재현성 등의 문제로 인해 SSR과 SNP 마커의 활용을 제안하고 있다.
상기와 같이 분자 표지를 이용한 농축산물의 품종 식별에 대한 대안으로서 세포 또는 조직내의 대사체의 거동, 분비 변화 등을 체계적으로 확인?정량하고, 그 결과로부터 대사체군을 다양한 생리?병리적 상태와 연관 지어 대사체 네트워크를 다시 해석하는 대사체학이 주목을 받고 있다. 최근 대사체학 연구는 한약재, 곡류 등의 농축산물의 원산지를 판별하는 데에도 적용되고 있다. 대사체 연구를 위해서는 대사체 변화를 검출?확인하기 위한 초정밀분석기술과 그 결과를 다시 생체의 생리적 상태와 연관 지어 해석하기 위한 통계분석이 기초가 된다. 현재 대사체학에 가장 많이 이용되고 있는 mass spectrometry(MS)에 비해 nuclear magnetic resonance(NMR)은 단시간 내에 시료 안의 대사체에 대한 정보를 한번에 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있어 다른 분석 장비들에 비해 감도가 낮다는 단점에도 불구하고 대사체학에서 유용한 분석 장비가 된다.
본 발명의 목적은 NMR을 이용한 배추의 대사체 분석을 통하여 한국산 배추와 수입산 배추의 원산지에 따른 차이를 판별할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 배추 원산지 판별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린, 구연산, 푸마르산, 능금산, 숙신산, 과당, 포도당 및 자당으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 배추 원산지 판별용 바이오마커를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배추 원산지 판별용 바이오마커를 포함하는 배추 원산지 판별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배추 원산지 판별용 바이오마커를 이용하여 배추 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 DNA 분석이나 표준물질 없이 배추의 대사체를 분석하여 원산지를 정확하게 판별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 대사체 분석을 통한 배추 원산지 판별을 위한 배추 추출과정을 나타낸 것이다.
도 2은 메탄올과 0.2M 포스페이트를 이용하여 추출한 샘플을 NMR로 분석하여 나온 대표적인 스펙트럼이다(A:중국산 배추, B:한국산 배추).
도 3는 도 2의 스펙트럼을 수치화 하여 PCA score plot(A)와 PCA loading plot(B)를 한 것이다.
도 4는 각 대사체 농도를 OPLS-DA score plot(A)와 S-Plot(B)를 나타낸 것이다.
도 5은 각 대사체의 농도를 정량하여 나타낸 그래프이다
도 2은 메탄올과 0.2M 포스페이트를 이용하여 추출한 샘플을 NMR로 분석하여 나온 대표적인 스펙트럼이다(A:중국산 배추, B:한국산 배추).
도 3는 도 2의 스펙트럼을 수치화 하여 PCA score plot(A)와 PCA loading plot(B)를 한 것이다.
도 4는 각 대사체 농도를 OPLS-DA score plot(A)와 S-Plot(B)를 나타낸 것이다.
도 5은 각 대사체의 농도를 정량하여 나타낸 그래프이다
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린, 구연산, 푸마르산, 능금산, 숙신산, 과당, 포도당 및 자당으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 배추 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명의 배추 원산지 판별용 바이오마커는 원산지별 배추의 대사체의 발현 빈도 차이를 이용하여 배추의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 대사체의 발현 빈도는 구체적으로, 한국산 및 중국산에서 가장 많이 발현되는 것으로 이해되어야 한다.
상기 배추 원산지 판별용 바이오마커로 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린, 구연산, 푸마르산, 능금산, 숙신산, 과당, 포도당, 또는 자당 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 한국산 배추의 경우, 과당, 포도당, 또는 자당 등이 다량 발현되는 특징이 있다.
또한, 중국산 배추의 경우, 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린, 구연산, 푸마르산, 능금산, 또는 숙신산 등이 다량 발현되는 특징이 있다.
따라서, 이들을 원산지 판별을 위한 바이오마커로 사용하여 배추의 원산지를 판별할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배추 원산지 판별용 바이오마커를 포함하는 배추 원산지 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 배추 원산지 판별용 키트는 하나 이상의 바이오마커를 포함하여 시료의 대사체를 정량 분석함으로써 배추의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트는 시료를 담지할 수 있는 통상의 웰 형태의 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다.
상기 웰 내에는 시료 및 하나 이상의 바이오마커를 흡수할 수 있는 다공성 지지체를 포함할 수 있다.
상기 지지체는 배추 대사체 추출물의 첨가를 대비하여 내부 바이오마커를 미리 결정된 농도로 포함하고 있으며, 아울러 각 시료를 고정할 수 있다. 또한, 지지체의 다공성은 시료 분석 시 첨가되는 추출 용매에 최대한 노출되게 할 수 있다.
따라서, 상기 지지체는 높은 수준의 다공도를 가진 임의의 지지체일 수 있으며, 이러한 지지체는 종래 기술분야에서 공지되어 있으며, 또는 상업적으로 구입 가능하다.
구체적으로, 고형 지지체일 수 있다. 보다 구체적으로는 액체에 대한 흡수성 물질로 이루어져 있다. 상기 흡수성 물질은 흡착제 또는 흡착성 물질일 수 있다.
상기 액체 흡수성 물질은 바이오마커의 용액과 분석용 후속 시료가 기공을 통해 일정하게 흡착 또는 흡수되게 한다.
상기 흡수성 물질로 셀룰로오스와 같은 카보하이드레이트 물질, 유리 섬유, 유리 비드, 폴리아크릴아미드 젤, 다공성 플라스틱 불활성 폴리머 및 다공성 흑연 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 아가로오스, 아가, 셀룰로오스, 덱스트란, 키토산 또는 곤약과 같은 카보하이드레이트 물질이나 그 유도체, 카나기난, 젤란 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 가장 구체적으로는, 셀룰로오스 또는 유리 섬유일 수 있다.
본 발명의 키트에 포함된 바이오마커는 시료에 존재하는 대사체의 양을 정량하기 위해 유사 또는 동일한 유사체에 대한 비교로 사용되는, 양을 알고 있는 절대량의 비교물질인 것으로 이해할 수 있다. 상기 바이오마커는 시료의 대사체와의 적절한 구별을 위해 동위원소로 표지될 수 있다.
상기 바이오마커의 종류는 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 키트에 사용할 수 있는 시료는 배추 원산지별 또는 부위별 대사체 추출물로서, 액체 시료의 형태로 키트에 제공될 수 있다.
상기 대사체 추출물은 메탄올 및 포스페이트 완충용액의 혼합용매에서 배추를 균질화하여 얻을 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 마이크로타이터 플레이트는 분석물을 배출하기 위한 필터 및 배출구 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이들의 배치, 배출방법 등은 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 조정 가능하다.
또한, 본 발명의 키트는 통상적으로 분석장치와 조합하여 대사체 범위를 정량 표적 분석하기 위하여 여러 가지 대사체를 준비할 수 있는 기구에 포함된 시약, 용매, 소프트웨어 시스템 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 배추 원산지 판별용 바이오마커를 이용하여 배추 원산지를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배추 원산지를 판별하는 방법은
배추 시료에서 대사체를 추출하는 단계;
상기 추출된 대사체 및 배추 원산지 판별용 바이오마커를 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉에 따른 이온 세기의 증가를 측정하여 원산지를 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배추 원산지를 판별하는 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 배추 시료에서 대사체를 추출하는 단계이다.
상기 대사체의 추출방법은 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 용매추출이 좋다.
상기 용매는 배추의 대사체를 용해할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지는 않는다. 예를 들어, 상기 용매로, 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올; 아세톤; 트리플루오로에탄올; 테트라하이드로퓨란; 디클로로메탄; 포스페이트; 및 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
상기 혼합용매는 대사체의 추출 범위를 넓게 하기 위해 메탄올 및 포스페이트 완충용액을 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 대사체의 추출 범위를 보다 넓게 하기 위해 상기 용매 내에서 배추 시료를 균질화하는 과정을 추가적으로 실시할 수 있다.
제2단계는 상기 추출된 대사체 및 바이오마커를 접촉시키는 단계이다.
상기 접촉은 동위원소 등으로 표지된 본 발명의 바이오마커를 포함하는 마이크로타이터 플레이트 내에서 이루어질 수 있다.
제3단계는 상기 접촉에 따른 이온 세기의 증가를 측정하여 원산지를 판정하는 단계이다.
표적 대사체의 농도를 계산하기 위하여 적절한 바이오마커와 함께 수득되는 이온 세기를 사용한다. 바이오마커는 특징적인 하나의 이온 쌍(또는 수개의 이온 쌍)을 이용하여 식별되며, 수득되는 이온 세기는 바이오마커의 알고 있는 농도와 관련 있어 상응하는 표적 대사체의 정량화가 가능하다. 표적 대사체는 사전에 공지되어 있으며, 미리-주석을 달아둘 수 있다. 따라서, 검출 및 정량된 대사체에는 이미 주석이 달려, 빠르고 직접적인 해석이 가능하다.
표적 대사체의 질량 측정은 이온 종들을 구별하기 위해 MSMS 분석이 가능한 질량 측정기를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 결과로부터 대사체의 정량분석에 의한 이온 세기의 증가를 비교하여 배추의 원산지를 판별할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 배추 원산지 판별용 바이오 마커 검출
중국 배추와 한국 배추에 대한 바이오 마커를 판별하기 위해 중국에서 재배된 배추 50개, 한국에서 재배된 배추 49개 총 99개를 확보하였다. 각 샘플은 건조시킨 후 -80℃에 보관하였다.
건조 된 배추샘플은 액체질소를 이용하여 가루상태로 만들었다. 배추 가루를 2.0㎖ 튜브에 100㎎씩 넣고, methanol-d4 350㎕와 0.05% DSS(sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate)와 0.2M 포스페이트(pH7.0)를 D2O에 녹인 완충용액 350㎕를 넣었다. 15분 동안 초음파 처리를 하고, 4℃에서 13,000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액 600㎕를 취하여 NMR 분석을 실시하였다.
NMR 장비는 Varian Inova-600MHz NMR Spectrometer(Varian Inc., Palo Alto, CA)의 triple resonance 5-mm HCN salt tolerant cold probe를 이용하였다. Noesypresat pulse sequence를 이용하여 물 피크를 죽이고, spectral width 8445.9Hz, data point 67568K, acquisition time 4sec, mixing time 0.1sec, number of transient 32 조건에서 스펙트럼을 얻었다.
스펙트럼의 표준물질은 DSS로 하였고, 0ppm으로 보정하였다. 분석방법은 대사체 프로파일링(metabolic profiling)과 표적 분석(target analysis) 두 가지 방법으로 행하였다. 대사체 프로파일링 방법은 스펙트럼의 변수와 피크의 위치 변화의 영향을 줄이기 위해 NMR Suite 6.0 software(Chenomx Inc. Edmonton, Canada)를 이용하여 베이스 라인(base line)을 맞춘 후 DSS, 메탄올과 물을 제외하고, 0.001ppm으로 binning을 하였다. Binning data는 MATLAB (R2008a, The Mathworks, Inc., Matick, MA)로 정렬하고, SIMCA-P+ version 12.0(Umetrics AB, Umea, Sweden)를 이용하여 다변량 분석을 하였다.
표적 분석은 각 대사체의 정량정성 하는 분석법으로 Chenomx NMR Suite 6.0 software을 이용하여 프로파일링 한다. 표준물질인 DSS의 피크 면적을 기준으로 각 대사체의 농도를 확인한다. 이 방법을 통해 모든 스펙트럼을 프로파일링 하였고, 결과 데이터는 SIMCA-P+ version 12.0(Umetrics AB, Umea, Sweden)와 GraphPad Prism 5.01 software를 이용하여 unpaired t-test를 하였다.
<실험예 1> 배추 NMR spectroscopy
한국과 중국에서 재배된 배추들의 대표적인 스펙트럼은 도 2에 도시하였다. Spiking 실험이나 문헌들을 사용하여 대사체를 확인하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 중국산 배추는 2-3ppm 구간 피크가, 한국산 배추는 3-4ppm에서 피크가 높게 나타났다. 이외에도 부분적으로 피크가 차이 나는 구간이 있었다.
<실험예 2> NMR을 이용한 원산지 판별 바이오마커의 확인
중국 배추와 한국 배추만의 바이오마커 물질을 확인하기 위해 주성분 분석(Principal component analysis, PCA)을 실시하였다.
도 3의 Score plot에서 나타나듯이 나라별로 샘플이 모이는 것을 볼 수 있다. 그리고 loading plot을 사용하여 차이 나는 대사체를 확인하였다.
Chenomx NMR Suite 6.0 software를 이용하여 각 대사체 정량 값을 구하였다. 정량 값은 직교 최소자승 판별 분석(orthogonal partial least-squares discriminant analysis, OPLS-DA)과 S-Plot(Similarity Plot)을 수행하였다.
도 4의 Score plot에서 대사체 농도에 의해 나라별로 샘플이 모이는 것을 확인하였다.
그리고, S-Plot 한 결과 Corr(p,X)>0.5, Cov(p,X)>0.05에 해당하는 대사체가 14개 인 것으로 확인되었다.
*** : P <0.005
한국 배추와 중국 배추의 대사체들은 unpaired t-test을 통해 정량 분석하였다. 16개 대사체들이 유의하다는 결과가 나타났다.
아미노산 종류 인 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린은 중국 배추에서 농도가 높은 것으로 나타났다. 유기산 종류 인 구연산, 푸마르산, 능금산, 숙신산은 중국 배추에서 농도가 높게 나타났다. 당 종류인 과당, 포도당, 자당은 한국 배추에서 농도가 높게 나타났다.
Claims (8)
- 한국산 및 중국산 배추의 원산지별로 발현량에서 차이를 나타내는 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린, 구연산, 푸마르산, 능금산, 숙신산, 과당, 포도당 및 자당으로 이루어지고,
상기 과당, 포도당 및 자당의 발현량은 중국산 배추와 비교하여 한국산 배추에서 증가하며,
상기 4-아미노부틸레이트, 아스파라긴, 아스파라진산, 글루타민, 이소류신, 류신, 트레오닌, 타이로신, 발린, 구연산, 푸마르산, 능금산 및 숙신산의 발현량은 한국산 배추와 비교하여 중국산 배추에서 증가하는 특징이 있는, 배추 원산지 판별용 바이오마커 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 배추 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 포함하는 배추 원산지 판별용 키트.
- 배추 시료에서 추출된 대사체와 제1항의 배추 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉에 따른 이온 세기의 증가를 측정하여 원산지를 판정하는 단계를 포함하는 배추 원산지를 판별하는 방법.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
대사체는 메탄올 및 포스페이트 완충용액의 혼합용매에서 배추를 균질화하여 추출하는 배추 원산지를 판별하는 방법.
- 제5항에 있어서,
바이오마커는 동위원소로 표지되어 있는 배추 원산지를 판별하는 방법.
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