KR101198654B1 - 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 원산지 별 쇠고기 대사체의 발현 빈도를 NMR 분석을 통해 원산지 별 감식 바이오마커를 선정함으로써 간단하고, 신속하며 높은 정확도로 쇠고기 원산지를 판별할 수 있다.
쇠고기, 대사체, NMR 분석, 원산지 판별, 바이오마커
Description
본 발명은 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 원산지 별 쇠고기 대사체의 발현 빈도를 NMR 분석을 통해 원산지 별 감식 바이오마커를 선정함으로써 간단하고, 신속하며 높은 정확도로 쇠고기 원산지를 판별할 수 있는 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것이다.
최근 미국산 쇠고기 전면 수입이 사회문제로 이슈화되었고, 이에 대하여 정부에서는 시중에서 유통되는 모든 쇠고기에 대한 원산지 표시를 의무화하고 단속을 강화하는 일련의 조치를 강력히 시행하고 있지만, 상표를 제거한 쇠고기의 원산지를 단속하는 것은 현실적으로 매우 어려운 문제이다. 이에 한우를 사육하는 농가의 피해를 최소화하고, 원산지를 속여 파는 상행위를 근절하기 위해서는 국민적 관심이 높은 농축산물의 원산지를 과학적으로 판별할 수 있는 방법을 개발하는 것이 무엇보다도 시급하다. 그러나 농축산물의 원산지 판별은 자국의 수출입물품에 대한 통제에 보다 객관적인 기준인 "과학적 판별 방법의 확보"가 필수적임에도 아직 국내에서는 이에 대한 체계적인 연구가 거의 수행되지 못하였다. 무엇보다도 국제적으로 인정될 수 있는 표준화된 과학적인 원산지 판별법의 확립이 필요하며 이는 국가의 과학적 위상을 나타낼 수 있는 중요한 수단이다.
정확하고 객관적인 원산지 판별방법을 확립하고 있지 못하면 우리 농축산물에 대한 국제적인 보호망을 확보할 수 없고 경제적으로도 큰 타격을 입게 된다. 국제적으로 인정되는 원산지 판별법의 확보는 경제적으로 보다 좋은 품질의 제품을 확보할 수 있으며 통상에 따른 잡음을 없앨 수 있다. 우리나라와 FTA가 성립되지 않은 인접국가에서 생산된 물품이 위장 수입되는 것을 막지 못하면 우리나라의 수출기업은 보호되지 못하고, 외국의 불법 수출회사는 적발하지 못하므로 대무역 손실이 크게 되며 FTA의 경제적 이익을 취할 수 없다. 원산지 판별법을 완성할 경우 FTA 상대국과의 기술적 논쟁에서도 앞설 수 있으며 차후 협상이 진행될 일본, 중국 등 최대 교역국간의 FTA 협상에서도 우위를 확보할 수 있게 된다.
대사체학이란 세포 또는 조직내의 대사체의 거동, 분비 변화 등을 체계적으로 확인?정량하고, 그 결과로부터 대사체군을 다양한 생리?병리적 상태와 연관 지어 대사체 네트워크를 다시 해석하는 총체적인 연구이다. 최근 대사체학 연구는 한약재, 곡류 등의 농축산물의 원산지를 판별하는 데에도 적용되고 있다. 대사체 연구를 위해서는 대사체 변화를 검출?확인하기 위한 초정밀분석기술과 그 결과를 다시 생체의 생리적 상태와 연관 지어 해석하기 위한 통계분석이 기초가 된다. 현재 대사체학에 가장 많이 이용되고 있는 mass spectrometry(MS)에 비해 nuclear magnetic resonance(NMR)은 단시간 내에 시료 안의 대사체에 대한 정보를 한번에 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있어 다른 분석 장비들에 비해 감도가 낮다는 단점에도 불구하고 대사체학에서 유용한 분석 장비가 된다.
본 발명의 목적은 NMR을 이용한 소고기내 대사체 분석을 통하여 한국산 쇠고기와 수입산 쇠고기의 원산지에 따른 차이를 판별할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 쇠고기 원산지 판별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아세테이트, 알라닌, 안세린, 비테인, 카르니틴, 카르노신, 콜린, 크레아틴, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리세롤, 글리신, 하이포잔틴, 이노신, 이소루신, 젖산, 루신, 메티오닌, 니아신아미드, 페닐알라닌, 숙신산, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 포함하는 쇠고기 원산지 판별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 이용하여 쇠고기 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 DNA 분석이나 표준물질 없이 쇠고기의 대사체를 분석하여 원산지를 정확하게 판별할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 아세테이트, 알라닌, 안세린, 비테인, 카르니틴, 카르노신, 콜린, 크레아틴, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리세롤, 글리신, 하이포잔틴, 이노신, 이소루신, 젖산, 루신, 메티오닌, 니아신아미드, 페닐알라닌, 숙신산, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명의 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커는 원산지별 및 부위별 쇠고기의 대사체의 발현 빈도 차이를 이용하여 쇠고기의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 대사체의 발현 빈도는 구체적으로, 한국산, 미국산, 호주산 및 뉴질랜드산 중에서 가장 많이 발현되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 "한국산 대비 미국산 등심부위 판별용 바이오마커"란 한국산에 비해 글루탐산 또는 숙신산이 미국산 쇠고기의 등심부위에서 많이 발현되어 상기 대사체들을 한국산과 미국산 쇠고기의 등심부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있다는 뜻이다. 이하, 호주산 대비 한국산 쇠고기 등심부위 판별용 바이오마커, 한국산 대비 뉴질랜드산 쇠고기 등심부위 판별용 마커 등은 상기와 같은 의미로 해석되어야 할 것이다.
또한, 나라마다 쇠고기의 절단 방식에 차이가 있어 "등심부위 판별용 바이오마커"는 한국산과 뉴질랜드산은 "등심부위", 미국산 및 호주산은 "목심부위"를 판별할 수 있는 대사체를 의미한다.
상기 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커로 아세테이트, 알라닌, 안세린, 비테인, 카르니틴, 카르노신, 콜린, 크레아틴, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리세롤, 글리신, 하이포잔틴, 이노신, 이소루신, 젖산, 루신, 메티오닌, 니아신아미드, 페닐알라닌, 숙신산, 티로신, 또는 발린 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 호주산 대비 한국산 쇠고기 등심부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 아세테이트, 안세린, 콜린, 크레아티닌, 글리세롤, 하이포잔틴, 또는 니아신아미드 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
한국산 대비 뉴질랜드산 쇠고기 등심부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 크레아틴, 푸마르산, 글루탐산, 글리신, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 발린 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
뉴질랜드산 쇠고기 등심부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 발린 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
미국산 쇠고기 등심 또는 갈비 부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 숙신산을 사용할 수 있다.
한국산 대비 미국산 쇠고기 등심부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 글루탐 산 또는 숙신산 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
미국산 대비 한국산 쇠고기 등심부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 니아신아미드를 사용할 수 있다.
호주산 쇠고기 사태부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 아세테이트, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 또는 발린 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
한국산 대비 호주산 쇠고기 사태부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 알라닌, 글루탐산, 글리신, 하이포잔틴, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 또는 발린 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
호주산 대비 한국산 쇠고기 사태부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 이노신, 메티오닌, 또는 니아신아미드 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
뉴질랜드산 대비 한국산 사태부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 아세테이트, 카르니틴, 콜린, 크레아티닌, 글리세롤, 젖산, 메티오닌, 니아신아미드, 또는 숙신산 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
한국산 대비 뉴질랜드산 쇠고기 사태부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 카르노신, 크레아틴, 또는 글리신 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
미국산 대비 한국산 사태부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 카르니틴, 콜린, 글리세롤, 또는 젖산 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
한국산 대비 호주산 갈비부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 안세린, 크레아틴, 또는 메티오닌 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
한국산 대비 뉴질랜드산 갈비부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 알라닌, 카르니틴, 크레아틴, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 또는 숙신산 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
호주산 대비 한국산 갈비부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 비테인을 사용할 수 있다.
한국산 대비 미국산 갈비부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 크레아틴, 푸마르산, 또는 숙신산 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
미국산 대비 한국산 갈비부위를 판별할 수 있는 바이오마커로 안세린을 사용할 수 있다.
상기 바이오마커를 이용하여 한국, 미국, 호주, 또는 뉴질랜드산 쇠고기의 원산지를 판별할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 포함하는 쇠고기 원산지 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 쇠고기 원산지 판별용 키트는 하나 이상의 바이오마커를 포함하여 시료의 대사체를 정량 분석함으로써 쇠고기의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트는 시료를 담지할 수 있는 통상의 웰 형태의 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다.
상기 웰 내에는 시료 및 하나 이상의 바이오마커를 흡수할 수 있는 다공성 지지체를 포함할 수 있다.
상기 지지체는 쇠고기 대사체 추출물의 첨가를 대비하여 내부 바이오마커를 미리 결정된 농도로 포함하고 있으며, 아울러 각 시료를 고정할 수 있다. 또한, 지지체의 다공성은 시료 분석 시 첨가되는 추출 용매에 최대한 노출되게 할 수 있다.
따라서, 상기 지지체는 높은 수준의 다공도를 가진 임의의 지지체일 수 있으며, 이러한 지지체는 종래 기술분야에서 공지되어 있으며, 또는 상업적으로 구입 가능하다.
구체적으로, 고형 지지체일 수 있다. 보다 구체적으로는 액체에 대한 흡수성 물질로 이루어져 있다. 상기 흡수성 물질은 흡착제 또는 흡착성 물질일 수 있다.
상기 액체 흡수성 물질은 바이오마커의 용액과 분석용 후속 시료가 기공을 통해 일정하게 흡착 또는 흡수되게 한다.
상기 흡수성 물질로 셀룰로오스와 같은 카보하이드레이트 물질, 유리 섬유, 유리 비드, 폴리아크릴아미드 젤, 다공성 플라스틱 불활성 폴리머 및 다공성 흑연 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 아가로오스, 아가, 셀룰로오스, 덱스트란, 키토산 또는 곤약과 같은 카보하이드레이트 물질이나 그 유도체, 카나기난, 젤란 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 가장 구체적으로는, 셀룰로오스 또는 유리 섬유일 수 있다.
본 발명의 키트에 포함된 바이오마커는 시료에 존재하는 대사체의 양을 정량하기 위해 유사 또는 동일한 유사체에 대한 비교로 사용되는, 양을 알고 있는 절대량의 비교물질인 것으로 이해할 수 있다. 상기 바이오마커는 시료의 대사체와의 적 절한 구별을 위해 동위원소로 표지될 수 있다.
상기 바이오마커의 종류는 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 키트에 사용할 수 있는 시료는 쇠고기 원산지별 또는 부위별 대사체 추출물로서, 액체 시료의 형태로 키트에 제공될 수 있다.
상기 대사체 추출물은 메탄올 및 물의 혼합용매, 구체적으로 1:1 내지 9:1의 부피비, 보다 구체적으로는 7:3의 부피비로 혼합한 혼합용매에서 쇠고기를 균질화하여 얻을 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 마이크로타이터 플레이트는 분석물을 배출하기 위한 필터 및 배출구 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이들의 배치, 배출방법 등은 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 조정 가능하다.
또한, 본 발명의 키트는 통상적으로 분석장치와 조합하여 대사체 범위를 정량 표적 분석하기 위하여 여러 가지 대사체를 준비할 수 있는 기구에 포함된 시약, 용매, 소프트웨어 시스템 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 이용하여 쇠고기 원산지를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 쇠고기 원산지를 판별하는 방법은
쇠고기 시료에서 대사체를 추출하는 단계;
상기 추출된 대사체 및 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉에 따른 이온 세기의 증가를 측정하여 원산지를 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 쇠고기 원산지를 판별하는 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 쇠고기 시료에서 대사체를 추출하는 단계이다.
상기 대사체의 추출방법은 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 용매추출이 좋다.
상기 용매는 쇠고기의 대사체를 용해할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지는 않는다. 예를 들어, 상기 용매로, 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올; 아세톤; 트리플루오로에탄올; 테트라하이드로퓨란; 디클로로메탄; 및 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
상기 혼합용매는 대사체의 추출 범위를 넓게 하기 위해 메탄올 및 물을 1:1 내지 9:1의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 7:3의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 대사체의 추출 범위를 보다 넓게 하기 위해 상기 용매 내에서 쇠고기 시료를 균질화하는 과정을 추가적으로 실시할 수 있다.
제2단계는 상기 추출된 대사체 및 바이오마커를 접촉시키는 단계이다.
상기 접촉은 동위원소 등으로 표지된 본 발명의 바이오마커를 포함하는 마이크로타이터 플레이트 내에서 이루어질 수 있다.
제3단계는 상기 접촉에 따른 이온 세기의 증가를 측정하여 원산지를 판정하는 단계이다.
표적 대사체의 농도를 계산하기 위하여 적절한 바이오마커와 함께 수득되는 이온 세기를 사용한다. 바이오마커는 특징적인 하나의 이온 쌍(또는 수개의 이온 쌍)을 이용하여 식별되며, 수득되는 이온 세기는 바이오마커의 알고 있는 농도와 관련 있어 상응하는 표적 대사체의 정량화가 가능하다. 표적 대사체는 사전에 공지되어 있으며, 미리-주석을 달아둘 수 있다. 따라서, 검출 및 정량된 대사체에는 이미 주석이 달려, 빠르고 직접적인 해석이 가능하다.
표적 대사체의 질량 측정은 이온 종들을 구별하기 위해 MSMS 분석이 가능한 질량 측정기를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 결과로부터 대사체의 정량분석에 의한 이온 세기의 증가를 비교하여 쇠고기의 원산지를 판별할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 시료에서 숙신산 만의 이온 세기 증가가 관찰된다면, 미국산 쇠고기의 등심 또는 갈비부위로 판정할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제 한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커의 검출
쇠고기 원산지 판별용 바이오마커를 검출하기 위해, 중앙관세분석소를 통하여 총 120개의 쇠고기 시료들을 확보하였다. 4개의 나라(한국, 뉴질랜드, 미국, 호주)로부터 수입된 각각 등심(또는 목심, n=10), 사태(n=10), 갈비(n=10) 부위의 쇠고기 시료를 분석에 사용하였다. 나라마다 소를 자르는 방법의 차이에 의하여 한국산과 뉴질랜드산에서는 등심, 호주산과 미국산에서는 목심 부위를 이용하였다. 모든 시료들은 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 각각의 쇠고기 시료는 200mg씩 취해서 비드가 들어있는 1.5mL 튜브에 담겨 메탄올(+d4) 350㎕, 0.2M sodium phosphate buffer 150㎕와 함께 균질화하였다. 메탄올(+d4) 210㎕, 0.2M sodium phosphate buffer 90㎕, chloroform 400㎕이 추가로 투입한 후 1분 동안 볼텍싱하였다. 15분의 충분한 분리시간을 가진 후 4℃에서 13,000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액 630㎕와 내부 기준물질인 2.5mM sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate(DSS) 70㎕를 혼합한 후 총 부피가 600㎕가 되도록 하여 1H-NMR 분석을 행하였다.
1H-NMR 분석은 triple resonance 5-mm HCN salt tolerant cold probe가 장착된 Varian Inova-600MHz NMR Spectrometer(Varian Inc., Palo Alto, CA)에서 실시하였다. Water presaturation하는 Noesypresat pulse sequence를 이용하여 298K에 서 1H-NMR spectra를 얻었다. Spectral width 9615.4Hz, data point 32K, acquisition time 4sec, mixing time 0.1sec, number of transient 64 의 조건으로 실험하였다. 모든 spectra는 line broading 0.5Hz로 프로세싱되어 Fourier Transformation(FT)하였다.
모든 스펙트럼은 내부 기준물질을 사용하여 0ppm으로 보정한 후 Chenomx NMR Suite 6.0 software(Chenomx Inc. Edmonton, Canada)를 이용하여 spectral binning을 진행하였다. Bin size는 0.001ppm으로 하였고, DSS, methanol, water는 제외하고 binning을 수행하였다. 그리고 MATLAB (R2008a, The Mathworks, Inc., Matick, MA)을 사용하여 모든 스펙트럼을 정열하였다. 이 binning 결과를 바탕으로 SIMCA-P+ version 12.0(Umetrics AB, Umea, Sweden)를 이용하여 multivariate analysis를 수행하였다.
다음으로, 표적의 프로파일링은 각 대사체의 정량과 정성 분석을 위해서 가장 먼저 정확한 농도의 내부 기준물질을 첨가하여 그 피크의 면적을 기준으로 대사체의 농도를 측정한다. 이러한 방식으로 NMR을 이용하여 얻은 모든 시료들의 스펙트럼을 대사체 프로파일링을 실시하였다. 프로파일링한 데이터를 이용하여 GraphPad Prism 5.01 software로 one way ANOVA test를 실시하였다.
<실험예 1> 쇠고기의 NMR 분석을 위한 전처리 실험 조건
쇠고기 대사체를 잘 추출할 수 있는 조건을 찾기 위해서 메탄올과 물의 비율이 7:3, 5:5, 3:7, 메탄올 100%, 물 100%으로 테스트 실험을 실시하였다.
도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, 각각을 NMR을 찍어 확인해 보았을 때, 메탄올과 물의 비율이 7:3일 때 가장 많은 대사체가 추출되었음을 확인할 수 있다. 그러나 물만으로 추출하였을 경우에는 상층액에 부유 물질이 많아서 NMR 스펙트럼을 얻을 수 없었다. 메탄올과 물의 비율이 7:3일 때 가장 추출이 잘 되는 것을 확인하였으나, 원심분리 후에도 하얀 지방의 부유물이 완전히 가라앉지 않고 스펙트럼 상에서도 브로드한 지질이 많이 관찰되었다. 그래서 클로로포름과의 층분리 후 상층액 만을 분석에 이용하였다.
또한, 쇠고기 샘플로부터 가장 효과적으로 대사체를 추출하기 위해서는 균질화가 잘 이루어지는 것이 중요하다. 그러나 쇠고기 샘플은 근육 때문에 질기므로 균질화가 잘 이루어질 수 있는 조건을 찾는 것이 필요하였다.
우선 1.5mL 튜브에서 전체 용매 1.2mL로 쇠고기 샘플의 크기를 0.15g, 0.2g, 0.25g으로 한 테스트를 통하여 쇠고기가 완전히 갈리면서 적당한 농도로 NMR 스펙트럼을 얻을 수 있는 0.2g으로 쇠고기 샘플의 크기를 정하였다. 그리고 전체 용매 1.2mL를 한번에 투입한 후 균질화하는 것보다 0.5mL 상에서 먼저 균질화한 후 나머지 용매를 넣고 층분리하는 것이 추출에 더 효과적이라는 것을 확인하였다.
상기 추출과정은 도 5에 간략하게 도시하였다.
<실험예 2> 쇠고기의 1H NMR spectroscopy
한우와 미국, 뉴질랜드, 호주로부터 수입된 등심(또는 목심) 부위의 쇠고기 시료들의 대표적인 1H NMR 스펙트럼은 도 6에 도시하였다. 쇠고기의 갈비 및 사태부위 시료들의 1H NMR 스펙트럼들은 등심(또는 목심)의 1H NMR 스펙트럼과 거의 유사하므로 생략하였다. 대사체들을 정렬하기 위해서 2D NMR 분석과 spiking 실험, 이미 출판된 문헌들을 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 4개 나라의 쇠고기 NMR 스펙트럼에서 시각적으로 큰 차이를 보이지는 않지만, 부분적으로 피크 대 피크 비율의 차이를 보이는 곳이 있다. 특히 아미노산들이 나오는 0.8-1.1ppm, 7.2-7.4ppm에서 뉴질랜드 쇠고기가 다른 나라들에 비해 유난히 큰 피크를 가지고 있는 것을 볼 수 있다.
<실험예 3> NMR 기반 대사체 기법을 이용한 원산지 판별 바이오마커의 확인
쇠고기 시료를 나라별로 분리시키고, 나라별로 분리할 수 있는 대사체, 즉 바이오마커가 될 수 있는 물질을 찾기 위해 주성분 분석(Principal component analysis, PCA)와 최소자승 판별 분석(partial least-squares discriminant analysis, PLS-DA), 직교 최소자승 분석(orthogonal partial least-squares discriminant analysis, OPLS-DA)을 사용하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, Score plot에서 각각의 점은 각각의 시료를 나타내며, 비슷한 시료끼리 서로 모이게 된다. 4개 나라로부터의 등심(또는 목심)과 사 태 부위의 쇠고기 시료들은 PCA score plot에서, 갈비 부위의 쇠고기 시료들은 PLS-DA score plot에서 깨끗하게 분리된 것을 볼 수 있다.
좀 더 확실하게 분리되는 것을 확인하기 위하여 OPLS-DA를 수행하였다(도 8).
또한, 각각 2개 나라씩의 score plot과 loading plot을 얻음으로써 원산지에 따라 분리되도록 한 대사체를 찾을 수 있었다(도 9-11).
<실험예 4> 대사체의 확인과 정량
상기에서 확인된 25개의 대사체들은 Chenomx NMR Suite 6.0 software를 사용하여 정량하였다.
정량한 대사체들의 농도의 평균을 보면 나라마다 확실한 차이를 보이는 걸 알 수 있다(표 1, 2, 3).
*는 P<0.05, **는 P<0.01을 의미함.
*는 P<0.05, **는 P<0.01을 의미함.
*는 P<0.05, **는 P<0.01을 의미함.
우선, 등심 부위의 쇠고기에서 one-way ANOVA test를 통해 유의한 것으로 확인된 대사체를 도 12에 나타내었다.
이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 발린과 같은 아미노산들은 뉴질랜드산 쇠고기에 다른 나라들에 비해서 많이 포함되어 있으며, 숙신산은 미국산 쇠고기에 유난히 많이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있다. 한국산과 호주산 쇠고기를 비교해 보면 아세테이트, 안세린, 콜린, 크레아티닌, 글리세롤, 하이포잔틴, 니아신아미드가 호주산에 비해 한국산 쇠고기에 상대적으로 많이 포함되어 있다. Tukey 사후검정을 통하여 두 나라에서 차이가 유의함(p<0.05)을 확인하였다. 한국산과 뉴질랜드산에서는 크레아틴, 푸마르산, 글루타메이트, 글리신, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 발린이 한국에 비해 뉴질랜드산 쇠고기에 많이 포함되어있는 것을 확인할 수 있었다. 한국산과 미국산에서는 글루탐산과 숙신산은 미국산 쇠고기에, 니아신아미드는 한국산 쇠고기에 상대적으로 더 많이 포함되어 있음을 확인하였다.
또한, 사태 부위의 쇠고기에서 one-way ANOVA test를 통해 유의하다고 확인된 대사체들은 도 13에 나타내었다.
아세테이트, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 발린과 같은 아미노산들은 호주산 쇠고기에 다른 나라들에 비해서 많이 포함되어 있으며, 숙신산은 미국산 쇠고기에 유난히 많이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있다. 한국산과 호주산 쇠고기를 비교해 보면 알라닌, 글루탐산, 글리신, 하이포잔틴, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신, 발린은 호주산 쇠고기에, 이노신, 메티오닌, 니아신아미드는 한국산 쇠고기에 많이 포함되어 있다. 한국산과 뉴질랜드산 쇠고기에서는 아세테이트, 카르니틴, 콜린, 크레아티닌, 글리세롤, 젖산, 메티오닌, 니아신아미드, 숙신산은 한국산 쇠고기에, 카르노신, 크레아틴, 글리신은 뉴질랜드산 쇠고기에 많이 포함되어 있다. 한국산과 미국산에서는 카르니틴, 콜린, 글리세롤, 젖산이 미국산에 비해서 한국산 쇠고기에 많이 포함되어 있다.
또한, 갈비 부위의 쇠고기에서 one-way ANOVA test를 통해 유의한 것으로 확인된 대사체들은 도 14에 나타나 있다.
한국산과 호주산 쇠고기를 비교해 보면 안세린, 크레아틴, 메티오닌이 한국산에서보다 호주산 쇠고기에 많이 포함되어 있는 것이 사후검정을 통해 확인되었다. 한국산과 뉴질랜드산 쇠고기에서는 알라닌, 카르니틴, 크레아틴, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 숙신산이 뉴질랜드산 쇠고기에, 비테인이 한국산 쇠고기에 더 많이 포함되어 있다. 한국산과 미국산의 비교에서는 크레아틴, 푸마르산, 숙신산이 미국산 쇠고기에 더 많이 포함되어 있고, 안세린은 한국산 쇠고기에 더 많이 포함되어 있었다.
도 1 내지 4는 쇠고기 대사체 추출용매로 메탄올과 물을 7:3, 5:5, 3:7, 10:0의 비율로 혼합한 것으로 각 대사체 추출물의 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 쇠고기 원산지 판별을 위한 대사체 추출과정을 간략히 도시한 것이다.
도 6은 한국(A), 호주(B), 뉴질랜드(C), 미국(D)에서 수입한 등심(또는 목심) 부위의 쇠고기 시료들의 대표적인 1H NMR 스펙트럼 결과이다.
도 7은 1H NMR 스펙트럼에서 얻은 4개국 PCA 2D score plot(A:등심, C:사태), 3D score plot(B:등심, D:사태)와 PLS-DA 2D score plot(E:갈비), 3D score plot(F:갈비)이다.
도 8은 1H NMR 스펙트럼에서 얻은 4개국 OPLS-DA 2D score plot(A:등심, C:사태, E:갈비), 3D score plot(B:등심, D:사태, F:갈비)이다.
도 9는 등심(또는 목심) 부위 쇠고기의 1H NMR 스펙트럼에서 얻은 PCA score plot(A, C, E, G, I. K)과 PCA loading plot(B, D, F, H, J, L)으로, A와 B는 호주와 한국, C와 D는 호주와 뉴질랜드, E와 F는 호주와 미국, G와 H는 한국과 뉴질랜드, I와 J는 한국과 미국, K와 L은 뉴질랜드와 미국의 score plot과 loading plot이다.
도 10은 사태 부위 쇠고기의 1H NMR 스펙트럼에서 얻은 PCA score plot(A, C, E, G, I. K)과 PCA loading plot(B, D, F, H, J, L)으로, A와 B는 호주와 한국, C와 D는 호주와 뉴질랜드, E와 F는 호주와 미국, G와 H는 한국과 뉴질랜드, I와 J는 한국과 미국, K와 L은 뉴질랜드와 미국의 score plot과 loading plot이다.
도 11은 갈비 부위 쇠고기의 1H NMR 스펙트럼에서 얻은 PCA score plot(A, C, E, G, I. K)과 PCA loading plot(B, D, F, H, J, L)으로, A와 B는 호주와 한국, C와 D는 호주와 뉴질랜드, E와 F는 호주와 미국, G와 H는 한국과 뉴질랜드, I와 J는 한국과 미국, K와 L은 뉴질랜드와 미국의 score plot과 loading plot이다.
도 12는 등심(또는 목심) 부위 쇠고기에서 확인된 대사체들의 정량 그래프(One-way Anova test 결과 P<0.05임을 확인됨)이다.
도 13은 사태 부위 쇠고기에서 확인된 대사체들의 정량 그래프(One-way Anova test 결과 P<0.05임을 확인됨)이다.
도 14는 갈비 부위 쇠고기에서 확인된 대사체들의 정량 그래프(One-way Anova test 결과 P<0.05임을 확인됨)이다.
Claims (24)
- 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사체를 포함하고, 한국, 미국, 호주 및 뉴질랜드산 쇠고기 또는 상기 쇠고기의 부위별로 하나의 원산지의 대사체가 다른 원산지들에 비해 발현량이 증가하는 특징이 있는 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커 조성물:아세테이트, 알라닌, 안세린, 비테인, 카르니틴, 카르노신, 콜린, 크레아틴, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리세롤, 글리신, 하이포잔틴, 이노신, 이소루신, 젖산, 루신, 메티오닌, 니아신아미드, 페닐알라닌, 숙신산, 티로신 및 발린.
- 제1항에 있어서, 호주산 및 한국산 쇠고기 등심부위 판별 시 한국산 쇠고기 등심부위에서 하기 대사체의 발현량이 호주산 쇠고기 등심부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:아세테이트, 안세린, 콜린, 크레아티닌, 글리세롤, 하이포잔틴 및 니아신아미드.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 뉴질랜드산 쇠고기 등심부위 판별 시 뉴질랜드산 쇠고기 등심부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 쇠고기 등심부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:크레아틴, 푸마르산, 글루탐산, 글리신, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 발린.
- 제1항에 있어서, 한국, 미국, 호주 및 뉴질랜드산 쇠고기 등심부위에서 하나의 원산지의 하기 대사체의 발현량이 다른 원산지들에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:한국산에서는 이노신 및 젖산;호주산에서는 알라닌, 카르니틴 및 글루타민;뉴질랜드산에는 아세테이트, 안세린, 비테인, 카르노신, 콜린, 크레아틴, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글리신, 하이포잔틴, 이소루신, 루신, 메티오닌, 니아신아미드, 페닐알라닌, 티로신 및 발린; 및미국산에는 글리세롤 및 숙신산.
- 제1항에 있어서, 한국, 미국, 호주 및 뉴질랜드산 쇠고기 사태부위에서 하나의 원산지의 하기 대사체의 발현량이 다른 원산지들에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:한국산에서는 안세린, 카르니틴, 글리세롤, 메티오닌 및 니아신아미드;호주산에서는 아세테이트, 알라닌, 콜린, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글리신, 하이포잔틴, 이소루신, 젖산, 루신, 페닐알라닌, 티로신 및 발린;뉴질랜드산에는 카르노신, 크레아틴 및 이노신; 및미국산에는 비테인, 글루타민 및 숙신산.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 미국산 쇠고기 등심부위 판별 시 미국산 쇠고기 등심부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 등심부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:글루탐산 및 숙신산.
- 제1항에 있어서,미국산 및 한국산 쇠고기 등심부위 판별 시 한국산 쇠고기 등심부위에서 니아신아미드의 발현량이 미국산 등심부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 한국, 미국, 호주 및 뉴질랜드산 쇠고기 갈비부위에서 하나의 원산지의 하기 대사체의 발현량이 다른 원산지들에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:한국산에서는 안세린 및 니아신아미드;호주산에서는 아세테이트, 비테인, 콜린, 글리세롤, 이노신, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 발린;뉴질랜드산에는 알라닌, 카르니틴, 카르노신, 크레아틴, 크레아티닌, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 하이포잔틴 및 젖산; 및미국산에는 숙신산.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 호주산 쇠고기 사태부위 판별 시 호주산 쇠고기 사태부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 사태부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:알라닌, 글루탐산, 글리신, 하이포잔틴, 이소루신, 루신, 페닐알라닌, 티로신 및 발린.
- 제1항에 있어서, 호주산 및 한국산 쇠고기 사태부위 판별 시 한국산 쇠고기 사태부위에서 하기 대사체의 발현량이 호주산 사태부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:이노신, 메티오닌 및 니아신아미드.
- 제1항에 있어서, 뉴질랜드산 및 한국산 사태부위 판별 시 한국산 사태부위에서 하기 대사체의 발현량이 뉴질랜드산 사태부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:아세테이트, 카르니틴, 콜린, 크레아티닌, 글리세롤, 젖산, 메티오닌, 니아신아미드 및 숙신산.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 뉴질랜드산 쇠고기 사태부위 판별 시 뉴질랜드산 쇠고기 사태부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 사태부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:카르노신, 크레아틴 및 글리신.
- 제1항에 있어서, 미국산 및 한국산 사태부위 판별 시 한국산 사태부위에서 하기 대사체의 발현량이 미국산 사태부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:카르니틴, 콜린, 글리세롤 및 젖산.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 호주산 갈비부위 판별 시 호주산 갈비부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 갈비부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:안세린, 크레아틴 및 메티오닌.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 뉴질랜드산 갈비부위 판별 시 뉴질랜드산 갈비부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 갈비부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:알라닌, 카르니틴, 크레아틴, 푸마르산, 글루탐산, 글루타민, 글리신 및 숙신산.
- 제1항에 있어서,호주산 및 한국산 갈비부위 판별 시 한국산 갈비부위에서 비테인의 발현량이 호주산 갈비부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 한국산 및 미국산 갈비부위 판별 시 미국산 갈비부위에서 하기 대사체의 발현량이 한국산 갈비부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물:크레아틴, 푸마르산 및 숙신산.
- 제1항에 있어서,미국산 및 한국산 갈비부위 판별 시 한국산 갈비부위에서 안세린의 발현량이 미국산 갈비부위에 비해 증가하는 특징이 있는 바이오마커 조성물.
- 쇠고기 원산지에 따라 발현량에서 차이를 나타내는 제1항의 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 포함하는 쇠고기 원산지 판별용 키트.
- 11H NMR 분광법을 통해 원산지가 공지된 쇠고기에서 추출된 대사체의 원산지 및 부위별 발현 프로파일을 분석하여 원산지 및 부위별 차별성이 검출된 대사체를 제1항의 쇠고기 원산지 판별용 바이오마커 조성물로 선정하고, 상기 바이오마커의 발현량의 차이를 기반으로 한 원산지 및 부위별 표준 모델을 확립하는 단계;쇠고기 시료에서 추출된 대사체와 동위원소로 표지된 상기 바이오마커를 접촉시키는 단계; 및상기 접촉에 따른 바이오마커의 이온 세기의 증가를 측정하여 상기 원산지 및 부위별 표준 모델에 대입하여 원산지를 확인하는 단계를 포함하는 쇠고기 원산지를 판별하는 방법.
- 삭제
- 제20항에 있어서,대사체는 메탄올 및 물의 혼합용매에서 쇠고기를 균질화하여 추출하는 쇠고기 원산지를 판별하는 방법.
- 제22항에 있어서,혼합용매는 메탄올 및 물을 1:1 내지 9:1의 부피비로 혼합한 것인 쇠고기 원산지를 판별하는 방법.
- 삭제
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