CN112326819B - 一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，包括如下步骤：S1、溶液配制：标准品储备液的配制、提取溶液的配制、内标储备液的配制，待用；S2、样品制备：精密称取经过前处理的毛发样品10mg置于2mL的研磨管中，加入研磨珠适量，加入500μL所述提取溶液和50μL的100ng/mL阿普唑仑‑d5；于均质器中冷冻研磨，然后离心，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤；S3、LC‑MS/MS分析测定。本发明的方法简便快速，一步提取，采用提取溶液在低温下湿磨提取头发中的目标物，研磨时间为10min，色谱运行时间短(6min)，灵敏度满足日常检案要求。

Description

一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮 的分析方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法。
背景技术
氟硝西泮(Flunitrazepam)和依替唑仑(Etizolam)，又称“蓝精灵”和“红精灵”，是近期在网络上代购、娱乐场所中发现的新型毒品。在我国，氟硝西泮已被列入《精神药品品种名录(2013版)》二类药品目录进行管理，属于毒品范畴，明令禁止使用。氟硝西泮在临床上主要用作镇静催眠药或麻醉剂，因此常被用于药物辅助犯罪案件中。但近年来相关文献报道，因该药物强烈的致幻性和成瘾性，其滥用情况愈发严重，并且氟硝西泮与酒精同时使用可增强酒精的效果，因此广泛应用于娱乐场所。2011年，欧洲毒品监管中心(EuropeanMonitoring Centre for Drugs and DrugAddiction,EMCDDA)第一次报告依替唑仑是欧洲市场上流行的一种新型苯二氮
Figure BDA0002734333840000011
类药物。文献报道依替唑仑滥用的趋势有所增加，已有几例死亡案例。网购的便利，使贩卖这类毒品更加容易，近年来，警方查获多起“蓝精灵”走私案，这些毒品的泛滥对公共健康安全造成现实危害或潜在威胁。
针对氟硝西泮和依替唑仑的检测，国内外多采用气相色谱-质谱联用、液相色谱-串联质谱法，主要检材包括血样和尿样。但是氟硝西泮和依替唑仑在体内的代谢较快，在血液和尿液中的检测时限较短。毛发因其检测时限长，能反映较长时间(几个月或几年)的药物使用情况，在认定吸毒成瘾方面具有独特的应用价值，与血液、尿液等生物检材相比，毛发样本采集无创且难以掺假，毛发检测可以提供长程的用药信息和用药频率，目前在我国已成为吸毒成瘾认定的证据。通过对毛发中滥用药物检测结果进行回顾性分析，有助于鉴别吸毒者或潜在的吸毒者。对滥用药物进行检测还可以分析毒品滥用的趋势和特征，以便可以采取适当的政策，如吸毒者的治疗、药物滥用的预防和干预等。因此应当通过毛发检测分析来监测我国毒品的滥用特征和趋势。毛发中毒(药)物的分离提取方法有甲醇超声法、酸水解法、碱消化法、酶消化法等。但很多提取方法存在一些缺陷，如酶消化法成本较高，酸水解或碱水解仅针对某种毒品。
由于这些药物的剂量为2mg/片，摄入剂量低，而毛发基质复杂，其中药物含量甚微，在pg/mg水平。因此需要建立高灵敏度、高特异性的毛发中依替唑仑、氟硝西泮及其代谢物7-氨基氟硝西泮的分析方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，该分析方法具有高灵敏度和高特异性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，包括如下步骤：
S1、溶液配制：
标准品储备液的配制：取依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的标准品，混合后甲醇稀释至不同浓度待用；
提取溶液的配制：将甲酸铵溶液与甲醇和乙腈混合，并用甲酸溶液调节pH，即得提取溶液；
内标储备液的配制：取阿普唑仑-d5，用甲醇稀释，再用所述提取溶液稀释待用；
S2、样品制备：
精密称取经过前处理的毛发样品置于研磨管中，加入研磨珠适量，加入所述提取溶液和阿普唑仑-d5；于均质器中冷冻研磨，然后离心，上清液经微孔滤膜过滤，即得待测溶液；
S3、LC-MS/MS分析测定：
将标准品溶液直接质谱进样，依次确立依替唑仑、氟硝西泮、7氨基氟硝西泮和阿普唑仑-d5的碎片离子、去簇电压和碰撞能，使得碎片离子有最大响应值，每个化合物通过两个碎片离子进行计算；
色谱条件：液相色谱柱为Restek Allure PFP丙基柱，前接Agilent保护柱ZorbaxC8；流动相A：20mmol/L乙酸铵缓冲溶液含0.1％甲酸，流动相B：乙腈；流速：0.25mL/min，A:B＝70:30等度恒流洗脱6min，柱温为室温；自动进样器保持为4℃。
优选地，S1中，所述提取溶液的具体配制过程为：精密量取甲酸100μl，加入超纯水10mL，即得0.1％甲酸溶液；精密称定甲酸铵约0.063g，加超纯水450mL，再加入所述0.1％甲酸溶液115μl调节pH至5.3，即得pH为5.3的2mmol/L甲酸铵溶液；取所述pH为5.3的2mmol/L甲酸铵溶液230mL、甲醇125mL、乙腈145mL混合后，即得提取溶液。
优选地，S2中，所述前处理的具体过程为：将毛发样品置于带塞试管中，依次用超纯水清洗3次、丙酮清洗3次，收集最后一次丙酮清洗液，吹干后用所述提取溶液复溶排除外污染因素；毛发清洗后室温下晾干，剪成2-3mm段。
优选地，S2中，所述均质器为Bead Ruptor 24Elite多功能样品均质器。
优选地，S2中，所述冷冻研磨的速度为6m/s，研磨时间为20s，两次研磨间隔时间为40s，循环次数为10次。
优选地，S2中，所述离心的离心力为9700×g，离心时间为3min。
优选地，S3中，所述Restek Allure PFP丙基柱的尺寸为：100mm×2.1mm，5μm。
优选地，S3中，所述Agilent保护柱Zorbax C8的尺寸为：12.5×2.1mm，5μm。
优选地，S3中，所述质谱采用电喷雾离子器质谱的正离子模式检测，选择多离子模式监测，采用Analyst software 1.5和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据收集和分析。
优选地，所述多离子模式监测：质谱仪离子喷雾电压为5500V，离子源温度为500℃，直接进样后进行母离子和子离子，以及去簇电压和碰撞能的筛选以得到最大的离子强度，保持碰撞解离能量稳定。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的方法简便快速，一步提取，采用提取溶液在低温下湿磨提取头发中的目标物，研磨时间为10min，色谱运行时间短(6min)，灵敏度满足日常检案要求。
附图说明
图1为本发明中各目标物在毛发中质量浓度为LOQ(0.01ng/mg)时的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
药品：
依替唑仑、氟硝西泮、7-氨基氟硝西泮以及内标阿普唑仑-d5均购自美国Cerilliant公司。甲醇和乙腈(HPLC)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。甲酸铵(HPLC)购自瑞士Fluka公司。乙酸铵(HPLC)、甲酸(分析纯)均购自CNW(UK)。丙酮(分析纯)购自上海灵峰化学试剂有限公司(中国上海)。去离子水由Milli-Q(Millipore,MA,USA)净水系统制备。PTFE滤膜(0.22μm)购自国药集团化学试剂有限公司。
仪器条件：
涡旋混合器(XW-80A)购自上海沪西分析仪器厂有限公司。Bead Ruptor 24Elite多功能均质器和研磨管均购自美国Omni International公司。MiniSpin高速离心机购自德国Eppendorf公司，Milli-Q超纯水制备系统购自美国Millipore公司。API 4000QTRAP三重四极杆线性离子阱质谱仪(美国Applied Biosystems公司)。AcquityTM UltraPerformance LC超高压液相色谱仪(美国Waters公司)。使用MultiQuant 3.0.2工作站进行数据分析。
如图1所示，本发明提供一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，包括如下步骤：
S1、溶液配制：
标准品储备液的配制：取0.1mg/mL或1mg/mL的目标化合物的标准品，混合后甲醇稀释至1μg/mL，后依次稀释至0.1、0.01和0.002μg/mL待用；
提取溶液的配制：将甲酸铵溶液与甲醇和乙腈混合，并用甲酸溶液调节pH，即得提取溶液；
内标储备液的配制：取0.1mg/mL目标化合物的内标标准品，混合后甲醇稀释至1μg/mL，用所述提取溶液稀释至100ng/mL待用；
S2、样品制备：
精密称取经过前处理的毛发样品10mg置于2mL的研磨管中，加入研磨珠适量，加入500μL所述提取溶液和50μL的100ng/mL阿普唑仑-d5；于均质器中冷冻研磨，然后离心，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，即得待测溶液；
S3、LC-MS/MS分析测定：
将标准品溶液直接质谱进样，依次确立目标化合物和内标化合物的碎片离子、去簇电压和碰撞能，使得碎片离子有最大响应值，每个化合物通过两个碎片离子进行计算；
色谱条件：液相色谱柱为Restek Allure PFP丙基柱，前接Agilent保护柱ZorbaxC8；流动相A：20mmol/L乙酸铵缓冲溶液含0.1％甲酸，流动相B：乙腈；流速：0.25mL/min，A:B＝70:30等度恒流洗脱6min，柱温为室温；自动进样器保持为4℃。
作为一个优选实施例，S1中，所述提取溶液的具体配制过程为：精密量取甲酸100μl，加入超纯水10mL，即得0.1％甲酸溶液；精密称定甲酸铵约0.063g，加超纯水450mL，再加入所述0.1％甲酸溶液115μl调节pH至5.3，即得pH为5.3的2mmol/L甲酸铵溶液；取所述pH为5.3的2mmol/L甲酸铵溶液230mL、甲醇125mL、乙腈145mL混合后，即得提取溶液。
作为一个优选实施例，S2中，所述前处理的具体过程为：将毛发样品置于带塞试管中，依次用超纯水清洗3次、丙酮清洗3次，收集最后一次丙酮清洗液，吹干后用所述提取溶液复溶排除外污染因素；毛发清洗后室温下晾干，剪成2-3mm段。
作为一个优选实施例，S2中，所述均质器为Bead Ruptor 24Elite多功能样品均质器。
作为一个优选实施例，S2中，所述冷冻研磨的速度为6m/s，研磨时间为20s，两次研磨间隔时间为40s，循环次数为10次。
作为一个优选实施例，S2中，所述离心的离心力为9700×g，离心时间为3min。
作为一个优选实施例，S3中，所述Restek Allure PFP丙基柱的尺寸为：100mm×2.1mm，5μm。
作为一个优选实施例，S3中，所述Agilent保护柱Zorbax C8的尺寸为：12.5×2.1mm，5μm。
作为一个优选实施例，S3中，所述质谱采用电喷雾离子器质谱的正离子模式检测，选择多离子模式监测，采用Analyst software 1.5和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据收集和分析。所述多离子模式监测：质谱仪离子喷雾电压为5500V，离子源温度为500℃，直接进样后进行母离子和子离子，以及去簇电压和碰撞能的筛选以得到最大的离子强度，保持碰撞解离能量稳定。通过将各目标分析物分别直接质谱进样，依次确立了目标化合物和内标化合物的碎片离子、去簇电压和碰撞能，使得碎片离子有最大响应值，每个化合物通过两个碎片离子进行计算。各化合物质谱参数、保留时间和离子比如表1所示：
表1各化合物质谱参数、保留时间和离子比
Figure BDA0002734333840000061
方法学验证及其对应结果：
根据毛发分析协会(The Society ofHair Testing,SoHT)指导原则以及国际准则进行方法学验证。评估参数主要包括选择性、检测限(limit ofdetection，LOD)、定量限(limit ofquantification，LOQ)、线性、精密度、准确度、基质效应和回收率等。
(1)选择性
收集10名未服用过氟硝西泮和依替唑仑物质的健康志愿者的空白毛发样本进行选择性检测，确保在目标物组分的出峰时间内没有其他物质的干扰。此外还考察了可能的同服药物引起的干扰。
通过比较空白毛发样品中各化合物的色谱图，确认内源性物质及可能的同服药物对目标物及内标无干扰。各化合物的出峰时间在1.37-2.22min。各目标物质量浓度为LOQ(0.01ng/mg)时的色谱图如图1所示。
(2)检测限LOD和定量限LOQ
取空白毛发加入混合对照品溶液配置成不同浓度的含全部目标物的毛发样品。以信噪比S/N≥3时的质量浓度为检测限，S/N≥10时的质量浓度为定量限，且将定量限作为线性范围的最小浓度，对LOQ处的毛发样品进行精密度和准确度实验考察。LOQ处的毛发样品准确度和精确度均在±20％以内。实验结果如表2所示：
表2各目标物在毛发中的回归方程、线性范围、相关系数、LOD及LOQ
Figure BDA0002734333840000071
由表2中数据可知，三种化合物的LOD均为0.005ng/mg，LOQ均为0.01ng/mg。
(3)线性
取空白毛发加入混合对照品溶液适量得到不同质量浓度的毛发样品。进行样品前处理，进样分析。以目标物在毛发中的质量浓度为横坐标，目标物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得线性方程，并计算相关系数(R2)。每个化合物的线性方程由7个点计算得到，最低浓度为LOQ(S/N≥10)，并确保实际样品的浓度落在线性范围内。
通过考察质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、2、5和10ng/mg10个不同浓度的毛发样品，将目标化合物和内标的峰面积比和浓度按照加权(1/x2)最小二乘法进行回归运算，得到线性数据和相关系数R2。结果如表2所示。由表2中数据可知，毛发样品中各化合物在相应的浓度范围内线性良好，R2均大于0.99，线性数据符合要求。
(4)精密度和准确度
对低、中、高3个浓度进行精密度和准确度的考察，取空白毛发加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为0.01、0.5和5ng/mg的质控样品，每个浓度4份样品。进行样品前处理，进样分析，计算日内精密度和准确度。准确度用偏倚表示，通过线性计算浓度，比较线性计算所得值与添加浓度之间的百分比。精密度用相对标准偏差(RSD)表示。连续测定4天，并与标准曲线同时测定，以当日的标准曲线计算质控样品的浓度，计算日间精密度。精密度考察了在同日和不同日重复实验的变化。结果如表3所示：
表3各目标物在毛发中的精密度和准确度
Figure BDA0002734333840000081
Figure BDA0002734333840000091
由表3中数据可知，各化合物的日内精密度为1.24-6.86％，日间精密度为2.93-10.39％。准确度为-14.05-13.79％。数据证明该方法对目标化合物有着良好的准确度与精密度，符合要求。
(5)基质效应和回收率
根据Matuszewski等提出的方法将样品分为三组计算提取回收率和基质效应。Ⅰ组：6份不同来源的毛发进行样品前处理提取前添加一定浓度混合对照品溶液；Ⅱ组：6份不同来源的毛发进行样品前处理提取后添加相应浓度的混合对照品溶液；Ⅲ组：配制相应浓度的混合对照品溶液。取不同来源的空白毛发加入混合对照品溶液适量得到质量浓度为1ng/mg和5ng/mg(低浓度)的质控样品，每个浓度每组各6份样品。进样分析，记录峰面积(A)。提取回收率＝AⅠ/AⅡ，基质效应＝AⅡ/AⅢ。结果如表4所示：
表4各目标物在毛发中的提取回收率和基质效应
Figure BDA0002734333840000092
由表4中数据可知，各目标物的提取回收率范围为86-97％，氟硝西泮和依替唑仑的基质效应为-3--16％，而7-氨基氟硝西泮表现为抑制作用，基质效应为-53--54％，但不同来源毛发的基质效应的相对标准偏差(RSD)≤13％。
应用实施例1
经过方法学验证后，本发明被应用于实际的案例分析中。采用本发明方法对22例氟硝西泮使用者的毛发进行分析。
对被送检的毛发样本分为S1(0-1cm)、S2(1-2cm)、S3(2-3cm)、S4(3-4cm)、S5(4-5cm)、S6(5-6cm)六个片段进行分析测定。
结果显示：22名氟硝西泮滥用者毛发中氟硝西泮的浓度范围为0.01-0.16ng/mg，中位数为0.027ng/mg和7-氨基氟硝西泮的浓度范围为0.01-0.34ng/mg，中位数为0.09ng/mg。从发段S1到S6，7-氨基氟硝西泮与氟硝西泮的中位数比值为2.75、2.43、2.66、3.68、3.49和3.07，对于所有的发段，10％到第90％的比值范围为0.51-8.29，中位数比值为3.07。本研究中22名摄毒人员多个毛发片段中均检测到氟硝西泮和7-氨基氟硝西泮，这表明他们有不同程度的氟硝西泮长期滥用史。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、溶液配制：
标准品储备液的配制：取依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的标准品，混合后甲醇稀释至不同浓度待用；
提取溶液的配制：将甲酸铵溶液与甲醇和乙腈混合，并用甲酸溶液调节pH，即得提取溶液；
内标储备液的配制：取阿普唑仑-d5，用甲醇稀释，再用所述提取溶液稀释待用；
S2、样品制备：
精密称取经过前处理的毛发样品置于研磨管中，加入研磨珠适量，加入所述提取溶液和阿普唑仑-d5；于均质器中冷冻研磨，然后离心，上清液经微孔滤膜过滤，即得待测溶液；
S3、LC-MS/MS分析测定：
将标准品溶液直接质谱进样，依次确立依替唑仑、氟硝西泮、7氨基氟硝西泮和阿普唑仑-d5的碎片离子、去簇电压和碰撞能，使得碎片离子有最大响应值，每个化合物通过两个碎片离子进行计算；
色谱条件：液相色谱柱为Restek Allure PFP丙基柱，前接Agilent保护柱Zorbax C8；流动相A：20mmol/L乙酸铵缓冲溶液含0.1％甲酸，流动相B：乙腈；流速：0.25mL/min，A:B＝70:30等度恒流洗脱6min，柱温为室温；自动进样器保持为4℃。
2.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S1中，所述提取溶液的具体配制过程为：精密量取甲酸100μl，加入超纯水10mL，即得0.1％甲酸溶液；精密称定甲酸铵约0.063g，加超纯水450mL，再加入所述0.1％甲酸溶液115μl调节pH至5.3，即得pH为5.3的2mmol/L甲酸铵溶液；取所述pH为5.3的2mmol/L甲酸铵溶液230mL、甲醇125mL、乙腈145mL混合后，即得提取溶液。
3.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S2中，所述前处理的具体过程为：将毛发样品置于带塞试管中，依次用超纯水清洗3次、丙酮清洗3次，收集最后一次丙酮清洗液，吹干后用所述提取溶液复溶排除外污染因素；毛发清洗后室温下晾干，剪成2-3mm段。
4.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S2中，所述均质器为Bead Ruptor 24Elite多功能样品均质器。
5.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S2中，所述冷冻研磨的速度为6m/s，研磨时间为20s，两次研磨间隔时间为40s，循环次数为10次。
6.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S2中，所述离心的离心力为9700×g，离心时间为3min。
7.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S3中，所述RestekAllure PFP丙基柱的尺寸为：100mm×2.1mm，5μm。
8.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S3中，所述Agilent保护柱Zorbax C8的尺寸为：12.5×2.1mm，5μm。
9.根据权利要求1所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，S3中，所述质谱采用电喷雾离子器质谱的正离子模式检测，选择多离子模式监测，采用Analyst software 1.5和MultiQuant 3.0.2工作站进行数据收集和分析。
10.根据权利要求9所述的同时测定毛发中依替唑仑、氟硝西泮以及7氨基氟硝西泮的分析方法，其特征在于，所述多离子模式监测：质谱仪离子喷雾电压为5500V，离子源温度为500℃，直接进样后进行母离子和子离子，以及去簇电压和碰撞能的筛选以得到最大的离子强度，保持碰撞解离能量稳定。
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