CN107843662B - 一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，该方法可检测24种镇静剂类药物残留量，包括以下步骤：样品前处理：样品均质后，加入盐析剂，采用乙腈提取，浓缩后用50％(v/v)甲醇‑水溶液定容，再用乙腈饱和正己烷净化；超高效液相色谱‑四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测，其中，色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18；采用梯度洗脱；配制不同浓度的混合镇静剂类药物标准工作溶液，分别进行质谱检测，得到各镇静剂线性方程及其对应的决定系数；将样品的色谱峰面积代入镇静剂类药物标准工作液的线性议程，得到检测结果。本方法操作简单、精密度高、准确性好，而且适用的镇静剂种类多。

Description

一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法
技术领域
本发明涉及水产品残留药物的检测方法，尤其涉及同时检测水产品中多种镇静剂类药物残留量的方法。
背景技术
镇静剂又称作运动抑制剂，因可防止动物在高密度饲养或长途运输、转群、高温等应激情况下的骚动、外伤、相互啄咬，减少各种应激导致的生产性能下降和产品质量下降，会被人为非法使用，致使镇静剂残留在动物组织中，引发食品安全问题。正常人摄入这类食品后，肝脏负担加重，头脑长期昏沉，记忆受影响，同时运动神经和肌肉功能受到抑制。我国农业部公告(第235号)规定,安眠酮为“禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出”；氯丙嗪、地西泮、塞拉嗪为“允许作治疗使用，但不得在动物性食品中检出的药物”。镇静剂被卫生部列入“食品中可能违法添加的非食用物质名单”。国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、澳大利亚等国家和组织均对镇静剂的检出和最高限量值做出了相关规定。
国内外镇静剂的检测方法有酶联免疫法(ELISA)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱法(LC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱-四级杆飞行时间质谱法(LC-QTOF)[16-19]。ELISA稳定性和重复性较差，假阳性率较高；LC法灵敏度较低,以保留时间定性，不能用于确证方法；GC-MS的灵敏度较好，但前处理时需用固相萃取柱净化，操作步骤繁琐。LC-MS/MS因其具备灵敏度高特异性好的特点，是目前国内外做镇静剂定性定量检测用的比较多的方法。
近年来高分辨质谱开始得到有效应用，如用LC-QTOF测定饲料、牛肉、牛奶和乳制品中的镇静剂。而具有高灵敏度、高选择性和高质量精度的超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)，文献报道有见用于农药残留、降糖药物、多肽类药物、真菌毒素等的测定，尚未见用其分析水产类样品中的镇静剂。申请号201410197253.2公开了一种测定羊肉中残留镇静剂类兽药的方法，该方法虽然记载为高分辨液相色谱－串联质谱法，但其使用液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(LC-MSMS)并不是真正高分辨质谱，该方法适用于同时检测15种镇静剂类药物，种类还不够广泛。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，本方法通过超高效液相色谱－四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测水产品中24种镇静剂残留量，方法操作简单、精密度高、准确性好，而且适用的镇静剂种类多。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，所述镇静剂类药物为艾司唑仑、咪哒唑仑、三唑仑、阿普唑仑、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、去甲西泮、安眠酮、地西泮、劳拉西泮、丙酰二甲基丙吩噻嗪、阿扎哌隆、乙酰丙嗪、氯丙嗪、阿扎派醇、异丙嗪、咔唑心安、塞拉嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇、奋乃静、氟哌利多；检测方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：样品均质后，加入盐析剂，采用乙腈提取，浓缩后用50％(v/v)甲醇-水溶液定容，再用乙腈饱和正己烷净化；
(2)超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测，其中，色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18，流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱：0～15min，95％A；15～17min，5％A；17～17.1min，95％A；17.1～20min，95％A；
(3)配制不同浓度的混合镇静剂类药物标准工作溶液，分别进行步骤(2)，并以各质量浓度为横坐标，响应值的峰面积为纵坐标建立标准曲线，得到各镇静剂线性方程及其对应的决定系数；
(4)将样品的色谱峰面积代入镇静剂类药物标准工作液的线性议程，得到检测结果。
优选地，采用乙腈提取两次。
优选地，所述盐析剂为氯化钠。
优选地，步骤(1)中样品净化后，采用0.22μm的有机系微孔过滤膜进行过滤。
优选地样品处理前处理方法为：
取均质后的样品1.50～2.50g置于50mL聚丙烯离心管中，加入4g氯化钠，涡旋30～40s混匀，加入10mL乙腈，均质1～3min，超声10～15min；以4000～4500r/min的速度离心5～10min后，将上清液转移至另一50mL聚丙烯离心管中；残渣继续加入10mL乙腈，振摇5～10min，离心5～10min，合并二次上清液，涡旋混匀取10mL用平行定量浓缩仪浓缩至近干，用1mL 50％(v/v)甲醇-水溶液定容，加入6mL乙腈饱和的正己烷，以1500～2000r/min的转速涡旋25～30s，超声5～10min，放置10～15min；取1.2mL下层液转移至2mL的高速离心管中，在-20℃冰箱中放置25～30min；将离心机设置为4℃，以14500～15000r/min离心10～15min，取下层液过0.22μm的有机相滤膜，供分析检测。
优选地，步骤(2)中，质谱条件为：HESI离子源；Orbitrap质量分析器；正离子扫描模式；采集方式：全扫描/数据依赖二级扫描，TopN＝1(前1强)，一级扫描分辨率为70000，二级扫描分辨率为17500；归一化碰撞能：20％、40％、60％；喷雾电压：3200V；离子传输管温度：325℃；加热器温度：350℃；鞘气(N2)流速：40Arb；辅助气(N2)流速：10Arb；动态排除：6s；顶点触发：2～6s。
优选地，混合镇静剂类药物标准工作溶液的配制方法如下：
1)配制单组分标准储备液：分别取标准样品地西泮、艾司唑仑、三唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、去甲西泮和安眠酮，用甲醇为溶剂，配制成质量浓度为10μg/mL的单组分标准储备液；劳拉西泮、硝西泮用乙腈为溶剂，配制成质量浓度为10μg/mL的单组分标准储备液；氟哌利多、异丙嗪、氯丙嗪、阿孔哌醇、阿孔哌隆、氟奋乃静、乙酰丙嗪、奋乃近、丙酰丙嗪用甲醇为溶剂，配制成质量浓度为100μg/mL的单组分标准储备液；
2)混合镇静剂类药物标准工作溶液：将步骤1)24种镇静剂分组用甲醇配制成质量浓1μg/mL的混合标准储备液，置于4℃冰箱中避光保存，临用前用50％(v/v)甲醇-水溶液稀释成所需浓度的混合标准工作溶液。
优选地，混合镇静剂类药物标准工作溶液的各级浓度分别为
300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL、0.03125ng/mL。
具体地：奋乃静在0.25-300ng/mL浓度范围的线性方程为y＝6.016×106x+1.002×107，决定系数r2＝0.9999；氟奋乃静在0.25-100ng/mL浓度范围的线性方程为y＝7.862×106x+3.146×106，决定系数r2＝0.9999；氟硝西泮在0.25-200ng/mL浓度范围的线性方程为y＝4.665×106x-8.876×104，决定系数r2＝1；地西泮在0.25-300ng/mL浓度范围的线性方程为y＝7.86×106x+3.886×105，决定系数r2＝1；咪哒唑仑在0.25-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝7.725×106x+8.873×106，决定系数r2＝0.9996；异丙嗪在0.0625-200ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.517×107x+1.562×107，决定系数r2＝0.9999；劳拉西泮在1-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.761×106x+5.65×105，决定系数r2＝0.9991；氯丙嗪在0.125-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.48×107x+3.111×107，决定系数r2＝0.9986；乙酰丙嗪在0.5-200ng/mL浓度范围的线性方程y＝8.09×106x+1.354×107，决定系数r2＝0.9973；硝西泮在0.5-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝3.269×106x+2.517×106，决定系数r2＝0.9994；丙酰二甲基丙吩噻嗪在0.5-200ng/mL浓度范围的线性方程y＝9.708×106x+1.123×107，决定系数r2＝0.9988；三唑仑在0.5-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝3.711×106x+2.158×106，决定系数r2＝0.9988；氟哌利多在0.5-100ng/mL浓度范围的线性方程y＝3.019×106x-1.954×105，决定系数r2＝1；氟哌啶醇在0.25-100ng/mL浓度范围的线性方程y＝6.996×106x+5.111×106，决定系数r2＝0.9976；奥沙西泮在0.5-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝3.079×106x+1.032×106，决定系数r2＝0.9998；安眠酮在0.0625-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.423×107x+1.727×107，决定系数r2＝0.9981；咔唑心安在0.5-100ng/mL浓度范围的线性方程y＝5.79×106x+9.053×105，决定系数r2＝0.9997；艾司唑仑在0.5-300浓度范围的线性方程y＝3.797×106x+6.798×105，决定系数r2＝0.9999；阿普唑仑在0.5-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝4.488×106x+1.055×106，决定系数r2＝0.9999；氯硝西泮在1-200ng/mL浓度范围的线性方程y＝2.581×106x-2.414×105，决定系数r2＝1；阿扎哌醇在0.125-100ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.252×107x+1.136×107，决定系数r2＝0.9968；阿扎哌隆在0.125-100ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.044×107x+8.44×106，决定系数r2＝0.9986；塞拉嗪在0.5-50ng/mL浓度范围的线性方程y＝1.49×107x-4.4×105，决定系数r2＝0.9999；甲西泮在0.25-300ng/mL浓度范围的线性方程y＝5.504×106x+2.12×106，决定系数r2＝0.9998。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的方法用于检测水产品中的镇静剂类药物残留量，特殊的前处理工艺使得可同时多种检测镇静剂类药物残留量，检测种类多达24种，配合使用超高效液相色谱－四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行检测，检测的准确性好；
2、操作方法简单，精密度高，准确性好。
附图说明
图1为空白鲩鱼基质溶液中浓度为10ng/mL的24种镇静剂的提取离子流色谱图；
图2为不同提取液对24种镇静剂回收率的影响；
图3为乙腈、乙酸乙酯对24种镇静剂回收率的影响；
图4为氯化钠、无水硫酸钠和无水硫酸镁对24种镇静剂回收率的影响；
图5为不同氯化钠用量对24种镇静剂回收率的影响；
图6为不同复溶液对24种镇静剂回收率的影响；
图7为实验样品中阳性样品中安眠酮的提取离子流色谱图和质谱图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1
一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，所述镇静剂类药物为艾司唑仑、咪哒唑仑、三唑仑、阿普唑仑、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、去甲西泮、安眠酮、地西泮、劳拉西泮、丙酰二甲基丙吩噻嗪、阿扎哌隆、乙酰丙嗪、氯丙嗪、阿扎派醇、异丙嗪、咔唑心安、塞拉嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇、奋乃静、氟哌利多；检测方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：取均质后的样品1.50～2.50g置于50mL聚丙烯离心管中，加入4g氯化钠，涡旋30～40s混匀，加入10mL乙腈，均质1～3min，超声10～15min；以4000～4500r/min的速度离心5～10min后，将上清液转移至另一50mL聚丙烯离心管中；残渣继续加入10mL乙腈，振摇5～10min，离心5～10min，合并二次上清液，涡旋混匀取10mL用平行定量浓缩仪浓缩至近干，用1mL 50％(v/v)甲醇-水溶液定容，加入6mL乙腈饱和的正己烷，以1500～2000r/min的转速涡旋25～30s，超声5～10min，放置10～15min；取1.2mL下层液转移至2mL的高速离心管中，在-20℃冰箱中放置25～30min；将离心机设置为4℃，以14500～15000r/min离心10～15min，取下层液过0.22μm的有机相滤膜，供分析检测。
(2)超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测，其中，色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18，流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱：0～15min，95％A；15～17min，5％A；17～17.1min，95％A；17.1～20min，95％A；
质谱条件为：HESI离子源；Orbitrap质量分析器；正离子扫描模式；采集方式：全扫描/数据依赖二级扫描，TopN＝1(前1强)，一级扫描分辨率为70000，二级扫描分辨率为17500；归一化碰撞能：20％、40％、60％；喷雾电压：3200V；离子传输管温度：325℃；加热器温度：350℃；鞘气(N2)流速：40Arb；辅助气(N2)流速：10Arb；动态排除：6s；顶点触发：2～6s。
(3)配制不同浓度的混合镇静剂类药物标准工作溶液，分别进行步骤(2)，并以各质量浓度为横坐标，响应值的峰面积为纵坐标建立标准曲线，得到各镇静剂线性方程及其对应的决定系数，不同浓度的混合镇静剂类药物标准工作溶液配制方法如下：
1)配制单组分标准储备液：分别取标准样品地西泮、艾司唑仑、三唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、去甲西泮和安眠酮，用甲醇为溶剂，配制成质量浓度为10μg/mL的单组分标准储备液；劳拉西泮、硝西泮用乙腈为溶剂，配制成质量浓度为10μg/mL的单组分标准储备液；氟哌利多、异丙嗪、氯丙嗪、阿孔哌醇、阿孔哌隆、氟奋乃静、乙酰丙嗪、奋乃近、丙酰丙嗪用甲醇为溶剂，配制成质量浓度为100μg/mL的单组分标准储备液；
2)混合镇静剂类药物标准工作溶液：将步骤1)24种镇静剂分组用甲醇配制成质量浓1μg/mL的混合标准储备液，置于4℃冰箱中避光保存，临用前用50％(v/v)甲醇-水溶液稀释成所需浓度的混合标准工作溶液；
3)取混合镇静剂类药物标准工作溶液配制成浓度分别为300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL、0.03125ng/mL。
(4)将样品的色谱峰面积代入镇静剂类药物标准工作液的线性议程，得到检测结果。
实施例2 不同液相色谱条件的对比
对比了色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)和Thermofisher Accucore RP-MS(100mm×2.1mm，2.6μm)的分离效果，结果发现Waters ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱因粒径小，柱效较高，分离效果更好。流动相A选择含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流动相B选择含0.1％(v/v)甲酸的水溶液，采用梯度洗脱程序。图1为空白鲩鱼基质溶液中浓度为10ng/mL的24种镇静剂的提取离子流色谱图。
实施例3 质谱条件的确定
使用一级质谱全扫描加数据依赖二级质谱扫描方式(Full MS/dd-MS2)(TopN＝1)，对选定的质量数范围(m/z100～1000)做一级质谱全扫描发现母离子，其强度达到设定阈值(1e6)时，自动触发二级质谱扫描。在得到母离子精确质量数的同时，又得到了二级质谱的全扫描信息。采用20％、40％、60％三种不同归一化碰撞能(Stepped(N)CE)对化合物进行碎裂，得到一张碎片离子信息丰富的加合图。进一步调整动态排除(Dynamicexclusion)、顶点触发(Apex trigger)、TopN等参数来获取较好的碎片离子信息。动态排除对比了6s、8s、10s，6s时峰形结果较好。顶点触发为2～6s、TopN＝1时可获得满意的二级碎片离子信息和二级质谱图。
用50％(v/v)甲醇-水溶液，配制浓度为100ng/mL的混合标准溶液，用Full MS/ddMS2(Top1)方式下进行扫描，确定目标物为[M+H]+的准分子离子峰。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数。表1中列出了24种目标化合物的质谱参数，包括母离子的精确质量数、保留时间、每个化合物1～5个碎片离子的精确质量数等。
表1 24种镇静剂的CAS号、质谱参数、线线性围、线性方程和决定系数
Figure BDA0001440351320000081
Figure BDA0001440351320000091
续表1
Figure BDA0001440351320000092
Figure BDA0001440351320000101
实施例4 样品提取液的筛选
本实验将乙腈、含1％(v/v)氨水的乙腈溶液、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、含2％(v/v)氨水的乙腈溶液作为前处理的提取液,对比了24种镇静剂的提取效率。结果显示单独使用乙腈、乙酸乙酯提取效率较高，部分目标物如奥沙西泮、硝西泮、氯硝西泮等，乙酸乙酯提取效率优于乙腈，见图2。
为进一步提高提取效率，分别用乙酸乙酯和乙腈各提取一次，与用乙腈提取二次进行了比较。发现使用乙腈提取二次的整体效果较好，见图3。
实施例5 盐析剂及用量的确定
前处理过程中加入盐析剂有利于有机相与水相分层，防止样品中的水分及杂质进入提取液，提高目标物的回收率。实验对比了常用盐析剂无水硫酸镁、无水硫酸钠和氯化钠，结果发现加入无水硫酸钠时地西泮、奋乃静、氯丙嗪等几种物质回收率明显相对偏低。使用氯化钠或无水硫酸镁，对目标物的回收率影响不大，见图4。综合考虑本实验选择使用氯化钠。
进一步实验对比添加4g、5g、6g氯化钠的效果，结果显示各目标物的添加回收率无显著差异，见图5，最终选择4g氯化钠作为盐析剂。
实施例6 复合溶液的选择
有文献报道使用50％(v/v)甲醇-水溶液、30％(v/v)乙腈-水溶液[19]作为提取液浓缩近干后的复溶液，实验首先对比了50％(v/v)甲醇-水溶液和50％(v/v)乙腈-水溶液对目标物回收率的影响，结果显示使用50％(v/v)甲醇-水溶液的回收率较高。进一步对比了30％、50％、60％三种比例的甲醇-水溶液对于目标物回收率的影响，发现使用50％(v/v)的甲醇-水溶液时，各目标物均可获得较为满意的回收率，见图6。
实施例7 线性方程和定量限
逐级稀释配制不同浓度的混合标准工作溶液：300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL、0.03125ng/mL。在优化的条件下，以各化合物的质量浓度(X，ng/mL)为横坐标，响应值的峰面积(Y)为纵坐标建立标准曲线，得到各化合物的线性范围、线性方程及其对应的决定系数(r2)，见表2。
基质效应(Matrix effect，ME)以目标物在50％(v/v)甲醇-水溶液(B)中与在基质(A)中质量浓度为10ng/mL时仪器的响应比值来表示：ME＝(A-B)/B×100％，负值表示基质减弱效应，正值表示基质增强效应[24]。本文对鲜鲩鱼、墨鱼丸、鲮鱼罐头、盐制鱿鱼干、冰冻南美对虾、面线鱼干进行了基质效应的评估，结果见表2。
高分辨质谱通过提取目标物的精确质量数来进行定量，无法获取空白样品的测量值，不能按GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》通过计算得到测定低限(CL)。同时，因大部分目标化合物色谱图的基线噪音极低，也不适于用信噪比来确定方法得定量限(LOQ)。本方法利用空白基质做加标回收实验，将回收率满足要求的最低加标浓度点作为方法的定量限。
实施例8 回收率与精密度
为验证方法的准确度，分类选取有代表性的空白水产及水产加工品基质——鲜鲩鱼1#、墨鱼丸2#、鲮鱼罐头3#、盐制鱿鱼干4#、冰冻南美对虾5#、面线鱼干6#等进行3个浓度水平的加标回收试验，每个添加水平重复测定6次，目标化合物的回收率在58.9％～122.9％之间，RSD在0.2％～16.4％之间，结果见表2。
表2 24种镇静剂类药物的基质效应、定量限、回收率和相对标准偏差(n＝6)
Figure BDA0001440351320000121
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实施例9 实际样品检测
用建立的方法对市购的46份样品进行了筛查，将发现的疑似阳性样品的称样量加大到5g进行检测，结果在某鱼罐头中检出安眠酮，含量为0.228μg/kg(见图7)。安眠酮易通过胎盘屏障导致畸形、通过乳汁引起新生儿昏睡，同时亦可通过血脑屏障以致中枢神经抑制。长时间摄入残留安眠酮的动物产品，人体可产生耐药性。在农业部公告第193号中，安眠酮被明确列入《禁用清单》。分析在水产加工品中检出镇静剂的原因，可能有以下三种情况：一是环境因素，如养殖水被污染；二养殖户误用含有镇静剂的饲料；三不排除在运输过程中人为添加。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，其特征在于，所述镇静剂类药物为艾司唑仑、咪哒唑仑、三唑仑、阿普唑仑、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、去甲西泮、安眠酮、地西泮、劳拉西泮、丙酰二甲基丙吩噻嗪、阿扎哌隆、乙酰丙嗪、氯丙嗪、阿扎派醇、异丙嗪、咔唑心安、塞拉嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇、奋乃静、氟哌利多；检测方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：样品均质后，加入盐析剂，采用乙腈提取，浓缩后用体积浓度为50％的甲醇-水溶液定容，再用乙腈饱和正己烷净化；
(2)超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测，其中，色谱柱采用ACQUITY UPLC BEH C18，流动相A为含体积浓度为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含体积浓度为0.1％甲酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱：0～15min，95％A；15～17min，5％A；17～17.1min，95％A；17.1～20min，95％A；质谱条件为：HESI离子源；Orbitrap质量分析器；正离子扫描模式；采集方式：全扫描/数据依赖二级扫描，前1强TopN＝1，一级扫描分辨率为70000，二级扫描分辨率为17500；归一化碰撞能：20％、40％、60％；喷雾电压：3200V；离子传输管温度：325℃；加热器温度：350℃；氮气鞘气流速：40Arb；氮气辅助气流速：10Arb；动态排除：6s；顶点触发：2～6s；
(3)配制不同浓度的混合镇静剂类药物标准工作溶液，分别进行步骤(2)，并以各质量浓度为横坐标，响应值的峰面积为纵坐标建立标准曲线，得到各镇静剂线性方程及其对应的决定系数；
(4)将样品的色谱峰面积代入镇静剂类药物标准工作液的线性议程，得到检测结果；
所述样品处理前处理的方法为：
取均质后的样品1.50～2.50g置于50mL聚丙烯离心管中，加入4g氯化钠，涡旋30～40s混匀，加入10mL乙腈，均质1～3min，超声10～15min；以4000～4500r/min的速度离心5～10min后，将上清液转移至另一50mL聚丙烯离心管中；残渣继续加入10mL乙腈，振摇5～10min，离心5～10min，合并二次上清液，涡旋混匀取10mL用平行定量浓缩仪浓缩至近干，用1mL体积浓度为50％的甲醇-水溶液定容，加入6mL乙腈饱和的正己烷，以1500～2000r/min的转速涡旋25～30s，超声5～10min，放置10～15min；取1.2mL下层液转移至2mL的高速离心管中，在-20℃冰箱中放置25～30min；将离心机设置为4℃，以14500～15000r/min离心10～15min，取下层液过0.22μm的有机相滤膜，供分析检测。
2.如权利要求1所述的检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，其特征在于，混合镇静剂类药物标准工作溶液的配制方法如下：
1)配制单组分标准储备液：分别取标准样品地西泮、艾司唑仑、三唑仑、阿普唑仑、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、去甲西泮和安眠酮，用甲醇为溶剂，配制成质量浓度为10μg/mL的单组分标准储备液；劳拉西泮、硝西泮用乙腈为溶剂，配制成质量浓度为10μg/mL的单组分标准储备液；氟哌利多、异丙嗪、氯丙嗪、阿孔哌醇、阿孔哌隆、氟奋乃静、乙酰丙嗪、奋乃近、丙酰丙嗪用甲醇为溶剂，配制成质量浓度为100μg/mL的单组分标准储备液；
2)混合镇静剂类药物标准工作溶液：将步骤1)24种镇静剂分组用甲醇配制成质量浓1μg/mL的混合标准储备液，置于4℃冰箱中避光保存，临用前用体积浓度为50％的甲醇-水溶液稀释成所需浓度的混合标准工作溶液。
3.如权利要求2所述的检测水产品中镇静剂类药物残留量的方法，其特征在于：混合镇静剂类药物标准工作溶液的各级浓度分别为300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL、0.03125ng/mL。
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