JP7299586B2 - 生体試料中のエチルアミン定量法 - Google Patents
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Description
[1] 生体試料中のエチルアミンを定量する方法であって、
(i)前記生体試料中のエチルアミンを誘導体化試薬と反応させる工程、
(ii)液体クロマトグラフィーにより前記生体試料中の誘導体化されたエチルアミンを分離する工程、及び、
(iii)前記(ii)の工程で分離された生体試料に由来する誘導体化されたエチルアミンを質量分析計で分析する工程、
を含む方法。
[2] 前記工程(ii)において、ギ酸アンモニウム、アセトニトリル及びギ酸を含有する移動相を用いる、[1]に記載の方法。
[3] 前記工程(ii)が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を増大させる工程を含む、[2]に記載の方法。
[4] 前記工程(ii)が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を第1のアセトニトリル濃度から第2のアセトニトリル濃度まで増大させる工程を含み、
前記第1のアセトニトリル濃度が0%以上であり、
前記第2のアセトニトリル濃度が30%~70%である、
[2]又は[3]に記載の方法。
[5] 前記工程(ii)が、移動相中でのギ酸アンモニウムの濃度を減少させる工程を含む、[2]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 前記工程(ii)が、移動相中でのギ酸の濃度を0.03%~0.065%まで増大させる工程を含む、[2]~[4]のいずれかに記載の方法。
[7] 前記誘導体化試薬が、オルトフタルアルデヒド、フルオレサミン、ナフタレン-
2,3-ジカルボキシアルデヒド、ダンシルクロリド、3,5-ジニトロベンゾイルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリド、2,3,4,5,6-ペンタフルオロベンジルクロロホルメート、9-フルオレニルメチルクロロホルメート、9-フルオレニルメトキシカルボニルクロリド、3,4-ジヒドロ-6,7-ジメトキシ-4-メチル-3-オキソキノキサリン-2-カルボニルクロリド、6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシニルイミド、4-フルオロ-7-ニトロベンゾフラザン、4-クロロ-7-ニトロベンゾフラザン、フルオレセインイソチオシアネート、7-フルオロ-4-(N,N-ジメチルアミ
ノスルホニル)ベンゾフラザン及び1,2-ナフトキノン-4-スルホナートからなる群
より選択されるいずれかの物質である、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 前記生体試料が、前記工程(i)の前に除タンパク法により前処理される、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 前記質量分析計が、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、磁場偏向型、飛行時間型及び四重極飛行時間ハイブリッド型からなる群より選択されるいずれかのタイプである、[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10] 前記質量分析計により検出されたエチルアミン由来のピーク面積値を内部標準物質由来のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、前記エチルアミンを定量する、[1]~[9]のいずれかに記載の方法。
本明細書において、生体試料として、エチルアミンを含有し得る生体試料であれば限定されないが、例えば、ヒト、サル等の霊長目、イヌ等のネコ目、ブタ等の偶蹄目、ウサギ等の重歯目、マウス若しくはラット等の齧歯目から得られた試料を用いることができる。生体試料の種類は、限定されないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、便、喀痰、精液、涙、鼻汁、膣、鼻、直腸、咽頭並びに尿道のスワブ、排出物、分泌物及びバイオプシー組織試料等が挙げられるが、具体的には、血清、血漿又は尿であることが好ましい。本発明において、生体試料は、採取されたものをそのまま使用することができるが、当業者であれば必要に応じて水や生理食塩水による希釈、ホモジナイズする等、必要に応じて処理を加えて使用することができ、その条件は適宜設定することができる。
生体試料に含まれる夾雑物は、妨害ピークやシグナル強度に対するイオンサプレッションやエンハンスメント(マトリックス効果)の原因となるため、LC-MS/MSで測定する前に、適宜前処理を実施して除去することが望ましい。前処理方法は、生体試料から夾雑物を除去でき、ダンシル化されたエチルアミン及びISがLC-MS/MSで測定できれば特に制限はない。例えば、生体試料から夾雑物を除去する方法として、希釈、濃縮、凍結、融解、加熱、乾燥、破砕、懸濁、滅菌、固形分の除去、除タンパク法、液液抽出法又は固相抽出法等が挙げられる。本発明において、前処理方法は、エチルアミン及びISの分析法として後述する液体クロマトグラフ(以下、単に「LC」と記載することがある)、MSとそれらを使用した分析の諸条件、及び夾雑物の種類等に応じて適宜選択できる。当該前処理方法は、常法に基づいて行うことができる。また、当該前処理は、単独の方法で実施してもよく、適宜複数の方法を組み合わせて実施してもよい。
本発明において、誘導体化反応を実施することで、生体試料中のエチルアミンを高感度かつ選択的に定量することが可能となる。ここでいう誘導体化とは、分析対象であるエチルアミンの分離能の改善や、イオン化効率を高め検出感度を向上させるために実施される
工程であって、当業者であればエチルアミンの構造と性質を考慮して、誘導体化試薬を適宜選択して使用することができる。
メチルアミノスルホニル)ベンゾフラザン及び1,2-ナフトキノン-4-スルホナート
等が知られているが、上述した以外の誘導体化試薬であっても、当業者であれば、誘導体化試薬の特質とエチルアミンの極性、分子量又は(光、熱、酸素、pH等に対する)安定性等の化学的性質測定を考慮し、誘導体化試薬を選択することができる。
誘導体化反応工程として、例えば、工程1により得られた上清に、ダンシルクロリド溶液及びアルカリ性の試薬又は溶液を添加する(工程2)。添加するアルカリ性の試薬としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化ナトリウム等、又はそれらを溶解させた溶液を使用してもよい。具体的には、炭酸水素ナトリウムが好ましい。炭酸水素ナトリウムを添加することで、混合溶液はアルカリ性になり、エチルアミン及びISのダンシル化反応を促進させることができる。添加するアルカリ性の試薬又は溶液の濃度やpH等の条件は、当業者であれば適宜設定することができる。
LCとMSの構成は、ダンシル化されたエチルアミン及びISがLCにより夾雑物から
分離され、MSにより測定できれば特に制限はない。LCとMSは、互いに直列に接続されていてもよいし、それぞれ独立していてもよい。本発明の方法に用いられる装置としては、例えば、LCとMSを直列につないで構成されたLC-MS/MSを用いることができる。LC-MS/MSを用いることにより、LCにより分離されたダンシル化されたエチルアミン及びISを、続けてMSで分析することができる。
本発明の方法においては、工程3により得られたダンシル化されたエチルアミンと、ダンシル化された生体試料由来のエチルアミン以外のアミノ官能基含有化合物を含む夾雑物を液体クロマトグラフィーにより分離する(工程4)。
2種類以上の移動相を組み合わせて使用する場合、総流量に対する各移動相の含有率を適宜変化させてもよい。比率の変化速度は一定であってよく、そうでなくてもよい。また
、比率は増減を繰り返してもよい。アセトニトリル及びギ酸は、分離工程の全期間において移動相に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。変化は、連続的な変化(グラジエント)であってもよく、断続的な変化(ステップワイズ)であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。グラジエント又はステップワイズの条件は、ダンシル化されたエチルアミン及びISの性状や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。
有しない第2の溶液とを、比率を変化させながら混合することで、アセトニトリル及びギ酸の両濃度にグラジエントをかけることができる。第1の溶液としては、例えば、ギ酸そのものやギ酸含有水溶液が挙げられる。第2の溶液としては、アセトニトリルそのものやアセトニトリル含有水溶液が挙げられる。
本発明の方法においては、工程4で分離された生体試料に由来する誘導体化されたエチルアミンを質量分析計で分析する(工程5)。MSによる測定条件は、本明細書の記載及び常法に基づいて、当業者であれば適宜条件を設定できる。
ものではない。
すべての定量実験は、イオン源にESIユニットを用いたLCMS-8050(島津製作所社製)で実施した。LCは、システムコントローラ(CBM-20A)、2台の送液ポンプ(共にLC-30AD)、脱気ユニット(DGU-20A5R)、オートサンプラ(SIL-30ACMP)及びカラムオーブン(CTO-20AC)で構成されたシステムを使用した。このシステムを、LabSolutions LCMS version
5.82 SP1を用いて制御した。
ard Pre-Column(5mm×2.1mm i.d.,1.8μm)のカラム(いずれもWaters社製)を使用し、カラム温度は30℃に設定した。
エチルアミンとISのストック溶液(1mg/mL)を水にて調製した。エチルアミンのストック溶液を水で段階的に希釈し、濃度が2、5、10、25、50、125、200及び250ng/mLのエチルアミン標準溶液を調製した。ISのストック溶液も同様
に水で希釈し、20ng/mLのIS標準溶液を調製した。5、50及び200ng/mLのエチルアミン標準溶液は、測定の精度管理サンプルの調製にも使用した。これらの標準溶液は、使用するまで4℃で保存し、使用時には室温に戻した。
ヒト血清50μL(検量線用試料及び精度管理サンプル調製時には水50μL)を1.5mLのポリプロピレン製チューブに分取し、水10μL(検量線用試料調製時には2、5、10、25、50、125、200及び250ng/mLのエチルアミン標準溶液10μL、精度管理サンプル調製時には5、50及び200ng/mLのエチルアミン標準溶液10μL)、IS標準溶液(20ng/mL)10μL及びメタノール200μLを添加した。ミキサーで5秒間撹拌後、4℃で20,000×gで3分間遠心分離し、上清150μLを別の1.5mLのポリプロピレン製チューブに移した。
本発明により構築したヒト血清中のエチルアミン定量法により、血清中のエチルアミンが正確に測定できる。
本発明により構築したヒト血清中のエチルアミン定量法を用いて、あらかじめ採取後、冷凍保管していたヒト血清1000検体を測定した際のエチルアミン測定値のヒストグラムを図3に示す。その結果、全体の91.0%である910検体でエチルアミン濃度を定量できた。
度に定量することが可能となった。これにより、茶を摂取する習慣と各種疾患の罹患率を調査する後ろ向きコホート研究において、新しい知見が得られる可能性がある。本発明の用途はこれに限らず、茶の効能を調査する研究等での貢献が期待される。
Claims (9)
- 生体試料中のエチルアミンを定量する方法であって、
(i)前記生体試料中のエチルアミンを誘導体化試薬としてダンシルクロリドと反応させる工程、
(ii)液体クロマトグラフィーにより前記生体試料中の誘導体化されたエチルアミンを分離する工程、及び、
(iii)前記(ii)の工程で分離された生体試料に由来する誘導体化されたエチルアミンを質量分析計で分析する工程、
を含む方法。 - 前記工程(ii)において、ギ酸アンモニウム、アセトニトリル及びギ酸を含有する移動相を用いる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(ii)が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を増大させる工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記工程(ii)が、移動相中でのアセトニトリルの濃度を第1のアセトニトリル濃度から第2のアセトニトリル濃度まで増大させる工程を含み、
前記第1のアセトニトリル濃度が0%以上であり、
前記第2のアセトニトリル濃度が30%~70%である、
請求項2又は3に記載の方法。 - 前記工程(ii)が、移動相中でのギ酸アンモニウムの濃度を減少させる工程を含む、請求項2~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(ii)が、移動相中でのギ酸の濃度を0.03%~0.065%まで増大させる工程を含む、請求項2~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体試料が、前記工程(i)の前に除タンパク法により前処理される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記質量分析計が、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、磁場偏向型、飛行時間型及び四重極飛行時間ハイブリッド型からなる群より選択されるいずれかのタイプである、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記質量分析計により検出されたエチルアミン由来のピーク面積値を内部標準物質由来のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、前記エチルアミンを定量する、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
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