CN110873683A - 基于es-dma-cpc的高准确度蛋白质标准物质定值方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于ES‑DMA‑CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，包括如下步骤：1)准备待测目标蛋白；2)待测蛋白样品用乙酸铵缓冲液稀释；3)配制蔗糖溶液，样品通过进样泵注入电喷雾气溶胶发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率纳米柱；使用蔗糖溶液进行液滴尺寸计算；4)将蛋白样品分别通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布；5)线性回归拟合获得单体Cp1和二聚体Cp2的绝对数浓度，然后确定三聚体浓度Cp3；求和来确定待测目标蛋白质样品的原始浓度。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学检测技术领域，特别是涉及一种高准确度蛋白质标准物质定值方法。
背景技术
对通过均匀性、稳定性检验合格样料的特性值进行测量，在标准物质技术领域称为表征化(原文为characterize，即对材料特性进行测量)；由计量权威部门对表征化获得的样料特性的量值进行计量学溯源性(以下简称溯源性)确认和相应测量不确定度评定合理性确认，在标准物质技术领域称为定值(原文为certify，即对测量获得的结果进行认证确认，在其它技术领域一般称为认证)。因此，对有证标准物质的定值，实际上应分为两步：首先是对经过均匀性、稳定性检验合格的样料特性值进行测量，也就是表征化；然后是对测量结果的溯源性和测量不确定度评定的合理性进行有效性确认。
随着生命科学和生物产业的发展，蛋白质标准物质的应用越来越广泛，需求也越来越大。蛋白质含量标准物质被广泛应用于农业、食品、临床等各个领域，蛋白质的准确测量关系到国家安全、大众健康和贸易公平，在临床检验、生物医药等重要领域起着关键作用。面对动态的生命活动过程，识别和测定蛋白质这一复杂的生物大分子，认识其生理功能是非常艰巨的和繁重的工作。蛋白质含量的计量需要建立蛋白质含量相应的量值溯源与传递体系，使得多肽和蛋白质含量测定能够溯源到SI单位，保证蛋白质含量测定的准确、可比。然而，目前蛋白质溯源链较长，定值结果不确定度大，仍需要完善提升已有方法并建立全新的基、标准装置和基、标准方法，降低蛋白质测定结果的不确定度。
IDMS是应用稳定同位素进行化学分析的一种方法，在测定蛋白质含量时，该方法将一定量的同位素标记化合物添加到样品中，这些同位素标记化合物可以是同位素标记的元素、氨基酸、肽段或蛋白质。待同位素与样品混合均匀后进行水解或酶解的操作，再通过质谱技术检测反应后非标记物和标记物的比例，由此对蛋白质进行准确定量。该方法现在是蛋白质标准物质定值的主要技术手段之一。同位素稀释质谱测定过程中需要将蛋白质分解成小分子如氨基酸或者肽段以后进行测定，在水解或者酶解过程中，可能引入一定的不确定度。同位素稀释质谱法依赖于氨基酸、肽段标准物质进行SI溯源，溯源链较长，无法直接溯源到SI单位。
另外，对于大分子量、结构复杂的蛋白质，很难将其完全水解或酶切成小分子，因此对于这类蛋白质同位素稀释质谱法定量精度不足，误差较大。
因此，建立一种能够不依赖内标、外标，可直接对目标蛋白进行准确定量的标准物质定值方法，特别是提升对于结构复杂、大分子量蛋白质定量研究能力是十分必要和迫切的。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，在测定蛋白质含量过程中不依赖于蛋白质标准品，提高了大分子量、结构复杂蛋白质的准确定量能力，同时测定结果可以直接溯源到SI单位，可以为蛋白质标准物质准确定值。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
电喷雾-差分电迁移率-粒子计数技术(ES-DMA-CPC)主要由三部分仪器完成，包括电喷雾气溶胶发生器(ES)、差分电迁移率分析仪(DMA)和凝结核颗粒计数器(CPC)，此外，电喷雾气溶胶发生器与差分电迁移率分析仪之间通常加入一个电荷中和器(如Po-210)来平衡粒子的电荷分布，使得90％以上的液滴仅带上一个单电荷，从而使粒子在DMA中发生迁移时，仅与粒子的大小有关。
如图1所示，ES-DMA-CPC技术主要包括连续的两步：
一、样品溶液在电喷雾离子源作用下形成气溶胶颗粒。在干燥气体的作用下所产生的带电液滴在飞行过程中溶剂不停蒸发、体积越来越小，根据电荷残余机制，当溶剂完全蒸发之后，剩下的溶质即待分析样品和电荷最终形成气相离子进入DMA分析器中。
二、带电粒子先后进入DMA和CPC，最终获得粒径分布。DMA是根据粒子电迁移率即大小与电荷之比从而获得粒子电迁移率分布的重要工具，相当于粒子分选器。它由轴对称的两个圆柱构成，内柱施加一个负向电压，干燥气从上往下通过内外柱之间，当带电的气溶胶颗粒从靠近外柱的进口进入，由于受到电场力和静电力的作用，气溶胶颗粒将发生迁移穿过内外柱间隙再从内柱下方端口进入内柱。CPC是一个高灵敏度的粒子计数器，最低可以检测到大约2.5nm的粒子，CPC测得的是气相粒子的密度(即每立方厘米包含的粒子总数目)，从而将DMA的测得的粒子平均迁移率转化为粒径分布。
本发明提供的基于ES-DMA-CPC高准确度蛋白质标准物质定值方法，所述蛋白质标准物质为纯度大于95％的蛋白质纯品，为溶液或者固体粉末；具体包括以下步骤：
(1)准备待测目标蛋白；
(2)待测的蛋白样品用乙酸铵缓冲液进行稀释：待测的蛋白样品用乙酸铵缓冲液(20mmol/L，pH＝7)进行稀释，稀释方法为首先将目标蛋白溶液稀释到100ug/ml，然后再按照2×，4×，10×，20×将100ug/ml的目标蛋白溶液分别稀释成4个浓度梯度；蛋白稀释度可根据蛋白的原始浓度进行调整，需保证稀释的最低浓度在电喷雾-差分电迁移率-粒子计数分析中可见二聚体形式。
(3)配制蔗糖溶液，将样品通过进样泵注入电喷雾气溶胶发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率纳米柱；使用蔗糖溶液进行液滴尺寸计算；
其中，Dd是液滴直径，Ds是干燥的蔗糖颗粒直径，通过电喷雾-差分电迁移率-粒子计数进行测量；Cs是溶液中已知的蔗糖浓度(V/V)；
液滴尺寸计算的测量采用0.063％(v/v)的蔗糖溶液，蔗糖样品采用纯度大于99％的蔗糖分析纯试剂配置；所述0.063％(v/v)的蔗糖溶液由10％(v/v)的蔗糖溶液稀释并过滤制备而成。
(4)将配置的蛋白样品分别通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布；蛋白样品呈现单体，二聚体和三聚体的粒径分布；
将步骤(2)中配置的5个浓度的蛋白质样品溶液通过电喷雾-差分电迁移率-粒子计数，测量得到每个稀释度蛋白溶液的单体、二聚体以及三聚体粒径分布，根据二聚体、单体的粒径分布数之比No2/No1，与溶液稀释度1/2m之间的关系，绘制线性关系曲线。
(5)根据电喷雾-差分电迁移率-粒子计数对蛋白样品的单体和二聚体以及三聚体的测量以及液滴尺寸的测量；根据泊松分布，可以通过线性回归拟合获得单体Cp1和二聚体Cp2的绝对数浓度，二聚体数No2与单体数No1之比与溶液中蛋白质浓度之间的关系如式2所示，然后使用式3确定三聚体浓度Cp3；通过求和来确定待测目标蛋白质样品的原始浓度，参照式4；
其中，m是稀释因子；Cp1和Cp2分别是溶液中的固有单体和二聚体蛋白质数量浓度；对于式2，不同稀释度下，观察到的No2/No1与1/2m的线性关系曲线产生斜率VdCpl和截距Cp2/Cp1；因此，液滴尺寸已知，斜率直接可以计算测量出原始溶液中蛋白质单体浓度。然后从截距中计算得出二聚体浓度。单体浓度和二聚体浓度得到确定，通过在每个稀释度中测量得到的三聚体数(No3)与单体数(No1)的比值(No3/No1)即可计算出三聚体浓度Cp3(式3)。
因此，根据ES-DMA对单体和二聚体(No1，No2)的测量和液滴尺寸的测量，可以通过线性回归拟合获得单体Cp1和二聚体Cp2的绝对数浓度，然后使用式3确定三聚体浓度Cp3。因此总浓度可以通过求和来确定(式4)。
Cp＝Cp1+2Cp2+3Cp3 (4)
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)本发明基于电喷雾-差分电迁移率-粒子计数的蛋白质标准物质定值方法在测定过程中不依赖任何标准品，直接对蛋白质样品的浓度进行测定；
(2)本发明方法得到的蛋白质含量测定结果可以直接溯源到SI单位；
(3)本发明方法不需要对蛋白质样品进行酶切、水解等前处理，结果受小分子杂质、不同来源杂蛋白的干扰小，提升了对大分子量、结构复杂蛋白质的准确定量能力。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的高准确度蛋白质标准物质定值方法作进一步说明。
附图说明
图1为ES-DMA-CPC技术的实验流程示意图。
具体实施方式
一、实验仪器与试剂：
电喷雾气溶胶颗粒发生器(美国TSI公司，型号3482)；静电分级器(美国TSI公司，型号3082)；纳米水基凝聚核粒子计数器(美国TSI公司，型号3788)；二氧化硅毛细管(内径25μm，长度4.1cm，美国TSI公司)；FLOW-EZ微流体恒流泵(法国Fluigent公司)。
蔗糖(D-(+)-蔗糖，纯度99.9％，美国Sigma)；乙酸铵(色谱级，纯度≥99.0％，德国Honerwell)；牛血清白蛋白溶液标准物质(中国计量科学研究院)；实验用水为超纯水。
二、样品准备和标准溶液配制：
取适量乙酸铵配制成20mmol/L缓冲液，过滤并调节pH为7。0.063％(v/v)的蔗糖溶液由10％(v/v)蔗糖溶液稀释配置而成，并过滤制备。牛血清白蛋白溶液通过缓冲液稀释为1×，2×，4×，10×，20×不同浓度梯度的样品溶液。
三、实验条件及参数：
首先将样品通过FLOW-EZ微流体恒流泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过DMA纳米柱，最终CPC获得粒子的总数。干燥的空气和二氧化碳气体作为载气。微流体恒流泵进样速度设置为恒流模式，流速设定为200nl/min。DMA鞘流流速设定为6L/min，CPC取样流速设定为0.6L/min。DMA直径扫描范围设定为相应的扫描范围(3.16-107.5nm)。
四、蛋白质浓度绝对定量：
(1)液滴尺寸计算：
通过使用体积浓度为0.063％(v/v)的蔗糖溶液来评估确定原始液滴的尺寸：
D代表液滴直径，Ds代表干燥的的蔗糖颗粒直径(ES-DMA测量得到)，Cs代表已知的体积浓度的蔗糖溶液(本实验中Cs＝0.063％)。
(2)BSA定量结果：
因为只观察到固有的单体、二聚体和三聚体，所以蛋白定量计算截止至三聚体。根据泊松分布的分析，根据“观察到的”单体和二聚体(No1，No2)的测量和液滴尺寸的测量，可以通过线性回归拟合(式2)获得本征单体Cp1和内在二聚体Cp2的绝对数浓度。然后使用式3确定内在三聚体浓度Cp3。总浓度可以通过式4求和来确定。
Cp＝Cp1+Cp2+Cp3 (4)
如表1，通过连续的牛血清白蛋白溶液实验分析，得到的BSA平均浓度69.52±1.8g/L。
表1 BSA定量结果
采用牛血清白蛋白溶液标准物质(中国计量科学研究院)作为标准，评估该方法的可行性和准确性。从得到的牛血清白蛋白溶液定量结果与标准物质的浓度69.4g/L(U＝4.6g/L，k＝2)相比较，结果相符。牛血清白蛋白标准物质是由同位素稀释质谱法定值完成，由此可见，本方法可实现对蛋白质标准物质准确定值。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)准备待测目标蛋白；
(2)待测的蛋白样品用乙酸铵缓冲液进行稀释；
(3)配制蔗糖溶液，将样品通过进样泵注入电喷雾气溶胶发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率纳米柱；使用蔗糖溶液进行液滴尺寸计算；
其中，Dd是液滴直径，Ds是干燥的蔗糖颗粒直径，通过电喷雾-差分电迁移率-粒子计数进行测量；Cs是溶液中已知的蔗糖浓度(V/V)；
(4)将配置的蛋白样品分别通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布；蛋白样品呈现单体，二聚体和三聚体的粒径分布；
(5)根据电喷雾-差分电迁移率-粒子计数对蛋白样品的单体和二聚体以及三聚体的测量以及液滴尺寸的测量；根据泊松分布，可以通过线性回归拟合获得单体Cp1和二聚体Cp2的绝对数浓度，二聚体数No2与单体数No1之比与溶液中蛋白质浓度之间的关系如式2所示，然后使用式3确定三聚体浓度Cp3；通过求和来确定待测目标蛋白质样品的原始浓度，参照式4；
其中，m是稀释因子；Cp1和Cp2分别是溶液中的固有单体和二聚体蛋白质数量浓度；对于式2，不同稀释度下，观察到的No2/No1与1/2m的线性关系曲线产生斜率VdCp1和截距Cp2/Cp1；
Cp＝Cp1+2Cp2+3Cp3(4)
2.根据权利要求1所述的基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于：所述蛋白质标准物质为纯度大于95％的蛋白质纯品，为溶液或者固体粉末。
3.根据权利要求2所述的基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(2)中，待测的蛋白样品用乙酸铵缓冲液(20mmol/L，pH＝7)进行稀释，稀释方法为首先将目标蛋白溶液稀释到100ug/ml，然后再按照2×，4×，10×，20×将100ug/ml的目标蛋白溶液分别稀释成4个浓度梯度。
4.根据权利要求3所述的基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于：蛋白稀释度可根据蛋白的原始浓度进行调整，需保证稀释的最低浓度在电喷雾-差分电迁移率-粒子计数分析中可见二聚体形式。
5.根据权利要求4所述的基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(3)中，液滴尺寸计算的测量采用0.063％(v/v)的蔗糖溶液，蔗糖样品采用纯度大于99％的蔗糖分析纯试剂配置。
6.根据权利要求5所述的基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于：所述0.063％(v/v)的蔗糖溶液由10％(v/v)的蔗糖溶液稀释并过滤制备而成。
7.根据权利要求6所述的基于ES-DMA-CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将步骤(2)中配置的5个浓度的蛋白质样品溶液通过电喷雾-差分电迁移率-粒子计数，测量得到每个稀释度蛋白溶液的单体、二聚体以及三聚体粒径分布，根据二聚体、单体的粒径分布数之比No2/No1，与溶液稀释度1/2m之间的关系，绘制线性关系曲线。
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