JP2003532115A - ヒト身体または動物身体由来の液体サンプルのタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に分析するための方法およびデバイス - Google Patents
ヒト身体または動物身体由来の液体サンプルのタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に分析するための方法およびデバイスInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒトまたは動物の身体に由来する液体サンプルのタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンの定性的および／または定量的分析のための方法に関する。この液体サンプルのタンパク質およびペプチドは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでインターフェースを介してそれに接続された質量分析計に分析のために移動される。本発明はまた、ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプル中のタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンの定性的および／または定性的決定のためのデバイスに関する。
Description
【０００１】
本発明は、請求項１に記載の方法および請求項８に記載のデバイスに関する。
【０００２】
ヒトおよび動物の身体機能は、非常に複雑かつ正確に制御されている。この制
御は、とりわけ血清を通るタンパク質およびペプチドにより達成される。
御は、とりわけ血清を通るタンパク質およびペプチドにより達成される。
【０００３】
サイトカインは、ここで決定的な役割を果たす。サイトカインは、細胞により
血液または周囲の組織中に分泌され、そして特定のレセプターへの結合の後に他
の細胞の分裂、成長または増殖のような機能に影響を及ぼすポリペプチドである
。サイトカインは、とりわけ、免疫系の細胞の複雑な相互作用を調節する。
血液または周囲の組織中に分泌され、そして特定のレセプターへの結合の後に他
の細胞の分裂、成長または増殖のような機能に影響を及ぼすポリペプチドである
。サイトカインは、とりわけ、免疫系の細胞の複雑な相互作用を調節する。
【０００４】
サイトカインはまた、いわゆるインターロイキンを包含する。インターロイキ
ンは、免疫系の媒介物質であり、低濃度で白血球により産生され、そして免疫系
の細胞の成長、分化および活性に影響を及ぼす。
ンは、免疫系の媒介物質であり、低濃度で白血球により産生され、そして免疫系
の細胞の成長、分化および活性に影響を及ぼす。
【０００５】
ヒト身体または動物身体の機能および状態を決定するために、ヒトまたは動物
の身体由来の液体サンプルのタンパク質および／またはペプチドの、定性的測定
および／または定量的測定が必要である。
の身体由来の液体サンプルのタンパク質および／またはペプチドの、定性的測定
および／または定量的測定が必要である。
【０００６】
酵素免疫アッセイの使用は、液体サンプル中のヒト身体または動物身体の個々
のタンパク質またはペプチドの定性的測定および／または定量的測定に関して公
知である。本質的に、抗原−抗体反応は、酵素反応と関連しており、この場合、
抗体−酵素結合体または抗原−酵素結合体が使用され、適切な基質を添加した後
に、結合体の酵素活性を測定することにより決定する。
のタンパク質またはペプチドの定性的測定および／または定量的測定に関して公
知である。本質的に、抗原−抗体反応は、酵素反応と関連しており、この場合、
抗体−酵素結合体または抗原−酵素結合体が使用され、適切な基質を添加した後
に、結合体の酵素活性を測定することにより決定する。
【０００７】
一般的に、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）の固相技術が使用
され、この場合、抗原は直接的吸着または別の抗体のいずれかにより固相に結合
している。
され、この場合、抗原は直接的吸着または別の抗体のいずれかにより固相に結合
している。
【０００８】
いくつかのタンパク質およびペプチドは、今日では、医療臨床試験の一部とし
て定性的かつ／または定量的に決定される。
て定性的かつ／または定量的に決定される。
【０００９】
タンパク質およびペプチド、ならびに液体サンプル（特に血清）中のそれらの
濃度を正確に知ることは、医療臨床試験において重要性を増している。
濃度を正確に知ることは、医療臨床試験において重要性を増している。
【００１０】
ヒトまたは動物の身体の状態が、タンパク質および／またはペプチドのパター
ンを使用して比較的良好に説明され得ることが、見出された。
ンを使用して比較的良好に説明され得ることが、見出された。
【００１１】
しかし、過去に実施されてきたＥＬＩＳＡ法の１つの欠点は、１種類のタンパ
ク質またはペプチドのみしか１度に決定できないことである。従って、可能なタ
ンパク質および／またはペプチドの最も完全なパターンを得るためには、複数の
タンパク質および／またはペプチドが、個々に決定されなければならない。
ク質またはペプチドのみしか１度に決定できないことである。従って、可能なタ
ンパク質および／またはペプチドの最も完全なパターンを得るためには、複数の
タンパク質および／またはペプチドが、個々に決定されなければならない。
【００１２】
さらに、多くのタンパク質またはペプチドは、検出に必要な試薬（例えば、特
異的抗体）が全く利用可能でないために、決定され得ない。
異的抗体）が全く利用可能でないために、決定され得ない。
【００１３】
測定数が少ないために、ヒトまたは動物の身体の状態に関する関連した結論を
導き出すことは困難である。
導き出すことは困難である。
【００１４】
特に、医療臨床試験は、液体サンプル採取の数時間後まで利用できず、その結
果、ヒトまたは動物身体の状態に関する正確な情報を得ることができない。
果、ヒトまたは動物身体の状態に関する正確な情報を得ることができない。
【００１５】
従って、ＥＬＩＳＡ法を用いて、包括的でありかつ従って関連性のあるタンパ
ク質パターンおよびペプチドパターンを導き出すことは、不可能である。
ク質パターンおよびペプチドパターンを導き出すことは、不可能である。
【００１６】
ＥＬＩＳＡ法の別の欠点は、種々の既知のタンパク質またはペプチドの濃度の
サンプル（いわゆる、標準）の比較測定が、未知の液体サンプル中の個々のタン
パク質またはペプチドの濃度を決定するために必要である。これらの測定はまた
、時間がかかり、費用が高い。なぜならば、１種類のタンパク質またはペプチド
しか１度に決定できないからである。
サンプル（いわゆる、標準）の比較測定が、未知の液体サンプル中の個々のタン
パク質またはペプチドの濃度を決定するために必要である。これらの測定はまた
、時間がかかり、費用が高い。なぜならば、１種類のタンパク質またはペプチド
しか１度に決定できないからである。
【００１７】
従って、ヒトまたは動物身体由来の液体サンプル中のタンパク質またはペプチ
ドパターンの決定に利用可能でありかつ使用される従来の分析方法は、十分に満
足できるものではあり得ない。
ドパターンの決定に利用可能でありかつ使用される従来の分析方法は、十分に満
足できるものではあり得ない。
【００１８】
本発明の目的は、ヒトまたは動物身体由来の液体サンプル中のタンパク質パタ
ーンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に決定する
ための方法であって、これらのタンパク質およびペプチドの完全かつ迅速な決定
を可能にする方法を提供することである。
ーンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に決定する
ための方法であって、これらのタンパク質およびペプチドの完全かつ迅速な決定
を可能にする方法を提供することである。
【００１９】
この目的は、請求項１に記載の特徴を有する方法、および請求項８に記載の特
徴を有するデバイスにより達成される。さらに詳細な有利な実施形態が、従属請
求項から導かれる。
徴を有するデバイスにより達成される。さらに詳細な有利な実施形態が、従属請
求項から導かれる。
【００２０】
ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプル中のタンパク質パターンおよび／ま
たはペプチドパターンを定性的および／または定量的に決定するための、本発明
による方法において、液体サンプル中のタンパク質および／またはペプチドは、
キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラ
インでインターフェースを介して、それらに接続される質量分析計に、検出のた
めに移動される。
たはペプチドパターンを定性的および／または定量的に決定するための、本発明
による方法において、液体サンプル中のタンパク質および／またはペプチドは、
キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラ
インでインターフェースを介して、それらに接続される質量分析計に、検出のた
めに移動される。
【００２１】
複雑なマトリックス（例えば、ヒトまたは動物の体液により形成される）中の
タンパク質および／またはペプチドの、信頼性のある定性的および／または定量
的な決定は、最初に物質の分離方法の使用を必要とする。キャピラリー電気泳動
は、この場合に適切な分離方法であることが証明されている。
タンパク質および／またはペプチドの、信頼性のある定性的および／または定量
的な決定は、最初に物質の分離方法の使用を必要とする。キャピラリー電気泳動
は、この場合に適切な分離方法であることが証明されている。
【００２２】
電気泳動分離の原理は、電場が印加された場合の、溶液中の荷電した粒子の異
なる移動特性に基づく。キャピラリーの利点は、表面対体積の好都合な比であり
、これにより、電流により生じるジュール熱の良好な除去が可能になる。次いで
、これにより、高電圧（通常３０ｋＶまで）を印加することが可能になり、従っ
て、分離の高効率性および短い分析時間が可能になる。
なる移動特性に基づく。キャピラリーの利点は、表面対体積の好都合な比であり
、これにより、電流により生じるジュール熱の良好な除去が可能になる。次いで
、これにより、高電圧（通常３０ｋＶまで）を印加することが可能になり、従っ
て、分離の高効率性および短い分析時間が可能になる。
【００２３】
高効率の分離は、液体サンプル中の完全なタンパク質パターンおよび／または
ペプチドパターンの決定を可能にする。短い分析時間は、その液体サンプルに基
づいて、ヒトまたは動物身体の状態に関する正確な情報を可能にする。
ペプチドパターンの決定を可能にする。短い分析時間は、その液体サンプルに基
づいて、ヒトまたは動物身体の状態に関する正確な情報を可能にする。
【００２４】
キャピラリー電気泳動の補助により、中性の分子、カチオンおよびアニオンを
分離することが可能である。中性の粒子は、電流が印加される場合、電気−浸透
流の速度で移動し、カチオンは、カソードに向かって加速され、そしてアニオン
は停滞する。
分離することが可能である。中性の粒子は、電流が印加される場合、電気−浸透
流の速度で移動し、カチオンは、カソードに向かって加速され、そしてアニオン
は停滞する。
【００２５】
キャピラリー電気泳動により分離されたタンパク質の検出のために、キャピラ
リー電気泳動デバイスは、質量分析計に接続される。
リー電気泳動デバイスは、質量分析計に接続される。
【００２６】
質量分析計は、高真空における遊離イオンの分子量を決定することを可能にす
る。質量分析計は、質量分析器（イオンの質量／電荷の商（ｍ／ｚ）に従ってそ
のイオンを分離する）および検出器を備える。
る。質量分析計は、質量分析器（イオンの質量／電荷の商（ｍ／ｚ）に従ってそ
のイオンを分離する）および検出器を備える。
【００２７】
適切な変換器（いわゆるインターフェース）が提供される。なぜならば、イオ
ン化は、大気圧で起こるが、試料分析は高真空を必要とするからである。
ン化は、大気圧で起こるが、試料分析は高真空を必要とするからである。
【００２８】
質量分析法により、１０ｆｍｏｌのペプチドおよび／または小タンパク質（す
なわち、１０ｋＤａのタンパク質の０．１ｎｇ）を、複雑な混合物から±０．０
１％の精度で慣用的に測定することが可能である。０．１ｆｍｏｌ未満の量でさ
え、実験的に測定された。
なわち、１０ｋＤａのタンパク質の０．１ｎｇ）を、複雑な混合物から±０．０
１％の精度で慣用的に測定することが可能である。０．１ｆｍｏｌ未満の量でさ
え、実験的に測定された。
【００２９】
従って、この方法は、ヒトまたは動物の身体由来の複雑な液体サンプルを分析
して、特定のタンパク質およびペプチドの存在を検出するために特に適切である
。
して、特定のタンパク質およびペプチドの存在を検出するために特に適切である
。
【００３０】
特に、血清または尿は、液体サンプルとして使用される。
【００３１】
血清または尿は、ヒト身体由来であり、かつヒトまたは動物の身体の状態に関
する情報を得るために特に適切であるタンパク質および／またはペプチドの組成
を有する、液体サンプルである。
する情報を得るために特に適切であるタンパク質および／またはペプチドの組成
を有する、液体サンプルである。
【００３２】
質量分析法による分析は、本発明において従来の方法にまさる利点を有する。
この利点は、血清または尿の多数（＞１００）のペプチドおよびタンパク質の濃
度が、単一の分析により決定され得ることである。さらに、ヒトまたは動物の身
体の状態を示すまだ未知のタンパク質またはペプチドを同定することが可能であ
る。
この利点は、血清または尿の多数（＞１００）のペプチドおよびタンパク質の濃
度が、単一の分析により決定され得ることである。さらに、ヒトまたは動物の身
体の状態を示すまだ未知のタンパク質またはペプチドを同定することが可能であ
る。
【００３３】
本発明の方法は、伝統的な決定方法と比較した場合に、いくつかのタンパク質
および／またはペプチドを決定するために、単一の操作しか必要としないという
結果を達成する。このことは、時間と費用の両方を節約する。
および／またはペプチドを決定するために、単一の操作しか必要としないという
結果を達成する。このことは、時間と費用の両方を節約する。
【００３４】
得られた質量スペクトルは、ヒトまたは動物の身体の全体的な状態を記載する
「フィンガープリント」の型として使用され得る。特に、この質量スペクトルの
特定の領域のみを分析することも可能である。
「フィンガープリント」の型として使用され得る。特に、この質量スペクトルの
特定の領域のみを分析することも可能である。
【００３５】
しかし、第２に、タンパク質を個々に同定すること、ならびにこれらのタンパ
ク質の存在、非存在および濃度に基づいて、ヒトまたは動物の身体の状態に関す
る結果を導き出すことも可能である。
ク質の存在、非存在および濃度に基づいて、ヒトまたは動物の身体の状態に関す
る結果を導き出すことも可能である。
【００３６】
さらに、タンパク質パターンおよびペプチドパターン（例えば、サイトカイン
のパターン、特にインターロイキンのパターン）が決定されるということもまた
提供される。
のパターン、特にインターロイキンのパターン）が決定されるということもまた
提供される。
【００３７】
現在利用可能な情報によると、これらのタンパク質は、ヒトおよび動物の身体
の機能を調節する、不可欠なタンパク質である。
の機能を調節する、不可欠なタンパク質である。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態により、液体サンプルをキャピラリー電気泳動によ
り分離する前に最初に酸性化すること、それを精製して望ましくない粒子を超遠
心分離により除去すること、および／またはそれを限外ろ過により特定の分子サ
イズのタンパク質もしくはペプチドを含有する画分に分割することが提供される
。
り分離する前に最初に酸性化すること、それを精製して望ましくない粒子を超遠
心分離により除去すること、および／またはそれを限外ろ過により特定の分子サ
イズのタンパク質もしくはペプチドを含有する画分に分割することが提供される
。
【００３９】
酸性化（例えば、ギ酸を用いてｐＨ３まで）した後に、サンプルの所望でない
不溶性の成分を超遠心分離により分離することが可能である。液体サンプルの分
画により、例えば、ヒトまたは動物の身体の状態を記述するのに必要とされる特
定の分子量のタンパク質および／またはペプチドの画分のみが分析されるという
結果が得られる。
不溶性の成分を超遠心分離により分離することが可能である。液体サンプルの分
画により、例えば、ヒトまたは動物の身体の状態を記述するのに必要とされる特
定の分子量のタンパク質および／またはペプチドの画分のみが分析されるという
結果が得られる。
【００４０】
次いで、＜３ｋＤａ、３〜３０ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａおよび＞５０ｋＤａ
の分子量のタンパク質および／またはペプチドから構成される画分が提供される
。
の分子量のタンパク質および／またはペプチドから構成される画分が提供される
。
【００４１】
例えば、サイトカインのグループに属するインターロイキン（主に１７ｋＤａ
〜２６ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質を含む）が決定される場合、３〜３
０ｋＤａの分子量を有するタンパク質および／またはペプチド由来の画分を使用
すれば十分である。またこれにより分析時間が短縮され得る。
〜２６ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質を含む）が決定される場合、３〜３
０ｋＤａの分子量を有するタンパク質および／またはペプチド由来の画分を使用
すれば十分である。またこれにより分析時間が短縮され得る。
【００４２】
さらに、タンパク質および／またはペプチドが、分離された直後でかつイオン
化される前に検出されることが可能である。
化される前に検出されることが可能である。
【００４３】
キャピラリー電気泳動により分離されたタンパク質および／またはペプチドの
検出のための数多くの方法が、既に公知であるが、サンプルの良好な定量的およ
び定量的な分析が可能となるのは、例外的な場合のみである。
検出のための数多くの方法が、既に公知であるが、サンプルの良好な定量的およ
び定量的な分析が可能となるのは、例外的な場合のみである。
【００４４】
従って、提案された検出方法は、質量分析法と組み合わせた場合にのみ、タン
パク質および／またはペプチドのより正確な決定に適切である。
パク質および／またはペプチドのより正確な決定に適切である。
【００４５】
本発明の有利な実施形態は、エレクトロスプレーイオン化法を、タンパク質お
よび／またはペプチドのイオン化に使用する。
よび／またはペプチドのイオン化に使用する。
【００４６】
このようにして、溶液中の分子は、とりわけ高電圧（１〜８ｋＶ）の影響下で
スプレーされて、最初に小荷電粒子を形成し、この粒子が溶媒の蒸発に起因して
より小さくなる。最後に、遊離の気体イオンが形成される。
スプレーされて、最初に小荷電粒子を形成し、この粒子が溶媒の蒸発に起因して
より小さくなる。最後に、遊離の気体イオンが形成される。
【００４７】
エレクトロスプレーイオン化は、比較的低いレベルのエネルギーが分子に作用
するので、温和なイオン化技術である。その結果、感受性の分子でさえ、そして
非共有結合凝集体でさえある程度は、分解することなく質量分析器に進入する。
するので、温和なイオン化技術である。その結果、感受性の分子でさえ、そして
非共有結合凝集体でさえある程度は、分解することなく質量分析器に進入する。
【００４８】
エレクトロスプレーイオン化法において主として分子フラグメントが形成され
ることがないということは、有利である。このことは、分子構造の解明をより困
難にするが、液体サンプル中に溶解したタンパク質および／またはペプチドの非
常に良好な同定を可能にする。
ることがないということは、有利である。このことは、分子構造の解明をより困
難にするが、液体サンプル中に溶解したタンパク質および／またはペプチドの非
常に良好な同定を可能にする。
【００４９】
それにもかかわらずイオン化で得られたフラグメントを使用して、より小さい
ペプチド（例えば、２０未満アミノ酸を含むオリゴペプチド）の場合のアミノ酸
配列の同定を有利にし得る。
ペプチド（例えば、２０未満アミノ酸を含むオリゴペプチド）の場合のアミノ酸
配列の同定を有利にし得る。
【００５０】
さらに、いわゆる飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計を質量分析計として使用す
ることも可能である。
ることも可能である。
【００５１】
ＴＯＦ質量分析計の場合には、特定の加速電圧が印加され、等しい大きさの運
動エネルギーをイオンに付与する。次いで、それぞれのイオンが飛行管を通って
特定のドリフト距離を移動するのに必要な時間が、高精度で測定される。なぜな
らば、同じ運動エネルギーのイオンの速度は、その質量に依存するからである。
動エネルギーをイオンに付与する。次いで、それぞれのイオンが飛行管を通って
特定のドリフト距離を移動するのに必要な時間が、高精度で測定される。なぜな
らば、同じ運動エネルギーのイオンの速度は、その質量に依存するからである。
【００５２】
飛行時間型質量分析計は、非常に速いスキャン速度を有し、従って、非常に良
好な分解能を達成する。これにより、液体サンプル中に存在するタンパク質およ
び／またはペプチドの完全な同定が可能になる。
好な分解能を達成する。これにより、液体サンプル中に存在するタンパク質およ
び／またはペプチドの完全な同定が可能になる。
【００５３】
本発明はまた、ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプル中のタンパク質パタ
ーンおよび／またはペプチドパターンの定性的および／または定性的決定のため
のデバイスに関する。
ーンおよび／またはペプチドパターンの定性的および／または定性的決定のため
のデバイスに関する。
【００５４】
このデバイスは、キャピラリー電気泳動デバイス、イオン化ユニット、質量分
析計（インターフェースを介して接続されている）およびコンピュータユニット
を備える。このコンピュータユニットは、デバイスを制御するため、ならびに測
定値の自動分析および記憶のため、ならびに新しく測定された値を既に記憶され
た測定値と比較するためのプログラムを有する。
析計（インターフェースを介して接続されている）およびコンピュータユニット
を備える。このコンピュータユニットは、デバイスを制御するため、ならびに測
定値の自動分析および記憶のため、ならびに新しく測定された値を既に記憶され
た測定値と比較するためのプログラムを有する。
【００５５】
このようなデバイスにより、複雑なマトリックス中のタンパク質および／また
はペプチドの確実な決定を可能にする。
はペプチドの確実な決定を可能にする。
【００５６】
従って、キャピラリー電気泳動デバイスは、高い分離効率を有し、液体サンプ
ルの完全なタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンの決定を可能に
し、そしてまた、短い分析時間を有し、液体サンプルが得られたヒトまたは動物
の身体の状態に関する正確な情報を提供する。
ルの完全なタンパク質パターンおよび／またはペプチドパターンの決定を可能に
し、そしてまた、短い分析時間を有し、液体サンプルが得られたヒトまたは動物
の身体の状態に関する正確な情報を提供する。
【００５７】
タンパク質および／またはペプチドの定性的および／または定量的な決定のた
めに、キャピラリー電気泳動デバイスは、質量分析計に接続され、この質量分析
計が、キャピラリー電気泳動により分離されたタンパク質および／またはペプチ
ドを検出する。
めに、キャピラリー電気泳動デバイスは、質量分析計に接続され、この質量分析
計が、キャピラリー電気泳動により分離されたタンパク質および／またはペプチ
ドを検出する。
【００５８】
コンピュータユニットは、デバイスを制御するためのプログラムを有する。さ
らに、検出により得られた測定値は、自動的に分析されそして記憶される。さら
に、このプログラムは、新しい測定値と既に記憶された測定値とを自動的に比較
する。
らに、検出により得られた測定値は、自動的に分析されそして記憶される。さら
に、このプログラムは、新しい測定値と既に記憶された測定値とを自動的に比較
する。
【００５９】
この比較により、対応するパラメータおよび逸脱したパラメータが得られ、こ
れらは、ヒトまたは動物の身体の状態を示すために使用され得る。
れらは、ヒトまたは動物の身体の状態を示すために使用され得る。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態（Ｗｅｉｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇ）によると、このプ
ログラムは、規定の液体サンプルのペプチドまたはタンパク質パターンを自動的
に決定し、そしてこのデータを基準値（Ｎｏｒｍａｌｗｅｒｔｅ）として参照デ
ータベースに記憶する。
ログラムは、規定の液体サンプルのペプチドまたはタンパク質パターンを自動的
に決定し、そしてこのデータを基準値（Ｎｏｒｍａｌｗｅｒｔｅ）として参照デ
ータベースに記憶する。
【００６１】
これにより、ヒトまたは動物の身体の液体サンプルのタンパク質パターンおよ
び／またはペプチドパターンを決定し、そしてこの情報をその状態が既知である
参照データとして記憶することが可能である。広範囲の参照データがコンパイル
され、そして新しい測定値との比較のために自動的に使用され得る。
び／またはペプチドパターンを決定し、そしてこの情報をその状態が既知である
参照データとして記憶することが可能である。広範囲の参照データがコンパイル
され、そして新しい測定値との比較のために自動的に使用され得る。
【００６２】
本発明によるデバイスの有利な実施形態は、不確定の液体サンプルのペプチド
パターンまたはタンパク質パターンを自動的に決定し、この情報をサンプル値と
して別個のデータベースに記憶し、それを参照データベースの基準値と比較し、
そして偏差（Ａｂｗｅｉｃｈｕｎｇｅｎ）および／または対応（Ｕｅｂｅｒｅｉ
ｎｓｔｉｍｍｕｎｇｅｎ）を自動的に表示して記憶するためのプログラムを提供
する。
パターンまたはタンパク質パターンを自動的に決定し、この情報をサンプル値と
して別個のデータベースに記憶し、それを参照データベースの基準値と比較し、
そして偏差（Ａｂｗｅｉｃｈｕｎｇｅｎ）および／または対応（Ｕｅｂｅｒｅｉ
ｎｓｔｉｍｍｕｎｇｅｎ）を自動的に表示して記憶するためのプログラムを提供
する。
【００６３】
偏差または対応は、ヒトまたは動物の身体の状態を評価するためのパラメータ
として使用され得る。
として使用され得る。
【００６４】
このデータベースにより、ヒトまたは動物の身体の、同一、類似または異なる
状態を同定することが可能である。さらに、時間間隔を空けた同一のヒトまたは
動物の身体に由来するいくつかの液体サンプルからの決定における、タンパク質
パターンおよび／またはペプチドパターンの変化を、プログラムが自動的に決定
、分析および記憶することが可能である。このことは、長時間の間にわたるヒト
または動物の身体の状態のモニタリングを確実にする。本発明の有利な実施形態
は、参照値、サンプル値、偏差および対応（これらは、特定の状態を示す）から
なるデータベースを自動的にコンパイルするため、および新しい測定値に対する
最も可能性のある対応について自動的に検索するためのプログラムを提供する。
これにより、ヒトまたは動物の状態を自動的に検出させることが可能である。
状態を同定することが可能である。さらに、時間間隔を空けた同一のヒトまたは
動物の身体に由来するいくつかの液体サンプルからの決定における、タンパク質
パターンおよび／またはペプチドパターンの変化を、プログラムが自動的に決定
、分析および記憶することが可能である。このことは、長時間の間にわたるヒト
または動物の身体の状態のモニタリングを確実にする。本発明の有利な実施形態
は、参照値、サンプル値、偏差および対応（これらは、特定の状態を示す）から
なるデータベースを自動的にコンパイルするため、および新しい測定値に対する
最も可能性のある対応について自動的に検索するためのプログラムを提供する。
これにより、ヒトまたは動物の状態を自動的に検出させることが可能である。
【００６５】
さらに、液体サンプルは、血清または尿であり得る。
【００６６】
これらのサンプルは、ヒト身体由来の液体サンプルであり、ヒトまたは動物の
身体の状態に関する情報を提供するために特に適切な、タンパク質および／また
はペプチドの組成を有する。
身体の状態に関する情報を提供するために特に適切な、タンパク質および／また
はペプチドの組成を有する。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態（Ｗｅｉｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇ）によると、タンパ
ク質およびペプチドは、サイトカイン（例えば、特にインターロイキン）である
。
ク質およびペプチドは、サイトカイン（例えば、特にインターロイキン）である
。
【００６８】
現在利用可能な情報によると、これらのタンパク質は、ヒトおよび動物の身体
の機能を制御する重要なタンパク質である。
の機能を制御する重要なタンパク質である。
【００６９】
さらに、質量分析計は、飛行時間型質量分析計であり得る。
【００７０】
飛行時間型質量分析計は、非常に高いスキャン速度を有し、従って、非常に高
い分解能を達成する。これにより、タンパク質パターンおよび／またはペプチド
パターンを完全に決定することが可能となる。
い分解能を達成する。これにより、タンパク質パターンおよび／またはペプチド
パターンを完全に決定することが可能となる。
【００７１】
さらに、検出器はまた、キャピラリー電気泳動デバイスとイオン化ユニットと
の間に配置され得る。これは、タンパク質パターンおよび／またはペプチドパタ
ーンのより良好な定性的および定量的決定のために、質量分析計と組み合わせて
使用される。
の間に配置され得る。これは、タンパク質パターンおよび／またはペプチドパタ
ーンのより良好な定性的および定量的決定のために、質量分析計と組み合わせて
使用される。
【００７２】
好ましい実施形態によると、イオン化ユニットは、エレクトロスプレーイオン
化を有する。
化を有する。
【００７３】
分子に作用する比較的低いエネルギーに起因して、エレクトロスプレーイオン
化は、温和なイオン化技術である。その結果、感受性の分子でさえ、そして非共
有結合凝集体でさえある程度は、分解することなく質量分析器に進入する。これ
により、液体サンプル中に溶解したタンパク質および／またはペプチドの非常に
良好な同定が可能になる。
化は、温和なイオン化技術である。その結果、感受性の分子でさえ、そして非共
有結合凝集体でさえある程度は、分解することなく質量分析器に進入する。これ
により、液体サンプル中に溶解したタンパク質および／またはペプチドの非常に
良好な同定が可能になる。
【００７４】
本発明は、図面に図示される１つの実施形態に基づいて、より詳細に以下に説
明される。
明される。
【００７５】
図１は、ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプル１０におけるタンパク質パ
ターンおよび／またはペプチドパターンの定性的および／または定量的な決定の
ための個々の工程を模式的に示す。
ターンおよび／またはペプチドパターンの定性的および／または定量的な決定の
ための個々の工程を模式的に示す。
【００７６】
この図には、以下が示される：液体サンプル１０（好ましくは血清または尿）
；超遠心分離および限外濾過の後に得られた画分１２；キャピラリー電気泳動デ
バイス１４；このデバイス１４に直接接続されたイオン化ユニット１６；インタ
ーフェース１８を介してオンラインで接続された質量分析計２０；ならびにデバ
イスを制御するため、および測定値を自動的に分析および記憶するため、および
新しい測定値を既に記憶された測定値と比較するためのプログラムを有するコン
ピュータユニット２２。
；超遠心分離および限外濾過の後に得られた画分１２；キャピラリー電気泳動デ
バイス１４；このデバイス１４に直接接続されたイオン化ユニット１６；インタ
ーフェース１８を介してオンラインで接続された質量分析計２０；ならびにデバ
イスを制御するため、および測定値を自動的に分析および記憶するため、および
新しい測定値を既に記憶された測定値と比較するためのプログラムを有するコン
ピュータユニット２２。
【００７７】
ヒトまたは動物身体由来の液体サンプル１０は、最初にギ酸を用いてｐＨ３ま
で酸性化される。次いでこの液体サンプル１０は、望ましくない粒子を除去する
ために超遠心分離により精製され、そして限外濾過により、特定の分子サイズの
タンパク質および／またはペプチドを含有するフラクション１２に分割される。
フラクション１２は、＜３ｋＤａ、３〜３０ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａおよび＞
５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質および／またはペプチドから構成され得
る。
で酸性化される。次いでこの液体サンプル１０は、望ましくない粒子を除去する
ために超遠心分離により精製され、そして限外濾過により、特定の分子サイズの
タンパク質および／またはペプチドを含有するフラクション１２に分割される。
フラクション１２は、＜３ｋＤａ、３〜３０ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａおよび＞
５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質および／またはペプチドから構成され得
る。
【００７８】
次いで、個々のフラクション１２のタンパク質および／またはペプチドは、キ
ャピラリー電気泳動１４により分離され、イオン化ユニット１６により直接イオ
ン化され、そしてインターフェース１８によりイオン化ユニット１６に接続され
た質量分析計２０にオンラインで移動される。
ャピラリー電気泳動１４により分離され、イオン化ユニット１６により直接イオ
ン化され、そしてインターフェース１８によりイオン化ユニット１６に接続され
た質量分析計２０にオンラインで移動される。
【００７９】
当然のことながら、そのフラクションのタンパク質および／またはペプチドが
ヒトまたは動物の身体の状態を示すために必要とされるフラクション１２のみを
使用する可能性が存在する。
ヒトまたは動物の身体の状態を示すために必要とされるフラクション１２のみを
使用する可能性が存在する。
【００８０】
質量分析計２０は、有利には、ＴＯＦ型分析計であり、これは、非常に高いス
キャン速度を有し、そして非常に高い分解能を与える。
キャン速度を有し、そして非常に高い分解能を与える。
【００８１】
得られた質量スペクトルは、ヒトまたは動物の身体の全体の状態を示す「フィ
ンガープリント」の型として使用され得る。しかし、さらに、タンパク質を個々
に同定すること、およびこれらのタンパク質の存在、非存在および濃度に基づい
てヒトまたは動物の身体の状態に関する結果を導き出すことも可能である。
ンガープリント」の型として使用され得る。しかし、さらに、タンパク質を個々
に同定すること、およびこれらのタンパク質の存在、非存在および濃度に基づい
てヒトまたは動物の身体の状態に関する結果を導き出すことも可能である。
【００８２】
コンピュータユニット２２は、デバイスを制御するためのプログラムを含む。
さらに、検出により得られた測定値は、自動的に分析され得、そしてデータベー
スに記憶され得る。さらに、このプログラムは、新しい測定値を、既に記憶され
た測定値と自動的に比較する。
さらに、検出により得られた測定値は、自動的に分析され得、そしてデータベー
スに記憶され得る。さらに、このプログラムは、新しい測定値を、既に記憶され
た測定値と自動的に比較する。
【００８３】
この比較により、ヒトまたは動物の身体の状態を示すために使用され得る、対
応パラメータおよび偏差パラメータを決定することが可能になる。
応パラメータおよび偏差パラメータを決定することが可能になる。
【００８４】
データベースにより、ヒトまたは動物の身体の、同じか、類似かまたは異なる
状態を同定することが可能である。
状態を同定することが可能である。
【００８５】
ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプル中のタンパク質および／またはペプ
チドパターンの定性的および／または定量的決定のための、本発明の方法は、技
術的に訓練された人物により実行され得る。この方法の使用は、医師を必要とせ
ず、そしてまた、薬品試験所の外で使用され得る。
チドパターンの定性的および／または定量的決定のための、本発明の方法は、技
術的に訓練された人物により実行され得る。この方法の使用は、医師を必要とせ
ず、そしてまた、薬品試験所の外で使用され得る。
【図１】
図１は、本発明に従う方法の概略図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年６月１０日（２００２．６．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
ＥＬＩＳＡ法の別の欠点は、種々の既知のタンパク質またはペプチドの濃度の
サンプル（いわゆる、標準）の比較測定が、未知の液体サンプル中の個々のタン
パク質またはペプチドの濃度を決定するために必要である。これらの測定はまた
、時間がかかり、費用が高い。なぜならば、１種類のタンパク質またはペプチド
しか１度に決定できないからである。 国際特許ＷＯ９８ ３５ ２２６Ａは、液体サンプルを分析する方法を記載す
る。この液体サンプルは、キャピラリー電気泳動で分離され、次いで直接イオン
化され、そしてインターフェースを介して、検出のためにそれに直接結合された
質量分析計に移動される。
サンプル（いわゆる、標準）の比較測定が、未知の液体サンプル中の個々のタン
パク質またはペプチドの濃度を決定するために必要である。これらの測定はまた
、時間がかかり、費用が高い。なぜならば、１種類のタンパク質またはペプチド
しか１度に決定できないからである。 国際特許ＷＯ９８ ３５ ２２６Ａは、液体サンプルを分析する方法を記載す
る。この液体サンプルは、キャピラリー電気泳動で分離され、次いで直接イオン
化され、そしてインターフェースを介して、検出のためにそれに直接結合された
質量分析計に移動される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
しかし、公知の分析方法では、ヒトまたは動物身体の類似または異なる状態の
同定が可能ではない。
同定が可能ではない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の目的は、ヒトまたは動物身体由来の液体サンプル中のタンパク質パタ
ーンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に決定する
ための方法、ならびにこれらのタンパク質およびペプチドの完全かつ迅速な決定
を、実行および分析するためのデバイスおよび分析方法を提供することであり、
さらに、ヒトまたは動物の身体の類似かまたは異なる状態の同定を可能にするこ
とである。
ーンおよび／またはペプチドパターンを定性的および／または定量的に決定する
ための方法、ならびにこれらのタンパク質およびペプチドの完全かつ迅速な決定
を、実行および分析するためのデバイスおよび分析方法を提供することであり、
さらに、ヒトまたは動物の身体の類似かまたは異なる状態の同定を可能にするこ
とである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ヒトまたは動物の身体に由来する液体サンプル中のタンパク質および／または
ペプチドパターンの定性的および／または定量的決定のための本発明の方法にお
いて、液体サンプル中のタンパク質および／またはペプチドは、キャピラリー電
気泳動により分離され、次いで直接的にイオン化され、そしてオンラインでイン
ターフェースを介して、検出のためにそれに接続された質量分析計に移動される
；長期にわたってヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、参照
値および状態を示すサンプル値が、自動的にデータベースに記憶され、そして最
も可能性の高い対応が、自動的に新しいタンパク質および／またはペプチドパタ
ーンの決定において探索される。
ペプチドパターンの定性的および／または定量的決定のための本発明の方法にお
いて、液体サンプル中のタンパク質および／またはペプチドは、キャピラリー電
気泳動により分離され、次いで直接的にイオン化され、そしてオンラインでイン
ターフェースを介して、検出のためにそれに接続された質量分析計に移動される
；長期にわたってヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、参照
値および状態を示すサンプル値が、自動的にデータベースに記憶され、そして最
も可能性の高い対応が、自動的に新しいタンパク質および／またはペプチドパタ
ーンの決定において探索される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
従って、この方法は、ヒトまたは動物の身体由来の複雑な液体サンプルを分析
して、特定のタンパク質およびペプチドの存在を検出するために特に適切である
。 得られた測定値は、自動的に分析および記憶され、そして新しい測定値は、既
に記憶された測定値と自動的に比較される。 この比較により、対応するパラメーターおよび異なるパラメーターが決定され
、次いで、ヒトまたは動物の身体の状態を記述するために使用され得る。 データベースにより、ヒトまたは動物の身体の同じか、類似かまたは異なる状
態を同定することが可能である。同じヒトまたは動物の身体から時間間隔を空け
て得られたいくつかの液体サンプルの決定において、タンパク質パターンおよび
／またはペプチドパターンの変化が自動的に決定され、分析され、そして記憶さ
れる。 これにより、長期間にわたるヒトまたは動物の身体の状態のモニタリングが確
実になる。 参照値、サンプル値、偏差および対応（特定の状態を記述する）からなるデー
タベースは、自動的にコンパイルされ、そして新しい測定値の場合に、最も可能
性の高い対応の自動的検索が行われる。これにより、ヒトまたは動物の身体の状
態を自動的に決定することが可能になる。
して、特定のタンパク質およびペプチドの存在を検出するために特に適切である
。 得られた測定値は、自動的に分析および記憶され、そして新しい測定値は、既
に記憶された測定値と自動的に比較される。 この比較により、対応するパラメーターおよび異なるパラメーターが決定され
、次いで、ヒトまたは動物の身体の状態を記述するために使用され得る。 データベースにより、ヒトまたは動物の身体の同じか、類似かまたは異なる状
態を同定することが可能である。同じヒトまたは動物の身体から時間間隔を空け
て得られたいくつかの液体サンプルの決定において、タンパク質パターンおよび
／またはペプチドパターンの変化が自動的に決定され、分析され、そして記憶さ
れる。 これにより、長期間にわたるヒトまたは動物の身体の状態のモニタリングが確
実になる。 参照値、サンプル値、偏差および対応（特定の状態を記述する）からなるデー
タベースは、自動的にコンパイルされ、そして新しい測定値の場合に、最も可能
性の高い対応の自動的検索が行われる。これにより、ヒトまたは動物の身体の状
態を自動的に決定することが可能になる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
この比較により、対応するパラメータおよび逸脱したパラメータが得られ、こ
れらは、ヒトまたは動物の身体の状態を示すために使用され得る。 同じヒトまたは動物の身体から時間間隔を空けて得られた複数の液体サンプル
に対する決定の場合において、プログラムは、タンパク質パターンおよび／また
はペプチドパターンの変化を、自動的に決定し、分析しそして記憶する。 これにより、長期間にわたるヒトまたは動物身体の状態のモニタリングが確実
になる。 このプログラムは、参照値、サンプル値、偏差および対応（状態を記述する）
からなるデータベースを自動的に作成し、そして新しい測定値の場合に最も可能
性の高い対応に関して検索する。これにより、ヒトまたは動物の身体の状態を自
動的に決定することが可能になる。
れらは、ヒトまたは動物の身体の状態を示すために使用され得る。 同じヒトまたは動物の身体から時間間隔を空けて得られた複数の液体サンプル
に対する決定の場合において、プログラムは、タンパク質パターンおよび／また
はペプチドパターンの変化を、自動的に決定し、分析しそして記憶する。 これにより、長期間にわたるヒトまたは動物身体の状態のモニタリングが確実
になる。 このプログラムは、参照値、サンプル値、偏差および対応（状態を記述する）
からなるデータベースを自動的に作成し、そして新しい測定値の場合に最も可能
性の高い対応に関して検索する。これにより、ヒトまたは動物の身体の状態を自
動的に決定することが可能になる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
このデータベースにより、ヒトまたは動物の身体の、同一、類似または異なる
状態を同定することが可能である。
状態を同定することが可能である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｅ
Ｆターム(参考） 2G045 BB10 CA26 CB03 DA36 FB05
GB10
Claims (14)
- 【請求項１】 ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該
ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプル（１０）のタンパク質パターンおよび
／またはペプチドパターンを、定性的かつ／または定量的に決定する方法であっ
て、 ここで、該液体サンプル（１０）のペプチドおよびタンパク質は、キャピラリ
ー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでイン
ターフェース（１８）を介して、接続された質量分析計（２０）に検出のために
移動され、 長期間にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、
該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれた偏差および対
応は、自動的にデータベースに記憶され、そして新規なタンパク質パターンおよ
び／またはペプチドパターンの決定の場合には、最も可能性の高い対応が自動的
に検知される、方法。 - 【請求項２】 前記液体サンプル（１０）として、血清または尿が使用され
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 サイトカインまたはインターロイキンのタンパク質パターン
および／またはペプチドパターンが決定される、請求項１または２に記載の方法
。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記液
体サンプル（１０）は、最初に酸性化された後にキャピラリー電気泳動により分
離され、次いで、該サンプルは、超遠心分離により精製されて不必要な粒子を除
去され、そして／または特定の分子サイズのタンパク質および／もしくはペプチ
ドを含有する画分（１２）に分割される、方法。 - 【請求項５】 前記画分（１２）が、３ｋＤａ未満の分子量、３〜３０ｋＤ
ａの分子量、３０〜５０ｋＤａの分子量および５０ｋＤａより大きい分子量のタ
ンパク質および／またはペプチドを含む、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記タンパク質および／またはペプチドのイオン化に、エレ
クトロスプレーイオン化が使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項７】 前記質量分析計（２０）として、飛行時間型質量分析計が使
用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該
ヒトまたは動物由来の液体サンプル（１０）中のタンパク質パターンまたはペプ
チドパターンを、定性的および／または定量的に決定するためのデバイスであっ
て、 該デバイスは、キャピラリー電気泳動デバイス（１４）、イオン化ユニット（
１６）、オンラインでインターフェース（１８）を介して接続される質量分析計
（２０）、およびコンピュータユニット（２２）を備え、該コンピュータユニッ
トが、デバイスを制御するため、ならびに測定値を自動的に分析および記憶する
ため、および新規の測定値を、既に記憶された該測定値と比較するための、プロ
グラムを有し、 長期にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該
プログラムは、該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれ
る偏差および対応を自動的にデータベースに記憶し、そして新規なタンパク質パ
ターンおよび／またはペプチドパターンを決定する場合に、該プログラムが、最
も可能性の高い対応を自動的に検索する、デバイス。 - 【請求項９】 前記プログラムが、規定された液体サンプル（１０）のペプ
チドパターンまたはタンパク質パターンを自動的に決定し、そして該パターンを
基準値として参照データベースに記憶する、請求項８に記載のデバイス。 - 【請求項１０】 請求項８または９に記載のデバイスであって、前記プログ
ラムが、規定されていない液体サンプル（１０）のペプチドパターンまたはタン
パク質パターンを自動的に決定し、該パターンをサンプル値としてデータベース
に記憶し、該サンプル値を前記参照データベースの前記基準値と比較し、そして
偏差および／または対応を自動的に表示する、デバイス。 - 【請求項１１】 前記液体サンプル（１０）が、血清または尿である、請求
項８〜１０のいずれか１項に記載のデバイス。 - 【請求項１２】 前記タンパク質およびペプチドが、サイトカインまたはイ
ンターロイキンである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のデバイス。 - 【請求項１３】 前記質量分析計（２０）が、飛行時間型質量分析計である
、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のデバイス。 - 【請求項１４】 前記イオン化ユニット（１６）が、エレクトロスプレーイ
オン化法を使用する、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
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