WO2009047280A2 - Polypeptidmarker zur diagnose von prostatakrebs - Google Patents

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WO2009047280A2
WO2009047280A2 PCT/EP2008/063499 EP2008063499W WO2009047280A2 WO 2009047280 A2 WO2009047280 A2 WO 2009047280A2 EP 2008063499 W EP2008063499 W EP 2008063499W WO 2009047280 A2 WO2009047280 A2 WO 2009047280A2
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polypeptide marker
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Harald Mischak
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Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Definitions

  • the present invention relates to the measurement of one or more peptide markers in a sample of an individual for the diagnosis of prostate disease (PCA) and a method for the diagnosis of prostate cancer, wherein the presence or absence of the peptide marker (s) indicative of the presence of Prostate cancer is.
  • PCA prostate disease
  • s peptide marker
  • carcinoma of the prostate is one of the most common cancers in men. Since it comes to complaints only in the stage of advanced disease, the cancer can only be diagnosed by early screening tests (palpation findings and PSA value (Prostate specific a_ntigen) in the blood) in the early stages. To confirm the suspected diagnosis, a tissue sample is taken by means of fine needle biopsy.
  • carcinoma Much more common than carcinoma is a benign tumor (adenoma) of the prostate, benign prostatic hyperplasia (BPH). According to the prior art, it can be distinguished only very unreliable about the PSA value of a malignant carcinoma. Again, a biopsy must be done in order to make a clear diagnosis.
  • WO 03/027710 describes protein biomarkers for the differentiation of prostate cancer cells and BPH.
  • the application describes markers that have large blurs (in the range of more than ⁇ 0.5%). From the large number of molecules in this area, assignment to individual markers is virtually impossible due to inaccurate information.
  • the sample material used is preferably a cell lysate from prostatic epithelial cells, which requires expensive sampling. Due to the large number of proteins included in the definition and the difficulty of sampling, the method is not very suitable.
  • WO 01/25791 describes methods for the diagnosis of prostate carcinomas using markers.
  • the above-mentioned markers are derived from the protein semenogelin I.
  • the stated masses are only determined with an accuracy of ⁇ 0.5%. Studies show that the mentioned markers are unsuitable.
  • WO 2006/106129 describes polypeptide markers for the diagnosis of prostate cancer from among other urine samples. In carrying out this procedure, it was found that the measurements of samples from different patients had large variations and difficulties in evaluation.
  • an object of the present invention is the use of the presence or absence of at least three polypeptide markers in a sample of an individual for the diagnosis of prostate disease, wherein the polypeptide markers are selected from the polypeptide tags Nos. 1 to 141 by those given in Table 1 Molecular masses and their migration times are characterized.
  • Table 1 Polypeptide markers for the diagnosis of prostate diseases and their molecular masses and migration times (CE time in minutes):
  • the present invention it is possible to diagnose prostate disease very early.
  • the disease can be treated at an early stage by known methods.
  • the invention further enables a cost-effective, fast and reliable diagnosis in some cases not or only minimally invasive procedures.
  • Another object of the invention is the differential diagnosis to distinguish between prostate cancer and a BPH.
  • the differential diagnosis can be made by using the presence or absence of at least three polypeptide markers in a sample of an individual, the polypeptide markers being selected from polypeptide markers 142-201 characterized by the molecular masses and migration times given in Table 3. Preferably, more markers are used.
  • Table 3 Polypeptide markers for the differential diagnosis of prostate cancer or BPH, their molecular masses and migration times.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. determined in example under point 2).
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. be the polypeptides given in the examples (see example point 3).
  • the characterization of the polypeptides shown in Tables 1 and 3 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a procedure described in detail, for example, by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the Variation of molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ⁇ 0.03%, preferably in the range of ⁇ 0.01%.
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be.
  • polypeptide markers molecular mass and migration time
  • the polypeptides according to the invention are used to diagnose prostate diseases and in particular prostate cancer. Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury. In the present case, the presence or absence of certain polypeptide markers is inferred for the presence of prostate cancer.
  • the polypeptide markers according to the invention are determined in a sample of an individual, wherein, in the case of frequency markers, their presence or absence indicates the presence of prostate cancer.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below. A polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience. In the context of the present invention, the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (eg, only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of prostate disease and prostate cancer in particular (frequency marker). For example, there are polypeptide markers that are typically present in patients with prostate disease, but are absent or less present in subjects without prostate cancer (control). Furthermore, there are polypeptide markers that are present in individuals without prostate disease, but occur less frequently or not at all in individuals with prostate cancer.
  • Amplitude markers are used in such a way that it is not the presence or absence that is decisive, but the height of the signal (the amplitude) decides in the presence of the signal in both groups.
  • Tables 2 and 4 respectively, the mean amplitudes of the respective signals (characterized by mass and migration time) are given over all measured samples.
  • all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts.
  • the respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm). All groups used consist of at least 20 individual patient or control samples to obtain a reliable mean amplitude.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "prostate group". If the amplitude corresponds more closely to the mean amplitudes of the prostate group, it can be assumed that prostate disease is more likely to correspond to the mean amplitudes of the control group and is not to be assumed to be a prostate disease. The smaller the distance between the amplitudes of the control group and the prostate group, the closer the value lying between the two reference values must be to a reference value.
  • Table 4 shows polypeptide markers which are typically present in patients with prostate cancer, e.g. Marker No. 145, but are not or only rarely present in subjects with BPH. Furthermore, there are polypeptide markers present in individuals with BPH, but more rarely or not at all in individuals with PCA, e.g. Polypeptide marker No. 163.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence or amplitude of one or more polypeptide markers is determined may be any individual who may suffer from prostatic disease, e.g. an animal or a human.
  • the individual is a mammal, such as a mammal. a dog or a horse, most preferably a human.
  • the sample measuring the presence or absence or amplitude of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample that has a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual (prostate cancer or not). For example, it may be urine, semen, sperm (sperm without sperm). Preferably, it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a first jet or midstream urine sample is used.
  • the urine sample can be removed, for example, by means of a catheter or else by means of a urination apparatus as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the subject eg, the urine sample
  • the treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by ion exchange chromatography, or electrophoretic separation.
  • the sample is separated before its measurement by means of capillary electrophoresis, purified by ultracentrifugation and / or by ultrafiltration into fractions containing Polypeptidmarker certain molecular size, separated.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, ie 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • TOF time-of-flight
  • electrospray ionization (ESI) the molecules present in solution are sprayed under the influence of high voltage (eg 1-8 kV), forming charged droplets, which become smaller as the solvent evaporates.
  • high voltage eg 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique makes it possible to determine the presence of a few hundred polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, from a small volume and with high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared.
  • CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents for CE-MS, the use of volatile solvents is preferred, and it is best to work under essentially salt-free conditions.
  • suitable solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and treated with a weak acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow when a current is applied, cations are accelerated to the cathode, and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface to volume, which allows a good removal of the resulting Joule heat during the flow of electricity. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can be used for the diagnosis of prostate cancer in the method according to the invention.
  • at least three polypeptide markers may be used, for example, markers 1, 2 and 3; 1, 2 and 4; etc.
  • markers 1 to 11 are preferred, for example, markers 1 to 11.
  • a subset of the markers are measured, the markers being selected to be found with a high probability in the sample. Depending on the frequencies of the markers, these are selected so that at least half of the markers are found with a 90% probability in a sample. For example, if only 2 markers are analyzed, for example, markers 1 and 2 in a patient with a pathological prostate, the probability that none of the markers are found in the sample is 12%, ie with an 88% probability at least 1 marker is found. It is therefore more advantageous to use the markers 2 and 3.
  • the probability that no marker is found is only about 1%, ie the probability that at least one of the markers is found is approximately 99%. It is known to those skilled in the art to select suitable marker combinations using statistical methods, it being preferred to analyze at least 6, preferably at least 10, even more preferably at least 20 markers. Most preferred is the use of all markers listed in Tables 1 and 3, respectively.
  • markers can also be used for the differential diagnosis between PCA and BPH.
  • at least three polypeptide markers can be used. More preferred is the use of at least 4, 5, or 6 markers. Even more preferred is the use of at least 7 markers.
  • the CE-MS measurements were performed using a Beckman Coulter capillary electrophoresis system (P / ACE MDQ system, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. For the sheath flow on MS, 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used, here with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was realized by a CE-ESI-MS sprayer kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE).
  • Sample injected into the capillary this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • An IM NH 3 solution is injected for 7 seconds (at 1 psi) prior to sample injection, and after injection of the sample for 5 seconds, a 2M formic acid solution is injected. After applying the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • the following CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 32 min at 0.5 psi. The total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas” was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV Rel
  • ELM electroactive polypeptide
  • KINCON KINCON
  • GIVLY synthetic peptides. Modifications described above have led to an improvement over WO 03/072710 A2, both in terms of detection limits and in terms of the reproducible detectability of polypeptides , It was thus possible to identify polypeptides which show pathological changes in the prostate (Pca (prostate carcinoma), high grade PIN (prostatic intraepithelial neoplasia), BPH (benign prostate hyperplasia) and ASAP (atypical small acinar proliferation)) in comparison to healthy, physiological Display prostate (Table 1).
  • Pca prostate carcinoma
  • high grade PIN prostatic intraepithelial neoplasia
  • BPH benign prostate hyperplasia
  • ASAP atypical small acinar proliferation
  • polypeptides could be identified which allow for an improved discrimination of PCa and BPH compared to WO 03/072710 A2 (Table 2).
  • the molecular masses of the peptides and the m / z ratios of the individual charge states that are visible in the MS are given in the following table:
  • WO 01/25791 discloses markers which speak against the presence of a prostate carcinoma.
  • the number of possible fragments is shown in the following table:
  • FIG. 1 shows, by way of example for a mass, the multiplicity of sequences that are possible in this weight range.
  • FIG. 2 shows a determination of the amplitudes of the six markers found in this way. It turns out that there are no significant differences between prostate cancer patients and the control group. Subsequently, the discriminatory value of the biomarkers was examined by means of an ROC analysis (receiver operator characteristic curves).
  • FIG. 3a shows corresponding analyzes for six markers which are described in WO 01/25791 and could be found in urine samples.
  • FIG. 3b shows a corresponding ROC examination of the biomarkers according to the invention, Nos. 142 to 201 of the patent application.
  • Figure 3c shows the ROC analysis of a subset of markers of the invention of 12 markers.
  • FIG. 3d shows that even when only three biomarkers according to the invention are used, the informative value is significantly higher than in WO 01/25791.

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Abstract

Verfahren zur Diagnose von Prostataerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer Amplitude oder einer An- oder Abwesenheit mindestens eines Polypeptidmarkers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1 bis 141, die durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.

Description

Polvpeptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs
Die vorliegende Erfindung betrifft die Messung eines oder mehrerer Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Prostataerkrankungen (PCA) sowie ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs, wobei die An- oder Abwe- senheit des oder der Peptidmarker(s) indikativ für das Vorliegen von Prostatakrebs ist.
Das Karzinom der Prostata (Vorsteherdrüse) ist eine der häufigsten Krebserkrankungen beim Mann. Da es erst im Stadium der fortgeschrittenen Erkrankung zu Beschwerden kommt, kann der Krebs nur durch regelmäßige Früherkennungsun- tersuchungen (Tastbefund und PSA-Wert (Prostate specific a_ntigen) im Blut) im Frühstadium diagnostiziert werden. Zur Sicherung der Verdachtsdiagnose wird mittels Feinnadelbiopsie eine Gewebsprobe entnommen.
Für die Therapie stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung, die sich nach der Art und dem Stadium des Tumors sowie nach den individuellen Bedürfnissen des Patienten richten : Im frühen Stadium stehen die Seed-Implantation (minimal- invasive Einbringung von radioaktiven Jod 125- Strahlern in die Prostata) oder die operative Entfernung des Tumors und Bestrahlung von außen zur Verfügung.
Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung hat bei einem Drittel der Patienten bereits eine Metastasierung in andere Organe stattgefunden; die Erkrankung ist zu die- sem Zeitpunkt bereits kaum noch heilbar. Durch Strahlen-, Chemo- oder Hormontherapie (Kombinationen sind möglich) kann jedoch die weitere Ausbreitung des Krebses verzögert werden. Bei isoliertem Befall der Prostata, also wenn noch keine Absiedlung stattgefunden hat, ist die Prognose jedoch günstig.
Viel häufiger als das Karzinom tritt ein gutartiger Tumor (Adenom) der Prostata auf, die benigne Prostatahyperplasie (BPH). Nach dem Stand der Technik kann sie nur sehr unzuverlässig über den PSA-Wert von einem bösartigen Karzinom unterschieden werden. Auch hier muss eine Biopsie erfolgen, um eine klare Diagnose treffen zu können.
Wie bereits beschrieben, gibt es keine nichtinvasive und verlässliche Früherken- nung des Prostatakrebses. Eine klare Diagnose ist bisher mit invasiven Eingriffen wie der Biopsie verbunden. Es stellte sich also die Aufgabe, ein Verfahren und eine Methode zur möglichst wenig invasiven, schnellen und kostengünstigen Diagnose des Prostatakrebses zu finden.
WO 03/027710 beschreibt Proteinbiomarker zur Unterscheidung von Prostatakar- zinomzellen und BPH. In der Anmeldung werden Marker beschrieben, die große Unscharfen aufweisen (im Bereich von mehr als ± 0,5%). Aus der Vielzahl von Molekülen in diesem Bereich ist aufgrund der ungenauen Angaben eine Zuordnung zu einzelnen Markern praktisch nicht möglich. Als Probenmaterial wird bevorzugt ein Zelllysat aus Prostataepithelzellen eingesetzt, was eine aufwendige Probenentnahme erfordert. Aufgrund der Vielzahl der von der Definition umfass- ten Proteine und der Schwierigkeit der Probenentnahme ist das Verfahren wenig geeignet.
WO 01/25791 beschreibt Verfahren zur Diagnose von Prostatakarzinomen unter Verwendung von Markern. Die genannten Marker entstammen dem Protein Se- menogelin I. Die angegebenen Massen sind nur mit einer Genauigkeit von ± 0,5% bestimmt. Untersuchungen zeigen, dass die genannten Marker ungeeignet sind.
WO 2006/106129 beschreibt Polypeptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs aus unter anderem Urinproben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens zeigte sich, dass die Messungen von Proben verschiedener Patienten große Schwankungsbreiten aufwiesen und sich Schwierigkeiten hinsichtlich der Auswertung ergaben.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass es Marker gibt, die unter diesen Umständen eine bessere Aussagemöglichkeit bieten, insbesondere, wenn sie im Zusammenhang mit einer veränderten Probenvorbereitung eingesetzt werden.
Überraschender Weise wurde nun gefunden, das bestimmte Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Prostataerkrankungen und zur Differentialdiagnose zur Unterscheidung von Prostatakrebs und benigner Prostatahyperplasie (BPH) verwendet werden können. Insbesondere können die Proben Urin- oder Samenflüssigkeitsproben sein, die nicht-invasiv entnommen werden. Folglich ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der An- oder Abwesenheit von mindestens drei Polypeptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Prostataerkrankungen, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Polypeptidmarkern Nr. 1 bis 141, die durch die die in Tabelle 1 angegebenen Molekularmassen und ihre Migrationszeiten charakterisiert sind.
Tabelle 1 : Polypeptidmarker zur Diagnose von Prostataerkrankungen sowie ihre Molekularmassen und Migrationszeiten (CE-Zeit in Minuten) :
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Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Prostataerkrankungen sehr frühzeitig zu diagnostizieren. Dadurch kann die Krankheit in einem frühen Stadium durch bekannte Verfahren therapiert werden. Die Erfindung ermöglicht weiterhin eine kostengünstige, schnelle und zuverlässige Diagnose bei zum Teil nicht oder nur minimal invasiven Eingriffen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Differentialdiagnose zur Unterscheidung zwischen dem Prostatakarzinom und einer BPH. Die Differentialdiagnose kann durch die Verwendung der An- oder Abwesenheit von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Probe eines Individuums geschehen, wobei die PoIy- peptidmarker ausgewählt sind aus den Polypeptidmarkern 142-201, die durch die in Tabelle 3 angegebenen Molekularmassen und Migrationszeiten charakterisiert sind. Bevorzugt werden mehr Marker eingesetzt.
Tabelle 3: Polypeptidmarker zur Differentialdiagnose von Prostatakrebs oder BPH, ihre Molekularmassen und Migrationszeiten.
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Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt- bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen 1 und 3 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,03%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,01%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Ab- bauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein.
Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um Prostataerkrankun- gen und im speziellen Prostatakrebs zu diagnostizieren. Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird von der An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auf das Vorliegen von Prostatakrebs geschlossen. Hierzu werden die erfindungsgemäßen PoIy- peptidmarker in einer Probe eines Individuums bestimmt, wobei, im Falle von Frequenzmarkern, ihre An- oder Abwesenheit auf das Vorliegen von Prostatakrebs schließen lässt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt. Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel). Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für Prostataerkrankungen und Prostatakrebs im speziellen ist (Fre- quenzmarker). So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Patienten mit Prostataerkrankungen vorhanden sind, jedoch bei Probanden ohne Prostatakrebs (Kontrolle) nicht oder seltener vorhanden sind. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Individuen ohne Prostataerkrankungen vorhanden sind, jedoch bei Individuen mit Prostatakrebs seltener oder gar nicht auftreten.
Zusätzlich oder auch alternativ zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit können auch die Amplituden zur Diagnose von Prostataerkrankungen verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, dass nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In Tabelle 2 bzw. 4 sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben. Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patienten- oder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Prostata-Gruppe" ist. Entspricht die Amplitude eher den mittleren Amplituden der Prostata-Gruppe, ist von einer Prostataerkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer Prostataerkrankung auszugehen. Je geringer der Abstand zwischen den Amplituden der Kontrollgruppe und der Prostata-Gruppe, desto dichter muss der Wert, der zwischen den beiden Referenzwerten liegt, an einem Referenzwert liegen.
Eine Möglichkeit ist, den Bereich zwischen den mittleren Amplituden in drei Teile zu zerlegen. Liegt der Wert im unteren Drittel, ist dies indikativ für den unteren Wert, liegt der Wert im oberen Drittel, ist dies indikativ für den oberen Wert. Liegt er im mittleren Drittel, ist keine Aussage hinsichtlich dieses Markers möglich.
Tabelle 2 : Amplitudenmarker
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Zur Differentialdiagnose zwischen PCA und BPH zeigt Tabelle 4 Polypeptidmarker, die typischerweise bei Patienten mit Prostatakarzinom vorhanden sind, wie z.B. Marker Nr. 145, jedoch bei Probanden mit BPH nicht oder nur selten vorhanden sind. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Individuen mit BPH vorhanden sind, jedoch bei Individuen mit PCA seltener oder gar nicht auftreten, z.B. Polypeptidmarker Nr. 163.
Tabelle 4:
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Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit oder die Amplitude eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an Prostataerkrankungen leiden kann, z.B. ein Tier oder ein Mensch. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säu- getier, wie z.B. einen Hund oder ein Pferd, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
Für die Anwendung der Erfindung wird bevorzugt nicht nur ein Polypeptidmarker, sondern eine Kombination von Markern verwendet, um Prostatakrebs zu diagnostizieren. Dabei wird durch ihre An- oder Abwesenheit und/oder die Höhe der Amplitude auf das Vorliegen von Prostataerkrankungen geschlossen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im Kranken oder Kontrollindividuum reduziert oder vermieden werden. Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit oder die Amplitude des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums (Prostata- krebs oder nicht) zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Urin, Sperma, Samenflüssigkeit (Sperma ohne Spermien) handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe. Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Erststrahl- oder Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptid- markern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptid- marker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscher-Chromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Beson- dere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (> 100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektro- metrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionenbildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser- desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden. Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladenen Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können. Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan- Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hundert Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, aus einem geringen Volumen und mit hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermes- sen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnose von Prostatakrebs und die Differentialdiagnose zwischen Prostatakrebs und BPH zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer schwachen Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Ka- thode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der E- lektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann ver- wendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafter Weise mehrere PoIy- peptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs verwendet werden. Insbesondere können mindestens drei Polypeptidmarker verwendet werden, beispielsweise die Marker 1, 2 und 3; 1, 2 und 4; usw.
Mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 4, 5, oder 6 Markern.
Noch mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 11 Markern, beispielsweise den Marker 1 bis 11. Bevorzugt wird eine Untergruppe der Marker vermessen, wobei die Marker so ausgewählt werden, dass sie mit einer hohen Wahrscheinlichkeit in der Probe gefunden werden. In Abhängigkeit von den Häufigkeiten der Marker werden diese so ausgewählt, dass mindestens die Hälfte der Marker mit einer 90%igen Wahrscheinlichkeit in einer Probe gefunden wird. Werden beispielsweise nur 2 Marker analysiert, beispielsweise die Marker 1 und 2 bei einem Patienten mit einer pathologischen Prostata, so liegt die Wahrscheinlichkeit, dass keiner der Marker in der Probe gefunden wird, bei 12%, d.h. mit einer 88%igen Wahrscheinlichkeit wird mindestens 1 Marker gefunden. Vorteilhafter ist es daher, die Marker 2 und 3 zu verwenden. Hier ist die Wahrscheinlichkeit, dass kein Marker gefunden wird nur etwa 1%, d.h. die Wahrscheinlichkeit, dass zumindest einer der Marker gefunden wird, beträgt annähernd 99%. Dem Fachmann ist bekannt mit statistischen Verfahren geeignete Markerkombinationen auszuwählen, wobei bevorzugt ist, mindestens 6, bevorzugt mindestens 10, noch mehr bevorzugt mindestens 20 Marker zu analysieren. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung aller in den Tabellen 1 bzw. 3 aufgeführten Marker.
Auch zur Differentialdiagnose zwischen PCA und BPH können mehrere Marker verwendet werden. Insbesondere können mindestens drei Polypeptidmarker verwendet werden. Mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 4, 5, oder 6 Markern. Noch mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 7 Markern.
Am meisten bevorzugt ist die Verwendung aller in den Tabellen 2 bzw. 4 aufgeführten Marker.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen von Prostatakrebs bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus verwendet werden.
Beim natürlichen Alterungsprozess des Menschen nimmt die glomeruläre Filtrati- onsleistung der Niere ab (J. Gerontol. 31 (1976) 155), was zu einem vermehrten Auftreten von größeren Proteinen im Urin führt. Dieser Prozess, der in seiner Ausprägung hohe individuelle Unterschiede aufweisen kann, erschwert die Vergleichbarkeit von Messungen zur Bestimmung pathologischer Veränderungen der Prostata aus Urin. Aus diesem Grund musste die Probenbereitung von Urinproben zur Entfernung dieser Störmoleküle verbessert werden. Das verbesserte Protokoll entfernt alle Moleküle größer als 20 kDa, was zu einer stark verbesserten Vergleichbarkeit der Urinproben untereinander führte.
Beispiel :
1. Probenvorbereitunq : Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die in Urin in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μl Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultra- filtrat erhalten wurden. Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und gegen 2,5 ml 0,01% NH4OH entsalzt und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert. 2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt. Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den "Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der
Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der
Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert. Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.
Zusätzlich zur modifizierten Probenvorbereitung wurde die Vergleichbarkeit der individuellen Urinproben durch eine Kalibration der Massen und Migrationszeiten verbessert. Zur Kalibration wird eine dem Fachmann bekannte „lokale lineare Regression" mit Referenz-Polypeptiden durchgeführt. Als Referenzproteine kön- nen beliebige Polypeptide verwendet werden, die durch eine exakte Masse und Migrationzeit definiert sind, bevorzugt werden Polypeptide mit hohem Signal-zuRausch-Verhältnis verwendet, besonders bevorzugt werden „house keeping pro- teins" verwendet. Bei „house keeping proteins" handelt es sich um Proteinstandards, die natürlicherweise in der Mehrheit der Urinproben in gering variierender Menge vorhanden sind.
3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle der CE-Messung und der Kalibrierung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind : Protein/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19,3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 19,55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 19,28 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYG RQIIS 20,95 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,49 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22,62 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32,2 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar. Oben beschriebene Modifikationen führten zu einer Verbesserung gegenüber WO 03/072710 A2 sowohl im Hinblick auf die Nachweisgrenzen, als auch im Hinblick auf die reproduzierbare Nachweisbarkeit von Polypeptiden. Damit konnten Polypeptide identifiziert werden, welche pathologische Veränderungen der Prostata (Pca (Prostata carcinom), high grade PIN (Prostatische intraepithelische Neoplasie), BPH (Benigne Prostata Hyperplasme) und ASAP (atypical small acaci- nar proliferation)) im Vergleich zur gesunden, physiologischen Prostata anzeigen (Tabelle 1). Zusätzlich konnten auf Grund dieser Verbesserungen Polypeptide identifiziert werden, die eine im Vergleich zu WO 03/072710 A2 verbesserte Unterscheidung von PCa und BPH erlauben (Tabelle 2). Die Molekularmassen der Peptide sowie die in der MS sichtbaren m/z Verhältnisse der einzelnen Ladungszustände sind in der folgenden Tabelle angegeben :
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Leistungsfähigkeit der in WO 01/25791 beschriebenen Marker.
In der WO 01/25791 sind elf Marker erwähnt (siehe dort Anspruch 2), die Genauigkeit der Massenbestimmung wird mit 0,5% angegeben. Geht man davon aus, dass es sich nur um Fragmente von Semenogelin I handelt, ergeben sich folgende Anzahlen an möglichen Fragmenten aus Semenogelin :
Figure imgf000027_0002
Weiterhin offenbart WO 01/25791 Marker, die gegen das Vorliegen eines Prostatakarzinoms sprechen. Die Anzahl möglicher Fragmente ist in der folgenden Tabelle enthalten :
Figure imgf000028_0001
Figur 1 zeigt beispielhaft für eine Masse die Vielzahl an Sequenzen, die in diesem Gewichtsbereich möglich sind.
Im nächsten Schritt wurde versucht, entsprechende Proteine in Urinproben von Patienten mit Prostatakarzinom oder BPH zu analysieren. Dabei konnten nur sechs Marker gefunden werden. Figur 2 zeigt eine Bestimmung der Amplituden der sechs auf diesem Wege gefundenen Marker. Es zeigt sich, dass zwischen Prostatakarzinompatienten und der Kontrollgruppe keine signifikanten Unterschiede auftreten. Anschließend wurde der diskriminatorische Wert der Biomarker mittels einer ROC-Analyse (Receiver Operator characteristic Curves) untersucht. Figur 3a zeigt entsprechende Analysen für sechs Marker, die in der WO 01/25791 beschrieben sind und in Urinproben gefunden werden konnten.
Figur 3b zeigt eine entsprechende ROC-Untersuchung der erfindungsgemäßen Biomarker mit den Nr. 142 bis 201 der Patentanmeldung. Figur 3c zeigt die ROC- Analyse einer Untergruppe der erfindungsgemäßen Markern von 12 Markern. Figur 3d zeigt, dass selbst bei Verwendung von lediglich drei erfindungsgemäßen Biomarkern die Aussagekraft deutlich höher ist als bei der WO 01/25791.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Diagnose von Prostataerkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer Amplitude oder An- oder Abwesenheit mindestens eines Polypeptid markers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1 bis 141, die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind :
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Wobei es sich bei der Probe um eine Urinprobe oder Samenflüssigkeitsprobe handelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker 1 bis 141 anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
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Figure imgf000035_0001
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens drei oder mindestens fünf oder mindestens zehn Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
4. Verfahren zur Differenzialdiagnose zwischen Prostata krebs (PCA) und benigner Prostatahyperplasie (BPH) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit von mindestens einen Polypeptidmarker in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 142 bis 201, die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind :
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
wobei es sich bei der Probe um eine Urinprobe oder Samenflüssigkeitsprobe handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten Amplitude An- oder Abwesenheit anhand folgender Referenz werte erfolgt:
PCa BPH
Masse (Da) CE-Zeit (min)
Nr. Häufigkeit (%) Mittlere Amp. Häufigkeit (%) Mittlere Amp.
142 1210,4 36, 5 0,50 149 0,61 243
143 1210,6 20, 9 0,65 121 0,54 101
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Figure imgf000039_0001
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei mindestens drei oder mindestens vier oder mindestens fünf oder mindestens zehn oder alle Polypep- tidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 6 definiert sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Kapillarelektrophore- se, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der Amplitude oder zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei vor der Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durch- geführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit oder zur Bestimmung der Amplitude des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn- zeichnet, dass vor der Messung eine Abtrennung von Proteinen > 20 kDa erfolgt.
11. Verwendung mindestens eines Polypeptid markers ausgewählt aus den Markern Nr. 1 bis 201, wie sie in den Ansprüchen 1 oder 3 definiert sind, zur Diagnose oder Differentialdiagnose von Prostataerkrankungen.
12. Markerset umfassend mindestens 3 Marker ausgewählt aus den Markern 1 bis 201, wie sie in den Ansprüche 1 oder 3 defineirt sind.
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