EP2478377A2 - Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung vaskulärer erkrankungen - Google Patents

Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung vaskulärer erkrankungen

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Publication number
EP2478377A2
EP2478377A2 EP10775725A EP10775725A EP2478377A2 EP 2478377 A2 EP2478377 A2 EP 2478377A2 EP 10775725 A EP10775725 A EP 10775725A EP 10775725 A EP10775725 A EP 10775725A EP 2478377 A2 EP2478377 A2 EP 2478377A2
Authority
EP
European Patent Office
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markers
polypeptide
sample
absence
amplitude
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10775725A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP10775725A priority Critical patent/EP2478377A2/de
Publication of EP2478377A2 publication Critical patent/EP2478377A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • the present invention relates to the use of the presence or absence of one or more peptide markers in a sample of an individual for the diagnosis and evaluation of the severity of vascular disease (VE) and a method for the diagnosis and evaluation of the vascular disease, wherein the presence or absence of the or the peptide marker (s) is indicative of the severity of a VE.
  • VE vascular disease
  • Vascular disorders are diseases that affect the vessels of an organism and, subsequently, organs such as the heart, brain, kidney, etc. These are z. As arteriosclerosis, circulatory disorders, hypertension, and cardiac arrhythmias.
  • Atherosclerosis refers to the hardening of arteries due to vascular deposits. Cholesterol crystal deposits lead to the formation of inflammatory foci (atheromas), in which blood components, fatty substances, metabolic waste products and calcium salts accumulate. It forms so-called plaques, area calcifications; which makes the vessel wall harder and tighter.
  • the artery loses its elasticity and blood transport from the heart to the individual parts of the body is made more difficult.
  • Secondary diseases include, for example, angina pectoris, myocardial infarction, circulatory collapse, stroke, deep-seated leg vein thrombosis, embolisms.
  • Circulatory disorders usually affect the lower body, from the abdominal aorta to the foot arteries and lead to a reduction in blood flow and oxygenation in the muscle tissue, which gradually dies. In the last stage ulcers form and the vessels close in such a way that an amputation becomes inevitable. High blood pressure has no clear cause, so taking medication or excessive secretion of kidney hormones can make the blood pressure rocketing. High blood pressure levels are also associated with long-term stress, which leads to vascular spasms. High blood pressure damages the vessel walls, so there is a risk of tearing or occlusion. Vascular disease can be prevented by prevention because it is associated with an unhealthy lifestyle. A radical reversal in lifestyle may arrest arteriosclerosis in the early stages, e.g.
  • vascular diseases By lowering blood pressure and blood lipid levels.
  • drug therapies eg, acetylsalicylic acid, beta-receptor blockers, ACE inhibitors, etc.
  • damaged vessels are irreparable, the process at an advanced stage is irreversible. This makes early detection of vascular diseases particularly important.
  • VE in coronary heart disease is initially carried out indirectly via evaluation of risk factors and non-invasive examinations such as blood pressure, resting and exercise ECG, as well as blood tests to determine the lipid status (LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglycerides), fasting blood sugar and if necessary HbAlc.
  • LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglycerides lipid status
  • HbAlc lipid status
  • X-ray contrast agents are used.
  • the indication for coronary angiography is a low or medium pretest probability, whereas non-invasive diagnostics have not yielded reliable results.
  • the coronary angiography can only be performed if, in addition to the previously mentioned preliminary investigations, various complications such. As a thyroid hyperfunction or a contrast agent allergy are excluded. Because the contrast agent is excreted via the kidney, it must also have sufficient renal function. This shows that there is a need for a non-invasive option for the early and reliable diagnosis of vascular disease. It is therefore the object of the present invention to provide methods and means for the diagnosis of vascular diseases.
  • the object is achieved by a method for the diagnosis of vascular diseases, comprising the step of determining a presence or absence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers shown in Table 1 by values for the molecular masses, the migration time characterizes and possibly their peptide sequence are characterized.
  • the evaluation of the measured polypeptides can be based on the presence or absence or amplitude of the markers taking into account the following limits:
  • Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives. A specificity of 100% means that a test will recognizes persons as healthy, ie. no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients.
  • Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a specificity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95% for vascular diseases.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a sensitivity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95% for vascular diseases.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - such.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may, for. Example, the polypeptides given in the examples be (see example point 3).
  • the characterization of the polypeptides shown in Table 1 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a method which is described e.g. in detail by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the variation of molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ⁇ 0.1%, preferably in the range of ⁇ 0.05%, more preferably ⁇ 0.03%, even more preferably ⁇ 0.01% or 0.005%.
  • the polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They can be chemically modified, for. By post-translational modifications such as glycolization, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. B. in the context of degradation, be changed. In addition, the polypeptide markers can also be chemically altered during the purification of the samples, for. B. oxidized, be. Based on the parameters that the poly- peptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
  • the polypeptides of the invention are used to diagnose vascular diseases. Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury. The presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of the vascular disease.
  • polypeptide markers that are typically present in individuals with vascular disease, but are less common or non-existent in individuals without vascular disease.
  • polypeptide markers which are present in patients with vascular diseases, but are not or only rarely present in patients without vascular diseases.
  • amplitude markers can also be used for diagnosis.
  • Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • There are Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods.
  • all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts.
  • the respective average amplitudes of the individual markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it is to be assumed that the presence of a vascular disease, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to be assumed by a vascular disease.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group. Alternatively, the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, where in some samples the amplitude is so low that it is below the detection limit. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - is included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined can be any individual who may be suffering from vascular disease. Preferably it is the individual is a mammal, most preferably a human.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tear fluid, tissue sample, sperm, vaginal fluid, or a stool sample ,
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. Basically, the presence or absence of a polypeptide marker by direct methods, such as. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the individual may be analyzed prior to measuring the presence or absence of the or peptide marker pretreated by any suitable means and z.
  • the treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by ion exchange chromatography, or electrophoretic separation.
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass pectrometry it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, ie 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are mostly used. to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used to analyze the resulting ions.
  • electrospray ionization the molecules present in solution are inter alia. sprayed under the influence of high voltage (eg 1-8 kV) to form charged droplets, which become smaller due to evaporation of the solvent. Finally, so-called Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • high voltage eg 1-8 kV
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A, 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A, 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After measuring a sample a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of vascular diseases. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • fused silica capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, ie show their hydrophilic groups on the inside, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • several polypeptide markers can advantageously be used for diagnostics. Preferred is the use of at least 5, 6, 8, or 10 markers. In one embodiment, 20 to 50 markers are used.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) as well as patients suffering from vascular disease. For the subsequent CE-MS measurement, proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration. For this purpose, 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, lOmM ammonia, 0.02% SDS). These 1.4 ml sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). The UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml ultrafiltrate was obtained.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, lOmM ammonia, 0.02% SDS). These 1.4 ml sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Göttingen,
  • the CE-MS measurements were performed with a capillary electrophoresis system from Beckman Coulter (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Inc, Fullerton, USA) and a Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 pm and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water.
  • An IM NH 3 solution is injected for 7 seconds (at 1 psi) prior to sample injection, and after injection of the sample for 5 seconds, a 2M formic acid solution is injected. After applying the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • the following CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 min, 0.2 psi for 2 min, 0.3 psi for 2 min, 0.4 psi for 2 min, and 0.5 psi for 32 min. The total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas” was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ in water.
  • REV amino acid sequence
  • ELM amino acid sequence polypeptide
  • KINCON amino acid sequence polypeptides
  • a further peptide (peptide 2) is selected from the measurement and attempts to identify a suitable polypeptide marker, again taking into account a corresponding time window. If, in turn, you can find several markers with a corresponding mass, the most likely one is Assignment of those in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
  • further proteins from his sample for the assignment, for example ten proteins.
  • migration times are either lengthened or shortened by certain absolute values, or upsets or knocks occur throughout the course. Co-migrating peptides also co-migrate under such conditions.

Abstract

Verfahren zur Diagnostik von vaskulären Erkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.

Description

Polypeptid marker zur Diagnostik und
Beurteilung vaskulärer Erkrankungen
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnostik und Beurteilung des Schweregrades von vaskulären Erkrankungen (VE) sowie ein Verfahren zur Diagnostik und Beurteilung der vaskulären Erkrankung, wobei die An- oder Abwesenheit des oder der Peptidmarker(s) indikativ für den Schweregrad einer VE ist.
Vaskuläre Erkrankungen sind Erkrankungen, die die Gefäße eines Organismus und in weiterer Folge Organe wie zum Beispiel das Herz, das Gehirn, die Niere, etc., betreffen. Dies sind z. B. Arteriosklerose, Durchblutungsstörungen, Bluthochdruck, sowie Herzrhythmusstörungen.
Arteriosklerose bezeichnet die Verhärtung von Arterien durch Gefäßeinlagerungen. Cholesterinkristallablagerungen führen zur Bildung von entzündlichen Herden (Atheromen), in denen sich Blutbestandteile, Fettstoffe, Stoffwechselschlacken und Kalksalze festsetzen. Es bilden sich sogenannte Plaques, flächige Verkalkungen; wodurch die Gefäßwand härter und enger wird. Die Arterie verliert an Elastizität und der Bluttransport vom Herzen in die einzelnen Körperbereiche wird erschwert. Folgeerkrankungen sind beispielsweise Angina pectoris, Herzinfarkt, Kreislaufkollaps, Schlaganfall, tief liegende Beinvenenthrombosen, Embolien. Durchblutungsstörungen betreffen meistens den unteren Körperbereich, von der Bauchaorta bis zu den Fußarterien und führen zu einer Verringerung des Blutflusses und der Sauerstoffzufuhr in das Muskelgewebe, das allmählich abstirbt. Im letzten Stadium bilden sich Geschwüre und die Gefäße verschließen sich derart, dass eine Amputation unumgänglich wird . Bluthochdruck hat keine eindeutige Ursache, so kann die Einnahme von Medikamenten oder eine übermäßige Sekretion von Nierenhormonen den Blutdruck hochschnellen lassen . Hohe Blutdruckwerte liegen ebenfalls bei Dauerstress vor, bei dem es zu Gefäßkrämpfen kommt. Bluthochdruck schädigt die Gefäßwände, so dass die Gefahr eines Zerreißens oder eines Verschlusses besteht. Vaskuläre Erkrankungen können durch Vorbeugung vermieden werden, weil sie mit einer ungesunden Lebensführung assoziiert sind. Durch eine radikale Umkehr in der Lebensweise ist Arterienverkalkung im Frühstadium aufzuhalten, z. B. durch Senken von Blutdruck- und Blutfettwerten. Das Fortschreiten vaskulärer Erkrankungen kann zudem durch medikamentöse Therapien (z.B. Acetylsalicylsäure, Betarezeptorenblocker, ACE-Hemmer, etc.) verlangsamt werden. Allerdings ist festzuhalten, dass geschädigte Gefäße irreparabel sind, der Prozess im fortgeschrittenen Stadium nicht rückgängig zu machen ist. Dieses macht eine frühzeitige Erkennung der vaskulären Erkrankungen beson- ders wichtig .
Die Diagnostik von VE erfolgt bei koronaren Herzerkrankung zunächst indirekt über Evaluierung von Risikofaktoren und durch nicht-invasive Untersuchungen wie Blutdruckmessung, Ruhe und Belastungs-EKG, sowie durch Blutbilder zur Bestimmung des Lipidstatus (LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyzeride), Nüchternblutzucker und ggf. HbAlc. Ergeben diese Untersuchungen das Vorliegen von Hochrisikomerkmalen, d .h. es ist mit schwerwiegenden vaskulären Ereignissen (Tod, Myokardinfarkt) innerhalb der nächsten Zeit zu rechnen, wird mit Hilfe von invasiver Diagnostik z. B. in Form einer Koronarangiographie eine genauere Diagnose erstellt. Dazu werden Herz und Herzkranzgefäße so- wie andere Gefäße mit Hilfe eines Katheters und Röntgenbestrahlung untersucht. Um das Herz und die Gefäße auf dem Röntgenbild besser sichtbar machen zu können, werden Röntgen-Kontrastmittel verwendet. Als Indikation zur Koronarangiographie gilt eine niedrige oder mittlere Vortest- Wahrscheinlichkeit, wobei die nicht-invasive Diagnostik keine zuverlässigen Ergebnisse ergeben hat. Die Koronarangiographie kann allerdings nur durchgeführt werden, wenn neben den zuvor genannten Voruntersuchungen, verschiedene Komplikationen wie z. B. eine Schilddrüsenüberfunktion oder eine Kontrastmittelallergie ausgeschlossen sind. Weil das Kontrastmittel über die Niere ausgeschieden wird, muss zudem eine ausreichende Nierenfunktion vorliegen. Damit wird deutlich, dass der Bedarf hinsichtlich einer nichtinvasiven Möglichkeit zur frühzeitigen und zuverlässigen Diagnose von vaskulären Erkrankungen besteht. Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel für die Diagnose von vaskulären Erkrankungen bereit zu stellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnostik von vaskulären Erkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwe- 5 senheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen, die Migrationszeit charakterisiert und ggf. ihre Peptidsequenz charakterisiert sind .
Tabelle 1. Polypeptidmarker
24291 1196.32 36.11
25363 1216.54 24.24
25429 1217.53 35.78
26163 1226.53 21.02
26879 1238.56 21.14
26919 1239.43 33.81
26929 1239.51 35.72
28466 1263.54 22.73
29279 1276.40 35.92
29677 1283.37 36.12
30575 1297.58 27.37 SpGSpGPDGKTGPp Collagen alpha-1 (I) chain 543 556
31480 1312.55 29.77
31525 1312.62 22.45
32481 1326.57 21.67
32823 1332.54 21.74
32874 1333.42 36.11
33135 1338.60 23.99
33776 1351.64 38.76
34186 1358.38 36.46
34432 1363.43 36.34
34795 1368.58 21.90
36345 1396.62 28.12 SpGERGETGPpGPAG Collagen alpha-1 (III) chain 796 810
36784 1405.69 23.42
37698 1422.68 28.14
38752 1438.45 36.76
38780 1438.66 29.52 GLpGTGGPpGENGKpG Collagen alpha-1 (III) chain 642 657
38798 1438.67 27.88 GLpGTGGPpGENGKpG Collagen alpha-1 (III) chain 642 657
38910 1440.56 24.30 DEAGSEADHEGTHS Fibrinogen alpha chain 605 618
40091 1449.64 21.86
40487 1457.60 21.93
41431 1466.66 21.87
41770 1473.63 22.21
41833 1474.67 22.44
42216 1483.70 20.65
42304 1485.67 23.77 DGQpGAKGEpGDAGAK Collagen alpha-1 (I) chain 820 835
42867 1496.63 22.34
43828 1512.69 26.62 44592 1523.67 21.97
44679 1524.65 20.03
44718 1525.48 37.16
45503 1540.75 39.98
45980 1552.50 37.21
46184 1556.74 40.03
46606 1562.69 22.46
47285 1575.75 30.20
48089 1579.68 20.06
48131 1580.50 36.39
48751 1592.70 22.18
49243 1593.69 22.38
50008 1609.75 30.20 TGSpGSpGPDGKTGPPGp Collagen alpha-1 (I) chain 541 558
50593 1619.79 40.40
50638 1620.70 22.66
51916 1636.70 20.03
51929 1636.74 22.50
52189 1640.58 23.24
52769 1649.73 22.64
53554 1662.74 30.70
53744 1666.78 30.66 KpGEQGVpGDLGApGPSG Collagen alpha-1 (I) chain 657 674
53800 1667.79 40.56
54846 1687.54 37.79
55582 1697.74 30.88 NGAPG N DGAKGDAGAPGAPG Collagen alpha-1 (I) chain 700 719
56053 1706.78 22.69
57265 1732.77 28.18
57537 1737.78 23.73 NDGApGKNGERGGpGGpGp Collagen alpha-1 (III) chain 586 604
57531 1737.78 31.00 TGSpGSpGPDGKTGPPGpAG Collagen alpha-1 (I) chain 541 560
58355 1754.90 31.26
58941 1765.81 31.00 GPpGEAGKpGEQGVpGDLG Collagen alpha-1 (I) chain 650 668
59745 1782.84 25.91
59773 1783.79 39.82
59793 1784.81 39.92
60628 1806.83 23.06
60751 1807.81 20.65
60816 1808.79 23.72
61221 1817.69 20.23 97 61332 1819.80 23.36
98 61480 1823.77 25.04
99 61573 1825.79 20.13 DEAGSEADHEGTHSTKR Fibrinogen alpha chain 605 621
103
100 63209 1860.83 21.40 EGSpGRDGSpGAKGDRGET Collagen alpha-1 (I) chain 1021
9
101 63916 1876.84 23.38
102 64170 1880.90 43.91
103 64256 1882.80 20.24 DEAGSEADHEGTHSTKRG Fibrinogen alpha chain 605 622
104 64869 1892.77 40.25
105 65998 1913.90 40.96
Prostaglandin-H2
106 67097 1931.90 31.49 APEAQVSVQPNFQQDKF 23 39
D-isomerase; N-term .
107 67386 1936.88 32.24 G E KG PSG EAGTAG PpGTpG PQG Collagen alpha-2 (I) chain 844 865
108 67951 1950.85 35.77
109 68163 1955.88 28.11
110 68701 1969.84 25.23
111 69080 1976.88 32.38
112 69681 1989.88 32.44
113 69979 1996.79 20.98
114 70024 1997.91 25.16
115 70456 2008.90 32.29
116 71599 2030.91 21.85
117 72048 2034.99 40.19
118 72095 2036.90 31.52
119 72240 2040.88 39.35
120 72641 2048.93 24.46
121 72868 2055.14 33.40 VVVKLFDSDPITVTVPVEV Clusterin 405 423
122 74057 2079.00 24.68
123 74987 2089.96 39.52
124 75128 2093.92 33.78
DGQPGAKGEpGDAGAKG-
125 77018 2133.96 27.77 Collagen alpha-1 (I) chain 820 843
DAGPPGp
126 79581 2184.57 35.08
127 79720 2187.95 39.78
128 80551 2199.00 22.31
GNSGEpGApGSKGDTGAK-
129 82026 2226.99 26.28 Collagen alpha-1 (I) chain 431 455
GEpGPVG GKNGDDGEAGKPGRpGERGPpG
130 82509 2233.05 20.51 Collagen alpha-1 (I) chain 227 249
P
GKNGDDGEAGKpGRpGERGpPG
131 83577 2249.04 20.53 Collagen alpha-1 (I) chain 227 249
P
132 86785 2310.06 41.31
133 88093 2336.04 26.66
134 90013 2370.12 30.74
135 90054 2371.08 22.79
136 90989 2392.65 35.59
137 91044 2394.08 23.64
GPPGADGQpGAKGEpGDA-
138 96875 2529.14 28.25 GAKGDA Collagen alpha-1 (I) chain 815 843
GpPGP
139 97599 2547.99 21.44
DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKS
140 98089 2559.18 19.41 Fibrinogen alpha chain 605 628
RP
141 98899 2567.20 28.21
142 99021 2570.19 42.56
143 100991 2612.21 34.91
144 102924 2647.20 23.47
145 104954 2682.14 22.49
146 106667 2726.28 42.94
147 107016 2733.78 34.16
148 111304 2834.19 22.47
149 112106 2854.36 34.86
150 113910 2903.36 35.71
151 114086 2907.35 35.96
152 116543 2973.45 24.37
153 117009 2977.37 29.12
Die Auswertung der gemessenen Polypeptide kann anhand der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker unter Berücksichtigung der folgenden Grenzwerte erfolgen :
5 Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch-Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesun- den Personen als gesund erkennt, d .h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt.
Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben ge- teilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch-Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für vaskuläre Erkran- kungen eine Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für vaskuläre Erkrankungen eine Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Zur Analyse der An- oder Abwesenheit bzw. Amplitude werden folgende Werte zugrundeg
Tabelle 2 :
21147 1150,56 22,4 71% 209 53% 147 1,9
21365 1154,51 25,7 77% 276 71% 584 -2,0
22625 1169,57 23,7 46% 41 39% 63 -1,3
22885 1174,54 38,1 22% 50 32% 87 -2,5
23724 1187,36 35,7 61% 525 80% 1082 -2,7
24291 1196,32 36,1 98% 18682 97% 32361 -1,7
25363 1216,54 24,2 89% 738 80% 1604 -2,0
25429 1217,53 35,8 54% 1454 27% 854 3,4
26163 1226,53 21,0 66% 330 76% 586 -2,0
26879 1238,56 21,1 17% 46 19% 47 -ι,ι
26919 1239,43 33,8 44% 176 20% 81 4,8
26929 1239,51 35,7 26% 142 48% 614 -8,0
28466 1263,54 22,7 58% 208 81% 601 -4,0
29279 1276,40 35,9 91% 3155 99% 5853 -2,0
29677 1283,37 36,1 89% 464 89% 638 -1,4
30575 1297,58 27,4 45% 662 81% 4441 -12,1
31480 1312,55 29,8 98% 1603 94% 2021 -1,2
31525 1312,62 22,5 78% 604 68% 675 -ι,ο
32481 1326,57 21,7 25% 51 23% 48 1,2
32823 1332,54 21,7 53% 408 10% 102 21,1
32874 1333,42 36,1 53% 77 59% 128 -1,9
33135 1338,60 24,0 80% 288 59% 258 1,5
33776 1351,64 38,8 65% 158 43% 158 1,5
34186 1358,38 36,5 96% 2051 96% 2797 -1,4
34432 1363,43 36,3 98% 1828 99% 3211 -1,8
34795 1368,58 21,9 29% 97 35% 154 -1,9
36345 1396,62 28,1 75% 488 62% 757 -1,3
36784 1405,69 23,4 75% 267 67% 297 -ι,ο
37698 1422,68 28,1 74% 2053 81% 3255 -1,7
38752 1438,45 36,8 97% 5564 99% 8313 -1,5
38780 1438,66 30,2 31% 90 35% 171 -2,1
38798 1438,67 27,9 98% 3225 95% 6756 -2,0
38910 1440,56 24,3 35% 77 44% 128 -2,1
40091 1449,64 21,9 99% 5122 97% 6380 -1,2
40487 1457,60 21,9 26% 45 28% 75 -1,8
41431 1466,66 21,9 100% 2801 98% 3314 -1,2
41770 1473,63 22,2 39% 231 42% 439 -2,0
41833 1474,67 22,4 56% 429 53% 540 -1,2
42216 1483,70 20,7 57% 157 41% 177 -0,8
42304 1485,67 23,8 96% 1111 88% 1138 -0,9
42867 1496,63 22,3 21% 25 23% 52 -2,3
43828 1512,69 26,6 54% 65 25% 37 3,8
44592 1523,67 22,0 93% 4861 96% 7108 -1,5
44679 1524,65 20,0 89% 526 74% 619 -ι,ο
44718 1525,48 37,2 100% 2505 99% 3428 -1,4
45503 1540,75 40,0 34% 866 55% 1217 -2,3
45980 1552,50 37,2 95% 2320 92% 3635 -1,5 46184 1556,74 40,0 40% 320 49% 428 -1,6
46606 1562,69 22,5 80% 1276 75% 1421 -ι,ο
47285 1575,75 30,2 57% 148 35% 826 -3,4
48089 1579,68 20,1 99% 8298 100% 12271 -1,5
48131 1580,50 36,4 23% 158 17% 171 -0,8
48751 1592,70 22,2 66% 351 73% 518 -1,6
49243 1593,69 22,4 36% 97 43% 125 -1,5
50008 1609,75 30,2 63% 528 54% 661 -ι,ι
50593 1619,79 40,4 56% 118 22% 51 5,8
50638 1620,70 22,7 25% 84 48% 210 -4,8
51916 1636,70 20,0 84% 856 87% 1765 -2,1
51929 1636,74 22,5 99% 12206 99% 14540 -1,2
52189 1640,58 23,2 94% 4862 96% 7587 -1,6
52769 1649,73 22,6 80% 707 79% 838 -1,2
53554 1662,74 30,7 31% 46 33% 106 -2,5
53744 1666,78 30,7 61% 159 73% 413 -3,1
53800 1667,79 40,6 45% 293 21% 116 5,4
54846 1687,54 37,8 89% 229 62% 177 1,9
55582 1697,74 30,9 93% 1081 90% 1354 -1,2
56053 1706,78 22,7 98% 880 93% 1357 -1,5
57265 1732,77 28,2 79% 2155 93% 2915 -1,6
57537 1737,78 23,7 100% 5346 96% 6769 -1,2
57531 1737,78 31,0 88% 2357 93% 3345 -1,5
58355 1754,90 31,3 88% 5814 58% 4585 1,9
58941 1765,81 31,0 85% 1586 80% 1622 -ι,ο
59745 1782,84 25,9 62% 407 58% 268 1,6
59773 1783,79 39,8 55% 219 60% 274 -1,4
59793 1784,81 39,9 42% 228 25% 119 3,2
60628 1806,83 23,1 70% 207 66% 235 -ι,ι
60751 1807,81 20,7 95% 1928 94% 3116 -1,6
60816 1808,79 23,7 45% 128 51% 190 -1,7
61221 1817,69 20,2 97% 3122 98% 4734 -1,5
61332 1819,80 23,4 100% 4640 99% 6251 -1,3
61480 1823,77 25,0 36% 109 40% 120 -1,2
61573 1825,79 20,1 94% 1756 93% 2406 -1,4
63209 1860,83 21,4 50% 430 75% 1000 -3,5
63916 1876,84 23,4 75% 292 73% 295 -ι,ο
64170 1880,90 43,9 49% 456 64% 729 -2,1
64256 1882,80 20,2 100% 25031 100% 36640 -1,5
64869 1892,77 40,3 29% 221 26% 477 -1,9
65998 1913,90 41,0 55% 147 33% 80 3,1
67097 1931,90 31,5 40% 79 20% 30 5,3
67386 1936,88 32,2 91% 315 85% 370 -ι,ι
67951 1950,85 35,8 84% 714 84% 780 -ι,ι
68163 1955,88 28,1 68% 301 52% 249 1,6
68701 1969,84 25,2 75% 771 71% 701 1,2
69080 1976,88 32,4 36% 164 47% 219 -1,7 112 69681 1989,88 32,4 86% 272 84% 320 -ι,ι
113 69979 1996,79 21,0 82% 561 83% 1253 -2,3
114 70024 1997,91 25,2 65% 208 26% 56 9,2
115 70456 2008,90 32,3 24% 360 27% 250 1,3
116 71599 2030,91 21,9 42% 118 16% 39 7,9
117 72048 2034,99 40,2 43% 72 48% 126 -2,0
118 72095 2036,90 31,5 47% 51 21% 28 4,0
119 72240 2040,88 39,4 25% 49 16% 27 2,9
120 72641 2048,93 24,5 96% 1499 93% 1409 1,1
121 72868 2055,14 33,4 30% 195 16% 111 3,3
122 74057 2079,00 24,7 55% 170 49% 182 -ι,ο
123 74987 2089,96 39,5 50% 141 33% 100 2,1
124 75128 2093,92 33,8 46% 115 31% 77 2,2
125 77018 2133,96 27,8 96% 4175 94% 2918 1,5
126 79581 2184,57 35,1 82% 570 69% 564 1,2
127 79720 2187,95 39,8 95% 1501 93% 1451 1,1
128 80551 2199,00 22,3 46% 81 24% 60 2,6
129 82026 2226,99 26,3 74% 10980 93% 17324 -2,0
130 82509 2233,04 20,5 78% 413 52% 344 1,8
131 83577 2249,04 20,5 64% 307 49% 323 -0,8
132 86785 2310,06 41,3 63% 155 58% 191 -ι,ι
133 88093 2336,04 26,7 48% 82 9% 10 42,0
134 90013 2370,12 30,7 23% 39 19% 34 1,4
135 90054 2371,08 22,8 66% 182 36% 66 5,1
136 90989 2392,65 35,6 25% 179 23% 140 1,4
137 91044 2394,08 23,6 42% 143 18% 50 6,6
138 96875 2529,14 28,3 45% 111 12% 19 21,7
139 97599 2547,99 21,4 65% 289 37% 223 2,3
140 98089 2559,18 19,4 60% 1075 44% 790 1,9
141 98899 2567,20 28,2 53% 197 24% 64 6,8
142 99021 2570,19 42,6 95% 7702 82% 5976 1,5
143 100991 2612,21 34,9 87% 711 74% 428 2,0
144 102924 2647,20 23,5 68% 129 37% 135 -0,6
145 104954 2682,14 22,5 96% 1032 93% 1167 -ι,ι
146 106667 2726,28 42,9 91% 5136 77% 3966 1,5
147 107016 2733,78 34,2 61% 184 36% 84 3,7
148 111304 2834,19 22,5 42% 84 37% 75 1,3
149 112106 2854,36 34,9 98% 4323 85% 3723 1,3
150 113910 2903,36 35,7 42% 36 15% 11 8,9
151 114086 2907,35 36,0 76% 314 34% 80 8,8
152 116543 2973,45 24,4 70% 408 42% 212 3,2
153 117009 2977,37 29,1 75% 253 38% 101 5,0
*)
Wenn Mittelwert(VE) > Mittelwert(Kontrolle): Frequenz(VE)*Mittelwert(VE)/ Fre- quenz(Kontrolle)*Mittelwert(Kontrolle)
Wenn Mittelwert(VE) < Mittelwert(Kontrolle): -(Frequenz(Kontrolle)*Mittelwert(Kontrolle) / Fre- quenz(VE)*Mittelwert(VE))
Masse in Dalton CE-Zeit in Minuten
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z. B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - be- stimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 pm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 pm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z. B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in der Tabelle 1 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,1%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,05%, mehr bevorzugt ± 0,03%, noch mehr bevorzugt ± 0,01% oder 0,005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z. B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktio- nen, z. B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z. B. oxidiert, sein. Ausgehend von den Parametern, die die Poly- peptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um vaskuläre Erkran- kungen zu diagnostizieren. Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung . Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter un- ten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend . Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel). Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für die vaskuläre Erkrankungen ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit vaskulären Erkrankungen vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne vaskuläre Erkrankungen seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit vaskulären Erkrankungen vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne vaskuläre Erkrankungen nicht oder nur seltener vorhanden sind .
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An- oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. Dabei sind zwei Nominierungsverfahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amp- lituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben. Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzel- nen Proben und den Referenzwerten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt.
Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer vaskulären Erkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer vaskulären Erkrankung auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden. Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in eini- gen Proben die Amplitude so gering ist, dass sie unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Amplitudenmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an vaskulären Erkrankungen leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden .
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemä- ßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebe- flüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pank- reassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z. B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Poly- peptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z. B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Um- kehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (> 100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massens- pektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0.1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0.01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces ver- wendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix- assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of- flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u .a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z. B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung .
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypep- tidmarkern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorpti- ons/Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophore- se-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird . Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A, 2003, Bd. 1013 : 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25 : 2044-2055) und bei Wittke et al . (J. Chromatogr. A, 2003, 1013 : 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen . Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von vaskuläre Erkrankungen zu verwen- den. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF- MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 pm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden. In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptid markern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteil- hafter Weise mehrere Polypeptidmarker zur Diagnostik verwendet werden. Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al . {Kidney Int., 2004, 65 : 2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an vaskulären Erkrankungen leiden, abgenommen. Für die nachfolgende CE- MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μΙ Urin entnommen und mit 700 pm Filtrationspuffer (2M Harnstoff, lOmM Ammoniak, 0.02% SDS) versetzt. Diese 1.4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1.1 ml Ult- rafiltrat erhalten wurden .
Die erhaltenen 1.1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und mit 2.5 ml einer 0.01% NH4OH eluiert und lyophil liser . Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μΙ Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert. 2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Inc, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt. Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 pm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0.25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0.5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μΙ/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert. Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine„Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung . Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert. Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0.1 psi, für 2 min 0.2 psi, für 2 min 0.3 psi, für 2 min 0.4 psi, abschließend 32 min bei 0.5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.
3. Standards für die CE-Messunq Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind :
Protein/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat. Nr. A1153) 19.3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat. Nr.; R4875 19.55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat. Nr. ; L7651 19.28 min "REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQIIS 20.95 min "ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min "KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22.62 min "GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32.2 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μΙ in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorge- hen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertig gestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird. Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im Wesentlichen linearer Zusammenhang besteht. In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuord- nung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Co-migrierende Peptide co-migrieren aber auch unter solchen Bedingungen.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al . in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit aufträgt, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuord- nung der einzelnen Polypeptide möglich. Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik von vaskuläre Erkrankungen umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei der Poly- peptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker anhand der in Tabelle 2 aufgeführten Referenzwerte erfolgt.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Probe eines Individuums eine Mittelstrahlurinprobe.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektromet- rie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Massenspektromet- rie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird .
8. Verwendung von mindestens drei Polypeptidmarker ausgewählt aus den Markern gemäß Tabelle 1, die durch die Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert ist, zur Diagnostik von vaskulären Erkrankungen.
9. Verfahren zur Diagnose von vaskulären Erkrankungen umfassend die Schritte a) der Auftrennung einer Probe in mindestens fünf, bevorzugt 10 Teilproben,
b) Analyse von mindestens fünf Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei mindestens 10 Teilproben gemessen werden.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 pm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 bis 11, wobei die Sensitivität mindestens 60% und der Spezifität mindestens 40% beträgt.
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