Autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankunq (ADPKD)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Diagnose von autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung.
Autosomale-dominant polyzystische Nierenerkrankung (Autosomal-Dominant- Polycistic Kidney Disease, ADPKD) ist eine der häufigsten humanen monogenetischen Erkrankungen mit einer Häufigkeit zwischen 1 :400 bis 1 : 1.000. Die Krankheit zeigt eine fortschreitende Entwicklung und Vergrößerung von flüssigkeitsgefüllten Vesikeln bzw. Bläschen in beiden Nieren, die die Funktionsfähigkeit der Nieren erheblich einschränkt. Bis zum 60. Lebensjahr werden ca. 50% der betroffenen Er- krankten dialysepflichtig.
Die Entwicklung der Zysten ist ein komplexer Vorgang, der phänotypisch einer Dedifferenzierung gleicht unter anderem mit hohen Proliferationsraten, erhöhter Apoptose, veränderter Proteinsortierung, geänderten sekretorischen Eigenschaften und einer Disorganisation der extrazellulären Matrix. Obwohl die in der Niere auftretenden Zysten das signifikanteste Symptom darstellen, treten bei den Patienten auch Zystenbildungen außerhalb der Nieren auf, insbesondere in der Leber (gelegentlich bis hin zu den Symptomen der polyzystischen Lebererkrankung) sowie eine erhöhte Häufigkeit von anderen Störungen wie intercranialen Aneurysmen. Dies zeigt, dass ADPKD eine systemische Erkrankung ist.
ADPKD ist die häufigste lebensbedrohliche Erbkrankheit. Die Häufigkeit von ADPKD ist größer als die von Huntington, Hämophilie, Sichelzellanämie, zystischer Fibrose, myotone Dystrophie und Downsyndrom zusammen.
In den letzten Jahren gab es nicht nur Fortschritte im Verständnis der genetischen und molekularen Grundlagen der ADPKD, auch einige diagnostische und therapeutische Ansätze wurden entwickelt.
Auf dem Gebiet der Genetik wurde das Gen für PKD-I auf dem Chromosom 16 lokalisiert und ist assoziiert mit dem Polycystin-1 Protein, das bei ca. 85% aller Patienten mit ADPKD mutiert ist. Das Gen für PKD-2, das auf Chromosom 4 lokalisiert ist, ist bei 15% der ADPKD Fälle mutiert und ist assoziiert mit dem Polycystin-2 Protein.
Während die Erkenntnisse der Genetik und der Molekularbiologie zahlreiche interessante Projekte der Grundlagenforschung angestoßen haben, hat es jedoch im Bereich der Therapie keine relevanten Forschritte gegeben. Eine Früherkennung und die Behandlung mit Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems hat das Potenzial, die mit ADPKD häufig einhergehenden hypertrophen Erscheinungen des linken Ventrikels des Herzens zu verhindern und den Fortschritt der Erkrankung zu verzögern.
Die Frühdiagnose der Erkrankung ist damit der Schlüssel zu einer frühen Behandlung und einer Verzögerung des Krankheitsablaufs. Des weiteren ist eine Prognose des Krankheitsverlaufs wichtig, da die therapiebedingten Kosten und Nebenwirkungen nur bei Patienten mit rascher Progression in Kauf genommen werden sollen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Möglichkeit der Diagnose von ADPKD zur Verfügung zu stellen. Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur
Diagnostik wie Anspruch 1 einer autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Mi rationszeit charakterisiert sind.
Diese Methode kann auch zur Frühdiagnose sowie zur Prognose der weiteren Krankheitsentwicklung genutzt werden.
Zur Auswertung der gemessenen An- oder Abwesenheiten oder Amplituden der Marker kann auf folgende Referenzwerte zurückgegriffen werden :
Tabelle 2
Es wird bevorzugt, dass mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Tabelle 1 definiert sind.
Bevorzugt handelt es sich bei der Urinprobe um eine Mittelstrahlurinprobe. Die Verwendung einer humanen Urinprobe ist bevorzugt.
Die Messung der Amplituden und/oder An- oder Abwesenheit kann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen. Geeignete Verfahren sind unter anderem Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspekt- rometrie.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt.
Massenspektrometrie ist zur Messung der Amplitude oder der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker besonders geeignet.
Erfindungsgemäß weist das Verfahren bevorzugt eine Sensitivität von mindestens 60% und eine Spezifität von mindestens 60% auf. Bevorzugt liegt die Sensitivität bei mindestens 70% oder mindestens 80% und die Spezifität bei mindestens 70% oder mindestens 80%.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt zunächst eine Auftrennung der Probe in mindestens drei, bevorzugt mindestens 5 oder 10 Teilproben. Anschließend erfolgt eine Analyse von mindestens drei, bevorzugt mindestens 5 oder 10 Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
Die in den Tabellen angegebenen CE-Zeit sind bezogen auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird. Einzelheiten sind im experimentellen Teil enthalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch-Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt.
Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch- Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für die angegebene Erkrankung, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Durch die erfindungsgemäßen Marker ist es möglich, für die angegebene Erkrankung, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben.
Als Laufmittel kann zum Beispiel auch 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet werden.
Es kann prinzipiell auch mit höheren Ameisensäuregehalten gearbeitet werden, z.B. 0,25%, 0,5%, 0,75% oder 1%.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiele).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156), Coon et al., Proteomics Clin. Appl., 2, 964-973 (2008) und Jantos-Siwy et al., J Proteome Res, in press (Epub Nov 14 2008) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,01% oder 0,005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die
Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein.
Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um ADPKD zu diagnostizieren.
Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird die An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auch Differentialdiagnostik genutzt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für ADPKD ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit ADPKD vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne ADPKD seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit ADPKD vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne ADPKD nicht oder nur seltener vorhanden sind.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In den Tabellen sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsverfahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben.
Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale
einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert, wie z.B. in Theodorescu et al, Electrophoresis, 26: 2797-808 (2005), ausgeführt. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Referen zweiten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt.
Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patientenoder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer ADPKD auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer ADPKD auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden.
Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Ampli- tudenmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an ADPKD leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet, um Differentialdiagnostik zu ermöglichen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pankreassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoreti- sche Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrpha- sen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (> 100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen-
bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser- desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan- Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25: 2044- 2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von UAS zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere Polypeptidmarker zur Diagnostik verwendet werden.
Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die Linearkombination von individuellen Signalen dar, wie z.B. in Rossing et al., J Am Soc Nephral. (2008) 19(7) : 1283-90, beschrieben.
Figur 1 zeigt die summierten Daten von Urinproben von Kontrollpatienten und ADPKD Patienten.
Figur 2 zeigt die "Receiver Operating Characteristic" Kurven für das Training und das Testset.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe), Patienten, die an einer chro-
nischen Nierenerkrankung oder Nieren- oder Blasenkarzinom ("Krankheitskontrolle") sowie Patienten, die an ADPKD leiden, abgenommen.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μl Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultrafiltrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und gegen 2,5 ml 0,01% NH4OH entsalzt und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 17 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 65 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.
3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind :
Protein/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19,3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 19,55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 19,28 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYG RQIIS 20,95 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,49 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22,62 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32,2 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE- Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE- Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertiggestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im wesentlichen linearer Zusammenhang besteht.
In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Comigrierende Peptide comigrieren aber auch unter solchen Bedingungen.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich.
Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.
Prüfung der Marker
Zuerst wurden Urinproben von 17 Patienten mit ADPKD verglichen mit 86 Proben von als gesund eingestuften Kontrollpatienten. Die summierten Daten sind in Figur 1 dargestellt. Es gelang die Identifizierung von 383 Biomarkern, die statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zeigen.
In einem Testmodell zur Auswertung konnte eine Unterscheidung mit einer 100%igen Sensitivität und einer 98,8%igen Spezifität erreicht werden.
Zur Validierung der Marker wurden 150 weitere Proben untersucht und mit dem erstellen Model geprüft. Die Sensitivität war 87,5% und die Spezifität war 97,5%. Die ROC-Kurven für das Training- und auch das Testset sind in Figur 2 gezeigt.
Um die Spezifität der Biomarker für ADPKD zu überprüfen, wurden weiteren Kontrollen hinzugenommen. Mit gesunden Kontrollen ergab sich eine Spezifität von 93%, für Patienten mit anderen chronischen Nierenerkrankungen eine 95% Spezifität, für Blasenkrebs 85% Spezifität und für Nierentumore 83% Spezifität.
Außerdem wurde eine Gruppe von Gesunden mit einem Alter > 60 Jahre hinzugefügt. Hier zeigte sich eine Spezifität von nur 69%.
Für einige der 383 potentielle Biomarker war es möglich, Sequenzinformationen zu ermitteln. Bei einer Analyse nur aufbauend aus den 75 sequenzierten Peptiden ergab sich im Trainingset eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 95,5%. Nach Crossvalidierung wurde eine Sensitivität on 94,1% und eine Spezifität von 94,2% erhalten. Dieses Model wurde wieder gegen ein Testset getestete. Hier betrug die Sensitivität 66,7% und die Spezifität 99,1%. Es zeigt sich, dass die zusätzlichen bisher noch nicht sequenzierten Biomarker die Leistungsfähigkeit der Diagnostik weiter erhöhen.
Allerdings zeigten die 75 Biomarker bereits eine AUC von 0,89, sind also hervorragend geeignet.
Die hier erhaltenen Sequenzinformationen sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3: '''NrVl'''''''''''''''''''''''''^ Name j Start AA I Stop AA I
1 KGDTGPpGP Collagen alpha-1 (IM) chain 629 637
17 VLNLGPITR Uromodulin 598 606
19 YQTNKAKH Cystatin-B 85 92
24 ApGDKGESGPS Collagen alpha-1 (I) chain 777 787
Seqüence fsfam© | Stert,,,M| Stop,,,AAl SpGPDGKTGPp Collagen alpha-1 (I) chain 546 556 ApGDRGEpGPp Collagen alpha-1 (I) chain 798 808 GPPGppGpPGPPS Collagen alpha-1 (I) chain 1181 1193 MIEQNTKSPL Alpha-1 -antitrypsin 398 407 DDGEAGKpGRpG Collagen alpha-1 (I) chain 231 242 SpGPDGKTGPPGp Collagen alpha-1 (I) chain 546 558 GPpGEAGKpGEQG Collagen alpha-1 (I) chain 650 662 DKGETGEQGDRG Collagen alpha-1 (I) chain 1095 1106 SpGSpGPDGKTGPp Collagen alpha-1 (I) chain 543 556 DSGSSEEQGGSSRA Polymeric-immunoglobulin receptor 626 639 GSpGGpGSDGKpGPpG Collagen alpha-1 (IM) chain 540 555 GLPGPpGPpGSFLSN Collagen alpha-1 (XVII) chain 885 899 PpGKNGDDGEAGKpG Collagen alpha-1 (I) chain 225 239 SpGSPGPDGKTGPpGP Collagen alpha-1 (I) chain 543 558 GLpGTGGPpGENGKpG Collagen alpha-1 (IM) chain 642 657 TIDEKGTEAAGAMF Alpha-1 -antitrypsin 363 376 ApGKNGERGGpGGpGP Collagen alpha-1 (IM) chain 589 604 DQSRVLNLGPITR Uromodulin 594 606 DGQPGAKGEpGDAGAK Collagen alpha-1 (I) chain 820 835 GPpGKNGDDGEAGKpG Collagen alpha-1 (I) chain 224 239 VGPpGpPGPPGPPGPPS Collagen alpha-1 (I) chain 1174 1190 SpGSpGPDGKTGPPGpA Collagen alpha-1 (I) chain 543 559 VIDQSRVLNLGPIT Uromodulin 592 605 PpGEAGKpGEQGVpGD Collagen alpha-1 (I) chain 651 666 DGQpGAKGEpGDAGAKG Collagen alpha-1 (I) chain 820 836 GSEADHEGTHSTKRG Fibrinogen alpha chain 608 622 SpGSpGPDGKTGPPGpAG Collagen alpha-1 (I) chain 543 560 IDQSRVLNLGPITR Uromodulin 593 606 TGLSMDGGGSPKGDVDP NA/K-ATPase gamma chain 2 18 DGApGKNGERGGpGGpGP Collagen alpha-1 (IM) chain 587 604 EGSpGRDGSpGAKGDRG Collagen alpha-1 (I) chain 1021 1037 VGPpGPpGPpGPPGPPSAG Collagen alpha-1 (I) chain 1177 1195 AGSEADHEGTHSTKRG Fibrinogen alpha chain 607 622 SGSVIDQSRVLNLGPI Uromodulin 589 604 KpGEQGVpGDLGApGPSG Collagen alpha-1 (I) chain 657 674 VIDQSRVLNLGPITR Uromodulin 592 606 GLpGTGGPpGENGKpGEp Collagen alpha-1 (IM) chain 642 659 DHDVGSELPPEGVLGAL ProSAAS 223 239 GLpGTGGPpGENGKPGEPGp Collagen alpha-1 (IM) chain 642 661 GLpGTGGPpGENGKpGEPGp Collagen alpha-1 (IM) chain 642 661 EGSpGRDGSpGAKGDRGET Collagen alpha-1 (I) chain 1021 1039 SGSVIDQSRVLNLGPITR Uromodulin 589 606 DGESGRPGRPGERGLPGPPG Collagen alpha-1 (IM) chain 230 249 AGpPGPPGppGTSGHpGSpGSpG Collagen alpha-1 (IM) chain 176 198 NSGEpGApGSKGDTGAKGEpGP Collagen alpha-1 (I) chain 432 453 EGSpGRDGSpGAKGDRGETGP Collagen alpha-1 (I) chain 1021 1041 SGSVIDQSRVLNLGPITRK Uromodulin 589 607 DAGApGApGGKGDAGApGERGPpG Collagen alpha-1 (IM) chain 586 604 GAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPG Collagen alpha-1 (I) chain 701 725 NGEpGGKGERGApGEKGEGGpPG Collagen alpha-1 (IM) chain 818 840 AGPpGEAGKpGEQGVpGDLGAPGP Collagen alpha-1 (I) chain 646 669 GRTGDAGPVGPPGPpGppGpPGPPS Collagen alpha-1 (I) chain 1169 1193 QNGEpGGKGERGAPGEKGEGGppG Collagen alpha-1 (IM) chain 817 840 ADGQpGAKGEpGDAGAKGDAGpPGPAGP Collagen alpha-1 (I) chain 819 846 TGPIGPpGPAGApGDKGESGPSGPAGPTG Collagen alpha-1 (I) chain 766 794 GPpGADGQpGAKGEpGDAGAKGDAGpPGP Collagen alpha-1 (I) chain 815 843
LILI Seqüence fsfam© | Stert,,,M| Stop,,,AAl
266 DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRP Fibrinogen alpha chain 605 628
268 DDILASPPRLPEPQPYPGAPHHSS Collagen alpha- 1 (XVIII) chain 1296 1319
271 AGPpGApGApGApGPVGPAGKSGDRGETGP Collagen alpha-1 (I) chain 1042 1071
273 QGpPGPSGEEGKRGPNGEAGSAGPPGppG Collagen alpha-2 (I) chain 369 397
280 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL Serum albumin; N-term. 25 48
281 KEGGKGPRGETGPAGRpGEVGpPGPpGPAG Collagen alpha-1 (I) chain 903 932
282 ERGEAGIpGVpGAKGEDGKDGSpGEpGANG Collagen alpha-1 (IM) chain 448 477 288 ESGREGApGAEGSpGRDGSpGAKGDRGETGP Collagen alpha-1 (I) chain 1011 1041 293 LTGSpGSpGpDGKTGPPGPAGQDGRPGPpGppG Collagen alpha-1 (I) chain 537 569 302 PpGESGREGAP- Collagen alpha-1 (I) chain 1008 1041
GAEGSpGRDGSpGAKGDRGETGP 312 NTGApGSpGVSGpKGDAGQp- Collagen alpha-1 (IM) chain 910 946
GEKGSPGAQGPPGAPGp
316 EEKAVADTRDQADGSRASVDSGSSEEQGGSSRA Polymeric-immunoglobulin receptor 607 639 320 ARGNDGARGSDGQPGPpGppGTAGFpGSpGAK- Collagen alpha-1 (IM) chain 319 355
GEVGP 325 NTGAPGSpGVSGpKGDAGQpGEKGSpGAQGpPG Collagen alpha-1 (IM) chain 910 948
APGPLG 334 GRPEAQPPPLSSEHKEPVAGDAVPGPKDGSAPE Neurosecretory protein VGF 26 62
VRGA