EP2449385A1 - Verfahren und marker zur diagnose eines akuten nierenversagens - Google Patents

Verfahren und marker zur diagnose eines akuten nierenversagens

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Publication number
EP2449385A1
EP2449385A1 EP10729860A EP10729860A EP2449385A1 EP 2449385 A1 EP2449385 A1 EP 2449385A1 EP 10729860 A EP10729860 A EP 10729860A EP 10729860 A EP10729860 A EP 10729860A EP 2449385 A1 EP2449385 A1 EP 2449385A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
markers
polypeptide
sample
absence
renal failure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10729860A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP10729860A priority Critical patent/EP2449385A1/de
Publication of EP2449385A1 publication Critical patent/EP2449385A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis of acute renal failure.
  • Acute renal failure is characterized by an abrupt decrease in kidney function.
  • causes of the abrupt loss of function of the kidney include a lack of supply of kidney tissue with oxygen, an accidental or surgical fluid loss, the presence of sepsis or drug incompatibility (Lameire et al., Lancet, 2005, Vol. 365, page 417-430, Schrier and Wang, N Engl J Med, 2004, Vol. 351, pages 159-169, Thadhani et al., N Engl J Med, 1996, Vol. 334, pages 1448-1460).
  • the proximal tubule cells are damaged in the course of which mucoprotein cylinders are formed by the cells. These then lead to a loss of renal function via obstruction (Patel et al., Lancet, 1964, BD 29, pages 457-461).
  • Acute renal failure can only be detected late by an increase in serum creatinine (Herget-Rosenthal, Lancet, 2005, Vol. 365, pages 1205-1206, Mehta et al., Crit Care, 2007, Vol. 11, R31).
  • efforts have been made in recent years to identify diagnostic markers which allow a reliable diagnosis of acute renal failure prior to clinical manifestation (Vaidya et al., Clin Transl. Sei, 2008, Vol. 1, page 200-208).
  • biomarker candidates include: neutrophilic gelatinase-associated lipocalin, Kidney Injector Molecule-1, N-acetyl-beta-D-glucoaminidase, interleukin-18 and cystatin C (Nguyen, Pediatric Nephral, 2008, Bd. 23, pages 2151-2157). Due to the heterogeneous nature of acute renal failure, however, these markers also do not adequately form the disease.
  • the object is achieved by a method for diagnosing acute renal failure, comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers shown in Table 1 by values for the molecular masses and the migration time are characterized.
  • Table 1 List of markers that enable the early diagnosis of Acute Renal Failure in a multi-marker model.
  • amino acid sequence is known. This is listed in Table 2 together with the associated precursor protein.
  • AKI Acute Kidney Insufficiency
  • the evaluation of the measured polypeptides can be based on the presence or absence or amplitude of the markers taking into account the following limits:
  • Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives. A specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, i. no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients.
  • Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives. A sensitivity of 100% means that the test is all Sick recognizes. He does not say how well the test detects healthy people.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a specificity of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 85%, for acute renal failure.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a sensitivity of at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 85%, for acute renal failure.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. be the polypeptides given in the examples (see example point 3). Variation in CE time is relatively small between individual measurements, typically in the range of ⁇ 2 min, preferably in the range of ⁇ 1 min, more preferably ⁇ 0.5 min, even more preferably ⁇ 0.2 min or 0.1 minute
  • the characterization of the polypeptides shown in Tables 1 to 4 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a procedure described in detail, for example, by Neuhoff et al. (Rapid communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the variation of molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ⁇ 0.1%, preferably in the range of ⁇ 0.05%, more preferably ⁇ 0.03%, even more preferably ⁇ 0.01% or 0.005%.
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be.
  • polypeptide markers molecular mass and migration time
  • polypeptides of the invention are used to diagnose acute renal failure.
  • Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury.
  • the presence or absence of certain polypeptide markers is also used for differential diagnosis.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold can either be through the sensitivity of the measuring method (detection limit) or defined on the basis of experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of the early diagnosis of acute renal failure.
  • polypeptide markers that are typically present in individuals with chronic kidney disease, but are less common or non-existent in individuals without acute renal failure.
  • polypeptide markers that are present in patients with acute renal failure but are not or only rarely present in patients with chronic kidney disease.
  • amplitude markers can also be used for diagnosis.
  • Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • the tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • amplitude markers via an alternative standardization procedure: in this case, all peptide signals of a sample are scaled with a common normalization factor. For this purpose, a linear regression is formed between the peptide amplitudes of the individual samples and the reference values of all known polypeptides. The increase in the regression line just corresponds to the relative concentration and is used as a normalization factor for this sample.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it is to be assumed that there is an acute renal failure, it corresponds more to the mean amplitudes of the control group, is not to be assumed by acute renal failure.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - is included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined, can be any individual in whom acute renal failure can occur.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tear fluid, tissue sample, sperm, vaginal fluid or stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the individual may be analyzed prior to the measurement of the presence or absence of the or the polymer.
  • Peptide markers pretreated by any suitable means and, for example, be purified or separated.
  • the treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by ion exchange chromatography, or electrophoretic separation.
  • a subsample means that the sample has been divided into several parts that differ. In a simple form, this may be e.g. is a membrane filtration that separates larger and smaller ingredients of the sample into two subsamples.
  • it may be a chromatographic separation that separates the sample into a plurality of subsamples ("fractions").
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, this Procedure can be preceded by a purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass pectrometry it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, ie 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples
  • matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from a sample crystallized with a matrix.
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used to analyze the resulting ions.
  • electrospray ionization the molecules present in solution i.a. under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets which become smaller by evaporation of the solvent.
  • high voltage e.g. 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases, it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of acute renal failure. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and an acid (e.g., 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can advantageously be used for diagnostics.
  • markers are used.
  • the markers are selected from the markers with the protein ID:
  • the markers are selected from the markers with the protein ID:
  • the markers or a subset of the markers are selected, which are characterized by the following numbers:
  • markers having the following protein ID are used:
  • the markers are selected from the markers with the protein ID:
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) and from patients with kidney disease.
  • proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE).
  • the UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml ultrafiltrate was obtained.
  • CE-MS measurements were carried out using a Beckman Coulter capillary electrophoresis system (P / ACE MDQ system, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water.
  • 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used. used here, with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was realized by a CE-ESI-MS sprayer kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE).
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "stacking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) before injecting the sample, and then injecting a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 32 min at 0.5 psi.
  • the total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas” was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection. The spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds.
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV "REV”, "ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.

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Abstract

Verfahren zur Diagnostik eines Akuten Nierenversagens umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker zu den Markern gehört, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.

Description

Verfahren und Marker zur Diagnose eines Akuten Nierenversagens
Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose eines Akuten Nierenversagens. Ein Akutes Nierenversagen ist gekennzeichnet durch eine abrupte Abnahme der Nierenfunktion. Ursächlich für den abrupten Funktionsverlust der Niere sind unter anderem eine Minderversorgung des Nierengewebes mit Sauerstoff, ein unfall- oder operationsbedingter Flüssigkeitsverlust, das Vorliegen einer Sepsis oder einer Medikamentenunverträglichkeit (Lameire et al., Lancet, 2005, Bd. 365, Seite 417-430, Schrier und Wang, N Engl J Med, 2004, Bd. 351, Seite 159-169, Thadhani et al., N Engl J Med, 1996, Bd. 334, Seite 1448-1460). In all diesen Fällen kommt es zu einer Schädigung der proximalen Tubuluszellen in deren Verlauf Mukoproteinzylinder von den Zellen gebildet werden. Diese führen dann über eine Obstruktion zu einem Verlust der Nierenfunktion (Patel et al., Lancet, 1964, BD. 29, Seite 457-461).
In Alkhunaizi et al. (Am J Kidney Dis, 1996, Bd. 28, Seite 315-328) wurden Daten erhoben, die belegen, dass 30 % der Patienten einer Intensivstation von akutem Nierenversagen in direkter oder indirekter Folge betroffen sind. Auch wenn die Prognose für eine Wiederherstellung der Nierenfunktion bei Ansprechen auf eine kombinierte Volumensubstitutions- und Medikamententherapie gut ist, so führt das Akute Nierenversagen in 28 bis 90 % aller auf Intensivstationen auftretenden Fälle infolge eines Multiorganversagens oder dem Auftreten von schweren Infektionen oder Sepsis zum Tod (Metnitz et al., Crit Care Med, 2002, Bd. 30, Seite 2051-2058).
Das Akute Nierenversagen kann erst spät durch einen Anstieg des Serumkreatinins erfasst werden (Herget-Rosenthal, Lancet, 2005, Bd. 365, Seite 1205-1206, Mehta et al., Crit Care, 2007, Bd. 11, R31). Um die Vorteile einer präventiven Intervention nutzen zu können, wurden in den letzten Jahren Anstrengungen unternommen, diagnostische Marker zu identifizieren, welche eine verlässliche Diagnose des Akuten Nierenversagens noch vor der klinischen Manifestation erlauben (Vaidya et al., Clin Transl Sei, 2008, Bd. 1, Seite 200-208). Zu den vielversprechendsten Biomarkerkandidaten gehören : neutrophiles Gelatinase-assoziiertes Lipocalin, Kidney-Injury Molecule-1, N-Acetyl-Beta-D- Glukoaminidase, Interleukin-18 und Cystatin C (Nguyen, Pediatr Nephral, 2008, Bd. 23, Seite 2151-2157). Aufgrund der heterogenen Ausprägung eines Akuten Nierenversagens, bilden jedoch auch diese Marker die Krankheit nur unzureichend ab.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel für die frühzeitige Diagnose eines Akuten Nierenversagens bereit zu stellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnostik eines Akuten Nierenversagens umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.
Tabelle 1. Liste der Marker, welche in einem Multimarkermodell die frühe Diagnose eines Akuten Nierenversagens ermöglichen.
Masse in Da, CE-time in Minuten
Von den meisten dieser Peptide ist die Aminosäuresequenz bekannt. Diese ist zusammen mit dem zugehörigen Vorläuferprotein in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2. Aminosäuresequenz und zuordenbares Vorläuferprotein der für die Diagnose eines akuten Nierenversagens relevanten sequenzbekannten Marker.
Zur Auswertung der gemessenen An- oder Abwesenheiten oder Amplituden der Marker kann auf die in Tabelle 3 aufgeführten Referenzwerte zurückgegriffen werden.
Tabelle 3. Referenzwerte zur Auswertung der gemessenen An- oder Abwesenheiten oder Amplituden der Marker.
AKI = Acute Kidney Insufficiency (Akutes Nierenversagen)
Die Auswertung der gemessenen Polypeptide kann anhand der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker unter Berücksichtigung der folgenden Grenzwerte erfolgen :
Spezifität ist definiert als die Anzahl der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch-Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt.
Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch-Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für Akutes Nierenversagen eine Spezifität von mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, mehr bevorzugt 85%, zu erreichen.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für Akutes Nierenversagen eine Sensitivität von mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, mehr bevorzugt 85% zu erreichen.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3). Eine Variation in der CE-Zeit ist zwischen einzelnen Messungen relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 2 min, vorzugsweise im Bereich von ± 1 min, mehr bevorzugt ± 0,5 min, noch mehr bevorzugt ± 0,2 min oder 0,1 min.
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen 1 bis 4 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid communicati- ons in mass spectrometry, 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,1%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,05%, mehr bevorzugt ± 0,03%, noch mehr bevorzugt ± 0,01% oder 0,005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein.
Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um ein Akutes Nierenversagen zu diagnostizieren.
Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird die An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auch zur Differentialdiagnostik genutzt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für die frühzeitige Diagnose eines Akuten Nierenversagens ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit chronischen Nierenerkrankung vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne Vorliegen eines Akuten Nierenversagens seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit Akutem Nierenversagen vorhanden sind, jedoch bei Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen nicht oder nur seltener vorhanden sind.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An- oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In den Tabellen sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse und Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsverfahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben. Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert. Dazu wird eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Referenzwerten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt.
Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen eines Akuten Nierenversagens auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einem Akuten Nierenversagen auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Amplitudenmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, bei dem ein Akutes Nierenversagen auftreten kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pank- reassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der PoIy- peptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatogra-phie (HPLC), Normal- und Um- kehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchroma-tographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
Eine Teilprobe bedeutet, dass die Probe in mehrere Teile unterteilt wurde, die sich unterscheiden. In einer einfachen Form kann es sich dabei z.B. um eine Membranfiltration handeln, die größere und kleinere Inhaltsstoffe der Probe in zwei Teilproben trennt.
In einer anderen Ausführungsform kann es sich um eine chromatographische Trennung handeln, die die Probe in einer Vielzahl von Teilproben ("Fraktionen") trennt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (>100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massens- pektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix- assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus einer mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time- of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypep- tid-markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography-mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik des Akuten Nierenversagens zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF- MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sein, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere Polypeptidmarker zur Diagnostik verwendet werden.
Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet. Bevorzugt sind die Marker ausgewählt aus den Markern mit der Protein-ID:
5913, 7406, 16832, 17792, 18168, 20749, 21203, 22282, 26042, 26891, 27517, 27796, 28702, 30733, 38879, 41833, 43686, 53216, 56884, 57531, 61573, 64256, 70413, 74187, 89325, 92698, 97301, 98089, 100537, 102392, 106195, 115491, 130747, 159954, 160628 gemäß Tabelle 1. Noch mehr bevorzugt sind die Marker ausgewählt aus den Markern mit der Protein-ID:
5913, 7406, 16832, 17792, 18168, 20749, 21203, 22282, 26042, 26891, 27796, 28702, 41833, 43686, 56884, 61573, 82094, 89325, 130747, 159954, 160628, gemäß Tabelle 1.
In einer Ausführungsform werden die Marker oder eine Untergruppe der Marker ausgewählt, die durch folgende Nummern charakterisiert sind :
2505, 5913, 14906, 16832, 20749, 27517, 28561, 30174, 30733, 38879, 40864, 41833, 42594, 46880, 50008, 51120, 52100, 53216, 53957, 55143, 56884, 57531, 58954, 61573, 63877, 64087, 64256, 67632, 70413, 74187, 82094, 84192, 87724, 89325, 90840, 92698, 96370, 97301, 98089, 100537, 101888, 102392, 103493, 106195, 115491, 121775, 122400, 123671, 124886, 130747, 159954, 160628.
In einer anderen Ausführungsform werden die Marker verwendet, die folgende Protein-ID aufweisen :
5913, 16832, 20749, 27517, 30733, 38879, 41833, 53216, 56884, 57531, 61573, 64256, 70413, 74187, 89325, 92698, 97301, 98089, 100537, 102392, 106195, 115491, 130747, 159954, 160628.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Marker ausgewählt aus den Markern mit der Protein-ID:
5913, 16832, 20749, 41833, 56884, 61573, 82094, 89325, 130747, 159954, 160628.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können die dem Fachmann bekannten statistischen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) beschriebene Random-Forests- Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in derselben Veröffentlichung beschriebenen Support-Vector-Machine verwendet werden.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an Nierenerkrankungen leiden, abgenommen.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μm Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultrafiltrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (GE Healthcare, München, D) und mit 2,5 ml 0,01% NH4OH eluiert und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den„Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäu- re verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.
3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind :
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertig gestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im Wesentlichen linearer Zusammenhang besteht.
In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Co-migrierende Peptide co-migrieren aber auch unter solchen Bedingungen.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich.
Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik eines Akuten Nierenversagens umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Probe, wobei die Polypeptid- marker aus den Polypeptidmarkern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmasse und die Migrationszeit charakterisiert sind, ausgewählt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker anhand der in Tabelle 3 aufgeführten Referenzwerte erfolgt.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als Probe eines Individuums eine Mittelstrahlurinprobe verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
8. Verwendung von mindestens drei Polypeptidmarkern ausgewählt aus den Polypeptidmarkern, die in Tabelle 1 durch die Werte für die Molekular- masse und die Migrationszeit charakterisiert sind, zur Diagnostik von Akutem Nierenversagen.
9. Verfahren zur Diagnose eines Akuten Nierenversagens umfassend die Schritte
a) der Auftrennung einer Probe in mindestens 5, bevorzugt 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens fünf Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern, die in Tabelle 1, durch die Molekularmasse und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei mindestens 10 Teilproben gemessen werden.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9 bis 11, wobei die Sensitivität mindestens 60% und der Spezifität mindestens 40% beträgt.
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