EP1955075A2 - Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung vaskulären erkrankungen - Google Patents

Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung vaskulären erkrankungen

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EP1955075A2
EP1955075A2 EP06819861A EP06819861A EP1955075A2 EP 1955075 A2 EP1955075 A2 EP 1955075A2 EP 06819861 A EP06819861 A EP 06819861A EP 06819861 A EP06819861 A EP 06819861A EP 1955075 A2 EP1955075 A2 EP 1955075A2
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EP
European Patent Office
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markers
sample
polypeptide
marker
absence
Prior art date
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EP06819861A
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Harald Mischak
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Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
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Publication date
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • Polvpeptide marker for diagnosis and evaluation of vascular diseases
  • the present invention relates to the use of the presence or absence of one or more peptide markers in a sample of an individual for the diagnosis and evaluation of the severity of vascular diseases (VE) and a method for the diagnosis and evaluation of the vascular disease, wherein the presence or absence of the or the peptide marker (s) is indicative of the severity of a VE.
  • VE vascular diseases
  • Vascular disorders are diseases that affect the vessels of an organism and, subsequently, organs such as the heart, brain, kidney, etc. These are e.g. Atherosclerosis, circulatory disorders, hypertension, and arrhythmia.
  • Atherosclerosis refers to the hardening of arteries due to vascular deposits. Cholesterol crystal deposits lead to the formation of inflammatory foci (atheromas), in which blood constituents, fatty substances, metabolic waste products and calcium salts readily accumulate. It forms so-called plaques, area calcifications; which makes the vessel wall harder and tighter.
  • the artery loses its elasticity and is difficult to fulfill its task of transporting blood from the heart to the individual parts of the body. Consequences are, for example, angina pectoris, myocardial infarction, circulatory collapse, stroke.
  • Circulatory disorders usually affect the lower body area, from the abdominal aorta to the foot arteries, and lead to a reduction in blood flow and oxygenation in the muscle tissue, which gradually dies. In the last stage, ulcers form and close the vessels so that an amputation becomes inevitable. High blood pressure has no clear cause, so taking medication or excessive secretion of kidney hormones can make the blood pressure rocketing. High blood pressure levels are also associated with long-term stress, which leads to vascular spasms. Hypertension damages the vessel walls, causing there is a risk of tearing or locking. If the regularity of the heartbeat is disturbed, it is called cardiac arrhythmia. The heartbeat may be either too fast (tachycardia), too slow (bradycardia) or irregular (arrhythmia).
  • Vascular diseases can be prevented by prevention because they are also due to an unhealthy and unnatural lifestyle. By radically reversing the lifestyle, arteriosclerosis should be halted in the early stages, for example by lowering blood pressure and blood lipid levels. The progression of vascular diseases can also be slowed down by drug therapies (eg, acetylsalicylic acid, beta-adrenergic blockers, ACE inhibitors, etc.). However, it should be noted that damaged vessels are irreparable, the process at an advanced stage is irreversible. This makes early detection of vascular diseases particularly important.
  • drug therapies eg, acetylsalicylic acid, beta-adrenergic blockers, ACE inhibitors, etc.
  • VE in coronary heart disease is initially carried out indirectly via evaluation of risk factors and non-invasive examinations such as blood pressure, resting and exercise ECG, as well as blood tests to determine the lipid status (LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglycerides), fasting blood sugar and if necessary HbAIc. If these examinations indicate the presence of high-risk features, ie serious vascular events (death, myocardial infarction) are expected within the next period, a more detailed diagnosis will be made using invasive diagnostics, eg catheterization or coronary angiography. For this, the heart and coronary vessels as well as other vessels are examined with the help of a catheter or X-ray procedure.
  • invasive diagnostics eg catheterization or coronary angiography
  • X-ray contrast agents are used. Indications for coronary angiography include a low or moderate pretest probability, with non-invasive diagnostics not providing reliable results, and patients undergoing noninvasive testing for disability or illness it is not possible and patients for whom a professional exclusion of coronary heart disease is indispensable if suspected (eg pilots, fire brigade).
  • coronary angiography can only be performed if, in addition to the previously mentioned preliminary examinations, various complications such as hyperthyroidism or a contrast agent allergy are excluded. Because the contrast agent is excreted via the kidney, there must also be adequate kidney function, or dialysis-dependent people must always undergo dialysis after the examination. This shows that there is a need for a non-invasive option for the early and reliable diagnosis of vascular disease.
  • Vascular diseases of the kidney are:
  • Renal artery stenosis is a one- or double-sided constriction of the renal artery or its major branches. It may be the cause of arterial hypertension, which is called renovascular hypertension.
  • the narrowing of the renal artery leads to a reduced perfusion of the affected kidney.
  • Blood pressure reduction increases the kidney produces renin, which via the angiotensin-aldosterone mechanism leads to an increase in blood volume and a blood pressure increase of the entire organism and thus to arterial hypertension.
  • the renal artery stenosis is therefore usually discovered in the diagnosis of hypertension, but it is only in about 1-2% of all hypertension the cause.
  • PTA percutaneous transluminal catheter angioplasty
  • Stent Insertion of a wire mesh (stent), which should hold the vessel open.
  • renal arterial thrombosis Common causes of renal arterial thrombosis are heart embolisms, e.g. in atrial fibrillation associated with symptoms such as flank pain, proteinuria, very high LDH. In renal vein thrombosis flank pain is also observed, but in addition a proteinuria and possibly a hematuria or a nephrotic syndrome.
  • Narrowed vessels in the brain area lead to a reduced oxygen supply, in occlusion of an artery (eg by an acute clot as a result of changes due to arteriosclerosis) it comes to stroke with loss of sensibility, paralysis, speech disorders, etc.
  • cerebral arteries as in the large arteries arise in the course arterial calcification in rare cases draining the vessel walls, in conjunction with risk factors such as high blood pressure threatens a rupture of the vessel wall and a life-threatening internal bleeding.
  • an object of the present invention is the use of the presence or absence of at least one, ideally more polypeptide marker (s) in a urine sample of an individual for the diagnosis of vascular diseases, said polypeptide marker (s) being selected from polypeptide labels Nos. 1 to No. 526, which are characterized by the molecular masses given in Table 1 and their migration times.
  • the markers 1-104 and / or 107-413 are preferably used.
  • the migration time is determined by means of capillary electrophoresis (CE), as described in Example 2, for example.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is, for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. be the polypeptides given in the examples (see example point 3).
  • the characterization of the polypeptides shown in Tables 1 to 4 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a method which is described e.g. in detail by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the variation of molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ⁇ 0.1%, preferably in the range of ⁇ 0.05%, more preferably ⁇ 0.03%, even more preferably ⁇ 0.01%.
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, for example by post-translational modifications such as glycolization, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or altered by other reactions, eg in the context of degradation. In addition, the polypeptide markers can also be chemically modified, eg oxidized, during the purification of the samples. Based on the parameters that determine the polypeptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
  • polypeptides of the invention are used to diagnose the severity of VE. Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury. In the present case, the presence or absence of certain polypeptide markers is indicative of the severity of the VE. For this purpose, the polypeptide markers of the invention are determined in a sample of an individual, their presence or absence suggesting the degree of VE. The presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of the degree of VE (frequency marker).
  • VE degree of VE
  • polypeptide markers which are typically present in individuals with VE, but are more rare or non-existent in individuals without VE, eg, 1-24 (Table 2).
  • polypeptide markers present in patients with VE such as polypeptide markers Nos. 25 to 106, but are not or only rarely present in patients without VE.
  • the amplitude markers indicated in Table 3 can also be used for the diagnosis of CE (number 107-526). Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • Tables 3 and 4 the mean amplitudes of the respective signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples are given. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm). The amplitude markers resulting from this procedure are shown in Table 3 (number 107-413).
  • All groups used consist of at least 20 individual patient or control samples to obtain a reliable mean amplitude.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the VE group. If the value is close to the mean amplitude of the VE group, it can be assumed that the presence of a vascular disease is more likely to correspond to the mean amplitudes of the VE group Control group, does not assume a VE.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group. An exemplary explanation shall be given by means of marker No. 137 (Table 3).
  • the mean amplitude of the marker is markedly increased at one VE (12044 ppm vs 5726 ppm in the control group). If, in a patient sample, the value for this marker is 0 to 5726 ppm, or a maximum of 20% above this, ie 0 to 6871 ppm, this sample belongs to the control group. If the value is 12044 ppm, or 20% lower, or higher, ie between 9635 ppm and very high values, this is to be regarded as an indication of a vascular disease.
  • the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - are included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined can be any individual who may be suffering from PE.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • a polypeptide marker not only a polypeptide marker, but a combination of markers is used to determine the degree of VE. It is concluded by their presence or absence on the degree of VE. By comparing a plurality of polypeptide markers, the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the individual.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual (VE or not).
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tears, tissue, sperm, vaginal fluid, or a stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample or a blood sample, where a blood sample may be a serum (blood) or (blood) plasma sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample can be removed, for example, by means of a catheter or else by means of a urination apparatus as described in WO 01/74275.
  • Blood samples may be taken by methods known in the art, for example from a vein, artery or capillary.
  • a blood sample is obtained by removing venous blood from an individual, for example, from the arm by means of a syringe.
  • the term blood sample also includes samples obtained from blood by further purification and separation techniques known in the art, such as blood plasma or blood serum.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the subject eg, the urine or blood sample
  • the treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by ion exchange chromatography, or electrophoretic separation.
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by means of a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are mostly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • For analysis of the resulting ions e.g. Quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers are used.
  • electrospray ionization the molecules present in solution i.a. under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets which become smaller by evaporation of the solvent.
  • high voltage e.g. 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), LC-MS (Liquid Chromatography - mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of UAS. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • the use of volatile solvents is preferred, and it is best to work under essentially salt-free conditions.
  • suitable solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and treated with a weak acid (eg 0.1% to 1% formic acid) to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can advantageously be used for the diagnosis of VE.
  • at least three polypeptide markers may be used, for example, markers 1, 2 and 3; 1, 2 and 4; etc.
  • markers 1 to 11 are preferred. Most preferred is the use of all 526 markers listed in Tables 1-4.
  • Urine was used to detect the polypeptide markers for the diagnosis of VE. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) and from patients with severe PU.
  • proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • 700 .mu.m filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE).
  • the UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml of ultrafiltrate were obtained.
  • CE-MS measurements were performed with a capillary electrophoresis system from Beckman Coulter (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and a Bruker's ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, Germany).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the sheath flow at the MS, here with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was performed by a CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies , Waldbronn, DE).
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "stacking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) before injecting the sample, and then injecting a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 32 min at 0.5 psi.
  • the total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas" was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection.
  • the spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds. 3.
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.4 min
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV "REV”, "ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.

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Abstract

Verfahren zur Diagnose von vaskulären Erkrankungen (VE) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit mindestens eines Polypeptidmarkers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1 bis 526, die durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.

Description

Polvpeptidmarker zur Diagnostik und Beurteilung vaskulären Erkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnostik und Beurteilung des Schweregrades von vaskulären Erkrankungen (VE) sowie ein Verfahren zur Diagnostik und Beurteilung der vaskulären Erkrankung, wobei die An- oder Abwesenheit des oder der Peptidmarker(s) indikativ für den Schweregrad einer VE ist.
Vaskuläre Erkrankungen sind Erkrankungen, die die Gefäße eines Organismus und in weiterer Folge Organe wie zum Beispiel das Herz, das Gehirn, die Niere, etc., betreffen. Dies sind z.B. Arteriosklerose, Durchblutungsstörungen, Bluthochdruck, sowie Herzrhythmusstörungen.
Blutgefäße:
Arteriosklerose bezeichnet die Verhärtung von Arterien durch Gefäßeinlagerungen. Cholesterinkristallablagerungen führen zur Bildung von entzündlichen Herden (Atheromen), in denen sich Blutbestandteile, Fettstoffe, Stoffwechselschlacken und Kalksalze gern festsetzen. Es bilden sich sogenannte Plaques, flächige Verkalkungen; wodurch die Gefäßwand härter und enger wird. Die Arterie verliert ihre Elastizität und kommt ihrer Aufgabe, dem Bluttransport vom Herzen in die einzelnen Körperbereiche, nur noch schwer nach. Folgeerkrankungen sind beispielsweise Angina pectoris, Herzinfarkt, Kreislaufkollaps, Schlaganfall. Durchblutungsstörungen betreffen meistens den unteren Körperbereich, von der Bauchaorta bis zu den Fußarterien, und führen zu einer Verringerung des Blutflusses und der Sauerstoffzufuhr in das Muskelgewebe, das allmählich abstirbt. Im letzten Stadium bilden sich Geschwüre und verschließen sich die Gefäße derart, dass eine Amputation unumgänglich wird. Bluthochdruck hat keine eindeutige Ursache, so kann die Einnahme von Medikamenten oder eine übermäßige Sekretion von Nierenhormonen den Blutdruck hochschnellen lassen. Hohe Blutdruckwerte liegen ebenfalls bei Dauerstress vor, bei dem es zu Gefäßkrämpfen kommt. Bluthochdruck schädigt die Gefäßwände, so dass die Gefahr eines Zerreißens oder eines Verschlusses besteht. Ist die Regelmäßigkeit des Herzschlages gestört, spricht man von Herzrhythmus-Störungen. Dabei kann der Herzschlag entweder zu schnell (Tachykardie), zu langsam (Bradykardie) oder unregelmäßig (Arrhythmie) sein. Vaskuläre Erkrankungen können durch Vorbeugung vermieden werden, weil sie auch durch eine ungesunde und unnatürliche Lebensführung bedingt sind. Durch eine radikale Umkehr in der Lebensweise ist Arterienverkalkung im Frühstadium aufzuhalten, z.B. durch senken von Blutdruck- und Blutfettwerten. Das Fortschreiten vaskulärer Erkrankungen kann zudem durch medikamentöse Therapien (z.B. Acetylsalicylsäure, Betarezeptorenblocker, ACE- Hemmer, etc.) verlangsamt werden. Allerdings ist festzuhalten, dass geschädigte Gefäße irreparabel sind, der Prozess im fortgeschrittenen Stadium nicht rückgängig zu machen ist. Dieses macht eine frühzeitige Erkennung der vaskulären Erkrankungen besonders wichtig.
Herz:
Die Diagnostik von VE erfolgt bei koronaren Herzerkrankung zunächst indirekt über Evaluierung von Risikofaktoren und durch nicht-invasive Untersuchungen wie Blutdruckmessung, Ruhe und Belastungs-EKG, sowie durch Blutbilder zur Bestimmung des Lipidstatus (LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyzeride), Nüchternblutzucker und ggf. HbAIc. Ergeben diese Untersuchungen das Vorliegen von Hochrisikomerkmalen, d.h. es ist mit schwerwiegenden vaskulären Ereignissen (Tod, Myokardinfarkt) innerhalb der nächsten Zeit zu rechnen, wird mit Hilfe von invasiver Diagnostik z.B. in Form einer Katheteruntersuchung oder einer Koronarangiographie eine genauere Diagnose erstellt. Dazu werden Herz und Herzkranzgefäße sowie andere Gefäße mit Hilfe eines Katheters oder des Röntgenverfahrens untersucht. Um das Herz und die Gefäße auf dem Röntgenbild besser sichtbar machen zu können, werden Röntgen-Kontrastmittel verwendet. Als Indikationen zur Koronarangiographie gelten eine niedrige oder mittlere Vortest-Wahrscheinlichkeit, wobei die nichtinvasive Diagnostik keine zuverlässigen Ergebnisse ergeben hat, Patienten bei denen eine nicht-invasive Testung auf Grund von Behinderung oder Erkrankungen nicht möglich ist und Patienten, bei denen berufsbedingt ein sicherer Ausschluss einer koronaren Herzkrankheit bei entsprechendem Verdacht unabdingbar ist (z.B. Piloten, Feuerwehr). Die Koronarangiographie kann allerdings nur durchgeführt werden, wenn neben den zuvor genannten Voruntersuchungen, verschiedene Komplikationen wie z.B. eine Schilddrüsenüberfunktion oder eine Kontrastmittelallergie ausgeschlossen sind. Weil das Kontrastmittel über die Niere ausgeschieden wird, muss zudem eine ausreichende Nierenfunktion vorliegen, bzw. bei dialysepflichtigen Menschen muss im Anschluss an die Untersuchung immer eine Dialyse durchgeführt werden. Damit wird deutlich, dass der Bedarf hinsichtlich einer nicht-invasiven Möglichkeit zur frühzeitigen und zuverlässigen Diagnose von vaskulären Erkrankungen besteht.
Niere:
Vaskuläre Erkrankungen der Niere sind :
• Nierenarterienstenose
• Nierenarterienthrombose
• Nierenarterienembolie
• Nierenvenenthrombose.
Eine Nierenarterienstenose ist eine ein- oder doppelseitige Einengung der A. renalis oder ihrer Hauptäste. Sie kann die Ursache einer arteriellen Hypertonie sein, die dann als renovaskuläre Hypertonie bezeichnet wird.
Ursache ist in etwa 70% der Fälle eine Arteriosklerose (überwiegend im höheren Lebensalter) und in etwa 20% eine fibromuskuläre Dysplasie (eine bindegewebige Fehlbildung). Selten sind Aneurysmen der Aorta oder Nierenarterie, Vaskulitiden, mechanische Kompression durch Tumoren oder Zysten, Embolien oder Thrombosen ursächlich beteiligt.
Die Verengung der Nierenarterie führt zu einer Minderdurchblutung der betroffenen Niere. Um die vermeintliche (lokale!) Blutdruckerniedrigung auszugleichen, steigert die Niere die Produktion von Renin, welches über den Angiotensin-Aldosteron- Mechanismus zu einem Anstieg des Blutvolumens und einer Blutdrucksteigerung des gesamten Organismus und damit zur arteriellen Hypertonie führt. Die Nierenarterienstenose wird daher auch meistens bei der Abklärung einer Hypertonie entdeckt, sie ist allerdings nur in etwa 1-2% aller Hypertonien die Ursache.
Therapeutisch bestehen verschiedene Möglichkeiten :
• PTA (perkutane transluminale Katheterangioplastie) : Die Aufdehnung der Verengung mittels eines eingeführten Ballonkatheters (Ballondilatation).
• Stent: Einlage eines Drahtgeflechts (Stent), welches das Gefäß offen halten soll.
• Operative Beseitigung der Stenose
Häufige Ursache für eine Nierenarterienthrombose sind Embolien aus dem Herzen, z.B. bei Vorhofflimmern welche einhergehen mit Symptomen wie Flankenschmerz, Proteinurie, sehr hohem LDH. Bei der Nierenvenenthrombose werden ebenfalls Flankenschmerzen beobachtet, allerdings zusätzlich eine Proteinurie sowie evtl eine Hämaturie oder ein nephrotisches Syndrom.
Gehirn :
Verengte Gefäße im Hirnbereich führen zu einer verminderten Sauerstoffversorgung, bei Verschluss einer Arterie (z.B. durch ein akutes Gerinnsel als Folge der Veränderungen durch die Arterienverkalkung) kommt es zum Schlaganfall mit Sensibilitätsausfällen, Lähmungen, Sprachstörungen etc. Bei Hirnarterien wie bei den großen Schlagadern entstehen im Zuge der Arterienverkalkung in seltenen Fällen Aussackungen der Gefäßwände, im Zusammenspiel mit Risikofaktoren wie Bluthochdruck droht ein Reißen der Gefäßwand und eine lebensbedrohliche innere Blutung.
Überraschender Weise wurde nun gefunden, das bestimmte Peptidmarker in einer Urinprobe eines Individuums zur Diagnostik der VE und damit zur Entscheidung, ob eine medikamentöse Therapie notwendig ist oder nicht, verwendet werden können. Folglich ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der An- oder Abwesenheit mindestens eines, im Idealfall mehrerer Polypeptidmarker(s) in einer Urinprobe eines Individuums zur Diagnostik vaskulärer Erkrankungen, wobei der/die Polypeptidmarker ausgewählt ist/sind aus den Polypeptidmarkern Nr. 1 bis Nr. 526, die durch die die in Tabelle 1 angegebenen Molekularmassen und ihre Migrationszeiten charakterisiert sind.
Tabelle 1 : Polypeptidmarker zur Diagnostik vaskulärer Erkrankungen sowie ihre Molekularmassen und Migrationszeiten (CE-Zeit in Minuten) :
Bevorzugt werden die Marker 1-104 und/oder 107-413 eingesetzt.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, den Schweregrad der VE zu bestimmen. Diese Information hilft bei der Entscheidung, welche therapeutischen Maßnahmen gesetzt werden. Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird zum Beispiel 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen 1 bis 4 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometπe (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,1%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,05%, mehr bevorzugt ± 0,03%, noch mehr bevorzugt ± 0,01%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alky- lierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein. Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide (siehe Tabelle 1 bis 4) werden verwendet, um den Schweregrad der VE zu diagnostizieren. Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird von der An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auf den Schweregrad der VE geschlossen. Hierzu werden die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker in einer Probe eines Individuums bestimmt, wobei ihre An- oder Abwesenheit auf den Grad der VE schließen lässt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für den Grad der VE ist (Frequenzmarker). So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit VE vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne VE seltener oder gar nicht auftreten, z.B. 1-24 (Tabelle 2). Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit VE vorhanden sind, wie z.B. Polypeptidmarker Nr. 25 bis 106, jedoch bei Patienten ohne VE nicht oder nur seltener vorhanden sind. Tabelle 2: Polypeptidmarker (Frequenzmarker) zur Diagnostik von vaskulären Erkrankungen, ihre Molekularmassen und Migrationszeiten sowie ihre An- und Abwesenheit bei an VE erkrankten Patientengruppen (VE) sowie Kontrollgruppen (Kontrolle) als Faktor (1 = 100%, 0=0%; Probenaufarbeitung und Messung wie im Beispiel beschrieben).
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch die in Tabelle 3 angegebenen Amplitudenmarker zur Diagnose von VE verwendet werden (Nummer 107-526). Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In Tabelle 3 und 4 sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsverfahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben. Die sich nach diesem Verfahren ergebenden Amplitudenmarker sind in Tabelle 3 gezeigt (Nummer 107-413).
Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Referenzwerten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt. Die sich nach diesem Normierungsverfahren ergebenden Biomarker sind in Tabelle 4 gezeigt (Nummer 414-526).
Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patienten- oder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose (VE oder nicht) fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der VE-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der VE-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer vaskulären Erkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer VE auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden. Eine beispielhafte Erläuterung soll anhand von Marker Nr. 137 (Tabelle 3) gegeben werden. Die mittlere Amplitude des Markers ist bei einer VE deutlich erhöht (12044 ppm gegen 5726 ppm in der Kontrollgruppe). Liegt nun in einer Patientenprobe der Wert für diesen Marker bei 0 bis 5726 ppm, bzw. maximal 20% darüber, also 0 bis 6871 ppm, gehört diese Probe zur Kontrollgruppe. Liegt der Wert bei 12044 ppm, bzw. 20% darunter, oder höher, also zwischen 9635 ppm und sehr hohen Werten, ist dies als Hinweis auf eine vaskuläre Erkrankung zu werten.
Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Amplitu- denmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.
Tabelle 3 : Amplitudenmarker mit Normierung nach Ansatz 1
Tabelle 4: Amplitudenmarker mit Normierung nach Ansatz 2
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an VE leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nicht nur ein Polypeptidmarker, sondern eine Kombination von Markern verwendet, um den Grad der VE zu bestimmen. Dabei wird durch ihre An- oder Abwesenheit auf den Grad der VE geschlossen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums (VE oder nicht) zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pankreassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine U- rinprobe oder eine Blutprobe, wobei es sich bei einer Blutprobe um eine (Blut)serum- oder (Blut)plasmaprobe handeln kann.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden. Blutproben können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beispielsweise aus einer Vene, Arterie oder Kapillare entnommen werden. Für gewöhnlich wird eine Blutprobe erhalten, indem einem Individuum venöses Blut mittels einer Spritze z.B. aus dem Arm entnommen wird. Der Begriff Blutprobe bezieht auch Proben ein, die aus Blut durch weitere, aus dem Stand der Technik bekannte Aufreinigungs- und Trennverfahren gewonnen wurden, wie z.B. Blutplasma oder Blutserum.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urin- oder Blutprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der PoIy- peptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der PoIy- peptidmarker auswählen können. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die mas- senspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (>100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen-bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser-desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan-Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhan- ced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectro- metry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometπe (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25:2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von UAS zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI- TOF-MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer schwachen Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren. Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafter Weise mehrere Polypep- tidmarker zur Diagnostik der VE verwendet werden. Insbesondere können mindestens drei Polypeptidmarker verwendet werden, beispielsweise die Marker 1, 2 und 3; 1, 2 und 4; usw.
Mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 4, 5, oder 6 Markern.
Noch mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 11 Markern, beispielsweise die Marker 1 bis 11. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung aller 526 in den Tabellen 1 bis 4 aufgeführten Marker.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer schweren VE bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65 :2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik der VE wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an schwerer VE leiden, abgenommen.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μm Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultra- filtrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (A- mersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und mit 2,5 ml 0,01% NH4OH eluiert und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beck- man Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath- Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI- MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert. 3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind:
Protein/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 9,2 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 10,9 min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 8,9 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQIIS 15,6 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,4 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 20,0 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 36,8 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. „REV", „ELM", „KINCON" und „GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Die Molekularmassen der Peptide sowie die in der MS sichtbaren m/z Verhältnisse der einzelnen Ladungszustände sind in der folgenden Tabelle angegeben :
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE-Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE-Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertiggestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im wesentlichen linearer Zusammenhang besteht.
In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Comigrierende Peptide comigrieren aber auch unter solchen Bedingungen.
Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich.
Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik vaskulärer Erkrankungen (VE) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit mindestens eines Polypeptidmar- kers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1-526, die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind :
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit der Marker 1-106 anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der Amplitude der Marker 107-413 anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
und der Marker 414-526 anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens zwei oder mindestens drei oder mindestens fünf oder sechs oder mindestens zehn oder alle Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Probe eines Individuums eine Urinprobe oder eine Blutprobe (Serum- oder Plasmaprobe) ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei vor der Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
9. Verwendung mindestens eines Polypeptidmarkers ausgewählt aus den Markern Nr. 1-526, der durch die Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit gemäß Anspruch 1 charakterisiert ist, zur Diagnostik vaskulärer Erkrankungen.
10. Verfahren zur Diagnose vaskulärer Erkrankungen (VE) umfassend die Schritte a) der Auftrennung einer Probe in mindestens drei, bevorzugt 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens zwei Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1 bis 526, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) gemäß Anspruch 1 charakterisiert sind.
11. Verfahren nach Ansprüche 10, wobei mindestens 10 Teilproben gemessen werden.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25 M Ameisensäure in Wasser verwendet wird.
13. Markerkombination, umfassend mindestens 10 Marker ausgewählt aus den Markern 1 bis 526, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) gemäß Anspruch 1 charakterisiert sind.
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