EA014529B1 - Полипептидные маркеры для диагностики и оценки сосудистых заболеваний - Google Patents

Abstract

Способ диагностики сосудистых заболеваний (СЗ), включающий стадию определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного полипептидного маркера в образце, где указанный полипептидный маркер выбирают из маркеров 1-526, которые характеризуются определенными значениями молекулярной массы и времени миграции (времени СЕ).

Description

И изобретение относится к использованию данных о наличии или отсутствии одного или более пептидных маркеров в образце, взятом от субъекта, для целей диагностики и оценки тяжести сосудистых заболевания (СЗ) и к способу диагностики и оценки таких сосудистых заболеваний, где наличие или отсутствие одного или более пептидных маркеров является показателем тяжести СЗ.

Сосудистые заболевания представляют собой заболевания, поражающие сосуды организма и, следовательно, такие органы, как сердце, головной мозг, почка и т.п. Они включают, например, артериосклероз, нарушение кровообращения, гипертензию и сердечную аритмию.

Кровеносные сосуды

Артериосклероз относится к процессу затвердевания артерий за счет образования отложений на стенках сосудов. Отложение кристаллов холестерина ведет к созданию воспалительных очагов (атером), в которых могут оседать компоненты крови, липиды, метаболические шлаки и известковые соли. Образуются так называемые бляшки, представляющие собой двумерные уплотнения, в результате чего сосудистая стенка становится более ригидной и сужается. Артерия теряет присущую ей эластичность и с трудом выполняет свою функцию, т.е. транспортировку крови от сердца в отдельные участки организма. Вторичные заболевания включают, например, стенокардию, инфаркт миокарда, сердечную недостаточность, инсульт. Нарушение кровообращения чаще всего поражает нижнюю часть тела на участке от брюшной аорты до артерий ног и ведет к снижению кровотока и доставки кислорода к мышечной ткани, которая постепенно некротизируется. На конечной стадии образуются язвы и закупоривают сосуды до такой степени, что становится неизбежной ампутация. Гипертензия не имеет определенной причины, так что прием лекарственных средств или избыточная секреция гормонов надпочечников может вызвать повышение давления крови. Высокое давление крови также имеет место при постоянном стрессе, что приводит к ангиоспазму. Гипертензия приводит к повреждению сосудистых стенок, так что возникает риск их разрыва или обструкции. Если нарушается регулярность сердцебиения, то такое состояние называется сердечной аритмией. Частота сердечных сокращений может быть либо слишком быстрой (тахикардия), либо слишком медленной (брадикардия), либо нерегулярной (аритмия). Сосудистых заболеваний можно избежать с помощью профилактики, поскольку они также вызываются нездоровым и неестественным образом жизни. Путем радикального изменения образа жизни артериосклероз на ранней стадии его развития может быть остановлен, например, за счет снижения давления крови и уровня липидов в крови. Прогрессирование сосудистых заболеваний может быть дополнительно замедлено с помощью медикаментозной терапии (например, при использовании ацетилсалициловой кислоты, блокаторов бетарецептора, ингибиторов АХЭ и т.п.). Однако следует отметить, что поврежденные сосуды не подвергаются репарации и патологический процесс на развитой стадии является необратимым. Таким образом, раннее выявление сосудистых заболеваний чрезвычайно важно.

Сердце

При ишемической болезни сердца диагностика СЗ осуществляется в первую очередь косвенно, путем оценки факторов риска и неинвазивных исследований, таких как измерение давления крови, регистрация электрокардиограмм в покое и с нагрузкой, а также определение картины крови для выявления липидного статуса (уровень ЛНП-холестерина, уровень ЛВП-холестерина, уровень триглицеридов), измерение уровня глюкозы натощак и, при необходимости, НЬА1с. Если в ходе таких исследований выявляется наличие показателей, сопряженных с высоким риском, то есть в близком будущем могут ожидаться серьезные сосудистые явления (смертельный исход, инфаркт миокарда), то делается более точный диагноз с помощью инвазивных методов диагностики, например с использованием катетерного исследования или коронарной ангиографии. Таким образом, сосуды сердца, коронарные сосуды и другие сосуды могут быть исследованы с помощью катетерных или рентгеновских методов. Методы рентгеновского контрастного исследования используются для лучшей визуализации сердца и сосудов на рентгеновском снимке. Показания для проведения коронарной ангиографии включают предварительные тесты с результатом низкой или средней вероятности развития серьезных сосудистых явлений, когда неинвазивная диагностики не может дать надежных результатов в случае пациентов, для которых неинвазивное тестирование невозможно из-за инвалидности или имеющихся заболеваний, а также в случае пациентов, для которых необходимо однозначно исключить возможность ишемической болезни сердца по причинам, связанным с родом их профессиональной деятельности (например, в случае пилотов, пожарных). Однако коронарная ангиография может быть проведена только в том случае, если исключены различные осложнения, такие как гипертиреоз или аллергия на контрастные среды, в дополнение к указанным выше предварительным обследованиям. Кроме того, поскольку контрастная среда выделяется через почки, должна быть гарантирована в достаточной мере почечная функция или, в случае пациентов, зависимых от диализа, после обследования всегда должен проводиться диализ. Таким образом, становится ясно, что имеется выраженная потребность в неинвазивных способах ранней и надежной диагностики сосудистых заболеваний.

Почка

Сосудистые заболевания почки включают стеноз почечной артерии; тромбоз почечной артерии;

- 1 014529 эмболию почечной артерии;

тромбоз почечной вены.

Стеноз почечной артерии представляет собой одностороннее или двустороннее сужение почечной артерии или ее основных ветвей. Она может вызвать артериальную гипертензию, которая тогда называется реноваксулярной гипертензией.

Причиной указанной гипертензии является артериосклероз (в основном в пожилом возрасте), который имеет место примерно в 70% всех случаев, а также фиброзно-мышечная дисплазия (аномалия соединительной ткани), которая имеет место примерно в 20% случаев. Изредка имеют место аневризмы аорты или почечной артерии, васкулиты, механическое сжатие из-за опухоли или кист, эмболии или тромбозы.

Сужение почечной артерии ведет к сниженному току крови через пораженную почку. Для компенсации возможного (локального!) снижения давления крови почка усиливает продукцию ренина, что ведет к увеличению объема крови и к повышению давления крови во всем организме через механизм, опосредованный ангиотензином-альдостероном, и, в итоге, к артериальной гипертензии. В этой связи, стеноз почечной артерии чаще всего выявляется в том случае, когда гипертензия уже развилась, но лишь примерно в 1-2% всех случаев гипертензии рассматривается как причинный фактор.

С точки зрения терапии имеются различные возможности:

РТА (чрескожная катетерная транслюминальная ангиопластика): расширение имеющегося сужения с помощью вставляемого баллонного катетера (баллонная дилатация);

стент: вставка проволочной сетки (стента), которая позволяет держать сосуд в открытом состоянии; хирургическое устранение стеноза.

Часто причиной тромбоза почечной артерии являются эмболии, возникающие в сердце, например, при фибрилляции предсердий, которые сопровождаются такими симптомами, как боль в боку, протеинурия, очень высокий уровень ЛДГ. Боль в боку также наблюдается при тромбозе почечной вены, но при этом дополнительно также выявляется протеинурия и в некоторых случаях гематурия или нефротический синдром.

Головной мозг

Суженные сосуды в области мозга приводят к снижению снабжения кислородом и в том случае, когда артерии закупориваются (например, в острой фазе образования сгустка крови из-за изменений, вызванных склерозом артерий), возникает инсульт, сопровождающийся потерей чувствительности, параличем, нарушением речи и т. п. В артериях мозга, таких как крупные артерии, склероз артерий может в редких случаях приводить к аневризмам сосудистых стенок и в сочетании с факторами риска, такими как гипертензия, сосудистая стенка может разрываться и приводить к угрожающему жизни внутреннему кровотечению.

Неожиданно было показано, что определенные пептидные маркеры, выявленные в образце мочи у субъекта, могут использоваться для диагностики СЗ и, соответственно, для принятия решения о необходимости проведения медикаментозной терапии.

Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию данных о наличии или отсутствии по меньшей мере одного пептидного маркера, в идеальном случае нескольких пептидных маркеров, в образце мочи у субъекта для целей диагностики сосудистых заболеваний, где указанный один или несколько полипептидных маркеров выбирают из полипептидных маркеров №№ 1-526, которые характеризуются значениями молекулярной массы и временем миграции, приведенными в табл. 1.

- 2 014529

Таблица 1. Полипептидные маркеры, используемые для диагностики сосудистых заболеваний, и соответствующие им молекулярные массы и время миграции (СЕ время в минутах)

Νο.	Масса	СЕ время	N0.	Масса	СЕ время	N0.	Масса	К время	N0.	Масса	СЕ время	Νο.	Масса	СЕ время
1	1166,61	23,88	51	11058,18	21,88	101	3984,81	21,29	151	2082,01	33,67	201	1013,41	25,33
2	2431,50	24,10	52	1352,61	29.86	102	4830,78	26,61	152	1768,90	20,77	202	1016,49	25,88
3	1922,93	31,99	53	2802,85	36,35	103	3031,39	35,93	153	3442,09	33,32	203	1493,74	22,06
4	2509,16	25,76	54	4890,88	26,48	104	3788,76	2521	154	876,42	35,07	204	2104,04	32,97
5	3194,22	30,34	55	5212,06	26,98	яж			155	2352,14	26,74	205	3718,81	32,39
6	1705,80	40,47	56	945,45	25.80	гос	:Жв		156	937,50	34,12	206	4251,98	28,66
Ί	1962,95	31,77	57	1065,55	25,50	107	2241,51	24,11	157	1445,72	28,36	207	4538,67	26,20
8	3822,12	24,72	58	1137,58	26,41	108	2461,11	30,84	158	1893,10	28,85	208	2067,93	20,68
9	2212,32	24,94	59	1542,77	23,91	109	1965,96	23,62	159	2839,43	24,14	209	2292,11	27,26
10	3015,78	35,86	60	1693,83	23,47	110	2189,08	27,17	160	1600,76	29,61	210	3702,39	32,39
11	1784,95	20,94	61	3361,42	24,26	111	1127,58	20,82	161	1565,75	26,35	211	965,46	27,84
12	1902,92	31,87	62	3617,74	26,97	112	1400,71	20,35	162	1627,76	29,47	212	2186,07	25,89
13	2329,15	27,17	63	3737,69	37,15	113	1512,75	39,51	163	1812,90	39,98	213	2584,29	35,08
14	2154,05	21,78	64	980,54	22,44	114	1860,53	34,24	164	3137,52	30,29	214	2841,13	24,50
15	2166,03	27,89	65	1221,63	26,82	115	1442,69	27,72	165	1364,67	28,65	215	9866,78	20,85
16	2258,27	21,99	66	2952,27	25,14	116	2590,78	27,96	166	2298,07	33,82	216	1099,53	28,33
17	2573,84	20,49	67	3696,88	26,94	117	1556,72	27,90	167	3017,74	49,66	217	2471,25	34,69
16	1270,75	37,92	68	5574,45	23,24	118	2309,15	21,95	168	1235,61	26,67	218	3734,85	32,41
19	1611,84	40,12	69	1182,59	28,34	119	2389,33	22,34	169	1741,81	30,21	219	3927,86	33,50
20	1791,87	41,04	70	1963,96	31,76	120	1478,68	39,28	170	1818,90	30,93	220	3166,32	22,10
21	2030,00	25,23	71	882,54	23,81	121	1795,90	24,66	171	1892,95	22,22	221	2339,08	33,95
22	1290,40	30,87	72	4002,72	20,69	122	2211,03	35,06	172	3280,69	22,69	222	2563,76	22,05
23	1441,74	39,13	73	4059,96	20,44	123	1223,63	19,52	173	2658,34	19,50	223	3219,35	35,00
24	2924,25	24,05	74	1186,59	22,31	124	1829,04	21,22	174	1407,71	27,46	224	3359,66	31,84
25	816,41	21,10	75	1825,87	31,80	125	1878,66	30,19	175	1622,79	26,82	225	4097,98	24,59
26	963,52	21,71	76	3401,66	23,42	126	2009,96	32,27	176	1684,78	29.64	226	4654,14	25,81
27	1503,74	29,63	77	1496,75	30,36	127	2110,00	24,10	177	1321,65	28,39	227	1584,77	29,72
28	2849,59	23,02	78	1832,92	31,91	128	1552,79	29,75	178	1350,68	27,13	228	2148,10	25,54
29	3133,20	31,20	79	2281,35	36,34	129	1577,75	40,03	179	1549,78	39,52	229	2639,45	21,33
30	1283,62	27,30	80	2344,34	33,66	130	1936,94	34,71	180	2233,10	22,47	230	3013,27	22,27
31	1495,75	23,31	81	3944.82	24,59	131	2368,13	26.75	181	2679,27	23,48	231	3205,39	19,71
32	1513,70	29,29	82	3002,23	23,80	132	3633,05	33,25	182	1835,79	20,02	232	3831,86	28,39
33	1612,53	23,36	83	3416,77	36,76	133	1510,72	28.30	183	3421,66	25,96	233	1050,52	27,03
34	2319,19	33,80	84	3501,86	31,79	134	1668,87	40,49	184	1708,85	30,44	234	2157,06	22,19
35	2436,23	22,87	85	6783,03	26,61	135	2227,05	33,43	185	1993,96	32,16	235	2407,16	27,65
36	2557,42	28,22	86	14111,27	21,97	136	1495,75	39.41	186	2695,31	23,46	236	2837,93	23,99
37	2626,85	28,00	87	2616,02	28.35	137	1631,77	45,38	187	1204,65	21,93	237	3058,02	30,20
36	2933,46	27,68	88	2810,45	36,73	138	3158,60	29,62	188	1467,86	24,38	238	1658,67	21,53
39	2994,09	29,50	89	2940,95	29,07	139	1522,78	22,76	189	1767,07	24,10	239	3311,32	24,48
40	4101,34	28,51	90	2946,45	34,96	140	1727,87	39,61	190	8176,30	19,57	240	3556,63	23,64
41	935,49	23,69	91	1494,72	30,40	141	1883,94	40,14	191	1143,56	36,97	241	1085,50	21,70
42	1521,75	30,42	92	1080,53	27,86	142	1460,71	19,83	192	1834,90	31,05	242	1199,63	21,91
43	1669,79	21,48	93	2349,14	27,36	143	1805,88	29,92	193	2025,95	32,21	243	1247,58	22,00
41	2756,37	28,94	91	3303,00	23,07	141	1898,93	40,30	194	3489,70	31,45	244	1608,76	22,36
45	3546,94	26,22	95	4081,56	24,51	145	2237,06	27,12	195	1268,62	27,29	245	2501,20	34,30
46	3609,63	20,22	96	4670,27	25,84	146	3178,33	30,26	196	1659,82	29,35	246	3021,52	23,52
47	3697,49	23,71	97	4671,99	23,33	147	1844,56	34,28	197	2405,59	22,16	247	4153,75	33,41
46	4273,73	23,34	98	8933,94	22,57	148	1378,57	37,16	198	2483,21	27,54	248	5000,17	24,43
49	4421,04	20,73	99	1523,90	29,72	149	1764,86	29,88	199	2599,21	28,20	249	8917,48	22,53
50	4865,67	26,49	100	3956,82	25,20	150	1791,88	30,77	200	4170,01	33,51	250	1750,86	23,80

- 3 014529

251	2235,13	34,10	301	1649,79	19,59	351	2073,17	27,43	401	1749,88	30,54
252	2644,25	21,13	302	4025,68	20,73	352	7958,65	34,32	402	1956,97	21,44
253	3943,96	33,53	303	980,33	35,59	353	1837,88	30,54	403	2189,12	26,54
254	11967,96	20,50	304	1096,41	35,95	354	2939,03	33,75	404	2257,63	36,10
255	2553,23	34,14	305	1698,65	37,60	355	2977,31	19,59	405	2917,54	28,99
256	1209,56	26,31	306	2361,21	20,77	356	3596,46	21,54	406	3633,69	26,99
257	1899,94	21,41	307	3148,50	24,22	357	3851,68	24,97	407	6055,77	21,03
258	1680,00	23,77	308	3157,23	34,74	358	1135,52	27,83	408	6186,02	24,99
259	2195,06	20,15	309	1304,59	27,95	359	3378,05	38,81	409	1858,92	24,17
260	3064,41	20,55	310	3575,78	32,27	360	3590,72	28,99	410	2274,11	33,47
261	3554,07	31,11	311	1510.75	20,12	361	3959,80	19,95	411	4522,51	26,20
262	3686,03	22,16	312	2485,20	34,25	362	1258,41	36,10	412	6237,35	31,39
263	3802,12	33,10	313	3076,33	19,64	363	1513,50	36,82	413	9883,82	20,84
264	4048,05	25,42	314	3343,39	31,80	364	1716,38	20,59	!1 111	3385,59	25,47
265	2380,16	36,48	315	1405,71	20,16	365	2022,97	33,38		3745,55	26,65
266	1352,83	24,38	316	2587,16	21,07	366	2914,54	24,29	: $	1408,72	39,13
267	1638,80	20,26	317	5213,25	22,47	367	5527,56	27,58	417.	2551,32	34,75
268	2864,18	20,19	318	2320,16	20,73	368	931,51	20,00		3265,33	36,02
269	3754,66	37,16	319	4491,89	26,23	369	973,26	35,59	' 419:	2739,25	28.4
270	4185,91	33,47	320	10199,91	21,11	370	1385,67	27,92		2065	24,48
271	858,42	23,26	321	854,38	34,92	371	2272,31	23,80		2264,12	22,67
272	1159,64	26,05	322	1084,56	36,85	372	4024,87	33,20	: Ш'	1058,53	24,94
273	1407,71	37,25	323	1814,78	37,29	373	2216,11	33,79		4467,94	29.05
274	1439,72	29,62	324	2078,05	22,47	374	2756,23	35,16	ϊ>;:ϊί24·<>	2887,42	35,66
275	1720,76	19,72	325	2175,08	33,26	375	2777,71	21,55	А 425	1635,84	40,33
276	1846,93	32,04	326	2411,78	26,97	378	3521,02	30,73	: 42б:	2525,21	27,72
277	3177,14	22,48	327	3738,59	24,76	377	3750,72	32,45	:.....	1526,75	23,63
278	4113,80	24,58	328	3935,57	34,15	378	4229,09	29,08	: 428	1664,82	29,87
279	2744,07	35,03	329	4863,21	26,66	379	4846,50	26,40		2583,33	28,31
280	2767,26	21,52	330	860,39	2625	380	1046,55	25,35	430	2663,27	23,44
281	1310,64	27,11	331	1567,78	20,23	381	1608,80	30,94	: 4;Т	1878,87	42,18
282	1613,88	23,95	332	2308,11	27,32	382	1878,78	31,58	: 432	1462,67	39,31
283	1703,90	33,64	333	2923,77	36,44	383	2589,16	22,45	ίι'ιβιιι'ι'	1834,92	24
284	2761,40	21,46	334	3295,55	25,40	384	4369,06	20,25	: .¾.	1893,06	24,64
285	3242,42	22,78	335	3870,85	33,39	385	12717,08	26,92	:! ж	1933,95	21,63
286	3338,17	23,36	336	1099,56	21,63	386	1210,43	36,48		1367,7	38,87
287	3371,74	22,96	337	1359,70	22,92	387	3092,54	36,22		1009,49	27,33
288	3593,53	20,25	338	2059,02	23,12	388	3248,61	25,65	(Ж:	3405,09	25,92
289	3677,52	24,49	339	2077,03	21,78	389	4012,41	20,81	: 43?	2314,1	33,67
290	1624,80	30,81	340	3349,34	35,81	390	11016,34	21,31		3996,84	20,93
291	2210,92	37,55	341	8853,85	21,08	391	1284,61	29,17	441.·.	2823,6	29,07
292	3290,37	24,12	342	1734,80	20,24	392	1460,83	22,53	. 4421 .	1179,57	27,15
293	4413,76	29,03	343	1847,95	43,93	393	1807,88	23,98	ί „	1435,72	28,86
294	1482,73	22,47	344	2045,95	34,04	394	2596,33	34,86	!; -444 ί	2430,72	35,39
295	1813,78	31,87	345	2289,47	33,56	395	2686,97	29,06		1134,63	23,68
296	1934,87	20,04	346	2421,15	34,74	396	3871,59	27,51	: Ж	2013,98	25,18
297	2249,89	34,14	347	2480,67	23,00	397	4069,63	25,30	1 447	2577,29	24,55
298	3280,59	25,76	348	2576,25	34,17	398	4288,98	25,94	Ш .	1194,6	26,73
299	1098,56	21,46	349	3353,93	23,53	399	4426,21	20,09	ш	1588,77	30,2
300	1125,58	21,76	350	1083,52	26,24	400	1071,55	21,41		2056,02	25,44

Νο.	Масса	СЕ ерм«й	Νο,	Масса
	2442,16	34,11		1173,58	37,51
ОжШ&Ж	1422,66	21,72		1100,55	36,99
	1623,8	24,15		1128.44	33,71
				41/α β	11 74

Предпочтительно используют маркеры 1-104 и/или 107-413.

Применительно к настоящему изобретению, возможно также установить тяжесть указанного СЗ. Информация такого рода помогает определить, какие терапевтические меры следует применить.

Время миграции определяют с помощью капиллярного электрофореза (СЕ), например, как описано в приведенном ниже примере, раздел 2. Для этого используют стеклянный капилляр длиной 90 см с внутренним диаметром (в.д.) 75 мкм и наружным диаметром (н.д.) 360 мкм при напряжении 30 кВ. В качестве растворителя для образца используют 30% метанол, 0,5% муравьиную кислоту в воде.

Известно, что показатель времени миграции СЕ может варьировать. Тем не менее, порядок значений, при которых элюируются полипептидные маркеры, в типичном случае одинаков для любой исполь

- 4 014529 зуемой системы СЕ. Для компенсации различий во времени миграций система может быть нормализована с использованием стандартов, для которых показатели времени миграции известны. Указанные стандарты могут представлять собой, например, полипептиды, указанные в примерах (см. пример, раздел 3).

Характеристики полипептидных маркеров, показанных в табл. 1-3, были определены с помощью метода капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии (СЕ-М8), который был подробно описан, например, Нейхоффом с соавт. (ΝοιιΙιοΤΤ с1 а1., Κηρίά Соттишеайопк ίη такк креейотейу, 2004, Уо1. 20, рр. 149-156). Вариации в значениях молекулярной массы между отдельными измерениями или между измерениями, полученными с использованием разных масс-спектрометров, относительно малые и в типичном случае варьируют в диапазоне ±0,1%, предпочтительно в диапазоне ±0,05%, более предпочтительно в диапазоне ±0,03% и наиболее предпочтительно в диапазоне ±0,01%.

Полипептидные маркеры согласно настоящему изобретению представляют собой белки или пептиды или продукты разложения белков или пептидов. Они могут быть химически модифицированы, например, за счет посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, фосфорилирование, алкилирование или формирование дисульфидных мостиковых связей, или с помощью других реакций, например, связанных с деградацией. Кроме того, полипептидные маркеры могут быть также химически изменены, например за счет окисления, возникающего при очистке образцов.

На основе параметров, определяющих полипептидные маркеры (молекулярный вес и время миграции), становится возможным идентифицировать последовательность соответствующих полипептидов с использованием известных в данной области методик.

Полипептиды согласно настоящему изобретению (см. табл. 1-4) используются для диагностики тяжести СЗ. Термин диагностика в контексте настоящего описания обозначает процесс формирования заключения на основании информации о симптомах или явлениях, характерных для того или иного заболевания или повреждения. В данном случае вывод о тяжести СЗ делается на основании наличия или отсутствия конкретных полипептидных маркеров. Таким образом, полипептидные маркеры согласно настоящему изобретению определяют в образце, взятом от субъекта, где наличие или отсутствие маркера позволяет сделать вывод о тяжести СЗ. Наличие или отсутствие полипептидного маркера может быть определено по методу, известному в данной области. Ниже приведены примеры известных методик, которые могут быть использованы с этой целью.

Считается, что полипептидный маркер присутствует, если измеряемый соответствующий показатель такой же по величине, как и пороговое значение. Если данный измеряемый показатель по величине ниже указанного порогового значения, то полипептидный маркер расценивается как отсутствующий. Указанное пороговое значение может быть определено либо с учетом данных о чувствительности метода измерения (предела определения), либо эмпирически.

В контексте настоящего изобретения считается, что пороговое значение превышено, предпочтительно в том случае, если измеряемый показатель для образца с данной молекулярной массой по меньшей мере в два раза превышает соответствующее значение для образца слепой пробы (например, только буферного раствора или растворителя).

Один или несколько полипептидных маркеров могут использоваться таким образом, чтобы измерялось наличие или отсутствие указанного одного или нескольких маркеров, где наличие или отсутствие является показателем тяжести СЗ (маркер частоты). Таким образом, имеются полипептидные маркеры, которые в типичном случае присутствуют у субъектов с СЗ, но встречаются не так часто или отсутствуют у субъектов без СЗ, например см. 1-24 (табл. 2). Дополнительно, имеются полипептидные маркеры, которые выявляются у пациентов с СЗ, такие как полипептидные маркеры Νο. 25-106, но которые встречаются реже или вовсе отсутствуют у пациентов без СЗ.

- 5 014529

Таблица 2. Полипептидные маркеры (маркеры частоты) для диагностики сосудистых заболеваний, соответствующие им значения молекулярной массы, времени миграции, а также их наличие или отсутствие у пациентов, страдающих от СЗ (СЗ), и в контрольных группах (контроль) как определяющий фактор (1=100%, 0-0%; где условия обработки образца и измерения описаны в примере)

Νο.	Встречаемость, контро/ъ	Встречаемость, СУО	Νο.	Встречаемое»,, контроль	встречаемость. СУО
1	0.01	0.58	54	0,52	0.08
2	0.18	0.75	55	0,59	0,17
3	0,14	0,67	56	0,65	0,21
4	0,25	0,75	57	0,48	0,04
5	0,08	0,58	58	0,57	0.13
6	0.05	0,54	59	0,56	0,13
7	0,36	0.83	60	0.44	0.00
8	0,31	0,79	61	0.57	0,13
9	0,26	0,71	62	0,44	0,00
10	0.14	0,58	63	0,73	0,29
11	0,06	0,50	64	0.53	0,08
12	0,15	0,58	65	0.50	0.04
13	0.31	0.75	66	0.49	0,04
14	0,32	0,75	67	0,70	0,25
15	0,12	0,54	68	0,91	0,46
16	0,03	0,46	69	0,71	0,25
17	0.25	0,67	70	0.63	0,17
18	0.18	0,58	71	0.47	0,00
19	0,47	0,88	72	0.81	0,33
20	0,18	0,58	73	0,59	0,13
21	0,09	0,50	74	0,90	0,42
22	0,27	0,67	75	0.77	0.29
23	0.18	0,58	76	0.94	0.46
24	0,10	0,50	77	0,69	0,21
25	0,44	0,04	78	0.49	0,00
26	0,44	0.04	79	0,66	0.17
27	0,44	0,04	80	0,53	0.04
28	0,48	0,08	81	0,53	0.04
29	0.74	0,33	82	0.67	0,17
30	0,62	0,21	83	0.50	0,00
31	0,45	0.04	84	0.50	0,00
32	0,41	0,00	85	0,62	0,13
33	0,62	0,21	86	0,88	0.38
34	0.74	0,33	87	0.63	0,13
35	0.41	0,00	88	0.55	0,04
36	0.78	0,38	89	0.52	0,00
37	0,45	0,04	90	0,61	0,08
38	0,70	0,29	91	0.91	0,38
39	0.78	0.38	92	0.75	0,21
40	0,41	0,00	93	0.67	0,13
41	0,67	0,25	94	0,73	0.17
42	0,59	0,17	95	0,60	0,04
43	0,67	0,25	96	0,69	0.13
44	0.54	0.13	97	0.85	0.29
45	0.63	0,21	98	0.60	0.04
46	0,42	0,00	99	0,70	0,13
47	0,80	0,38	100	0,71	0.13
48	0,54	0,13	101	0,58	0,00
49	0,42	0,00	102	0,59	0,00
50	0.58	0,17	103	0,80	0,17
51	0,42	0,00	104	0.77	0.08
52	0,72	0.29	105 . :·· .·	...... ....	... ,049 . . .
53	0,52	0.08	.7 106 .·::·	о,9о;	0.49 '

Дополнительно или альтернативно к маркерам частоты (определение наличия или отсутствия), в табл. 3 указаны амплитудные маркеры, которые также могут использоваться для диагностики СЗ (№№ 107-526). Амплитудные маркеры используются таким образом, что наличие или отсутствие в этом случае не является решающим фактором, но высота сигнала (амплитуда) позволяет сделать вывод, присутствует ли сигнал в обеих группах. В табл. 3 и 4 указаны средние значения амплитуд соответствующих сигналов (охарактеризованных по массе и времени миграции) в значениях, усредненных для всех измеренных образцов. Для достижения сравнимости между различными концентрированными образцами или различными методами измерения возможны два метода нормализации. В рамках первого метода, все пептидные сигналы образца нормализуют до общей амплитуды 1 миллион единиц. В этой связи, соответствующие средние значения амплитуд индивидуальных маркеров указываются в виде показателей частей на миллион или миллионных долей (м.д.). Амплитудные маркеры, определенные по данному методу, проиллюстрированы в табл. 3 (№№ 107-413).

Дополнительно, возможно определить другие амплитудные маркеры с помощью альтернативного метода нормализации: в этом случае ранжируют все пептидные сигналы от одного образца с использованием общего фактора нормализации. Таким образом, достигается линейная регрессия между значениями пептидных амплитуд индивидуальных образцов и стандартными показателями для всех известных полипептидов. Угол наклона прямой регрессии соответствует относительной концентрации и используется в

- 6 014529 качестве фактора нормализации для данного образца. Биомаркеры, полученные в рамках указанного метода нормализации, приведены в табл. 4 (№№ 414-526).

Во всех использованных в испытании группах было включено по меньшей мере 20 индивидуальных образцов от пациентов или контрольных образцов с целью получения надежных значений средних показателей для амплитуды. Решение о диагнозе (наличие СЗ или нет) принимают, сравнивая, насколько выше амплитуды соответствующих полипептидных маркеров в образце пациента, чем средние значения амплитуд в контрольной группе или группе с СЗ. Если указанная амплитуда скорее соответствует среднему значению амплитуд в группе с СЗ, то рассматривается вариант наличия сосудистого заболевания, и если скорее соответствует среднему значению амплитуд в контрольной группе, то делается вывод об отсутствии СЗ. Расстояние между измеренным значением и средним значением амплитуды может оцениваться как вероятность того, что конкретный образец принадлежит к той или иной группе. Такого рода пояснения могут быть даны с помощью маркера Νο. 137 (табл. 3). Среднее значение амплитуды указанного маркера существенно повышается при СЗ (12044 м.д. в сравнении с 5726 м.д. в контрольной группе). В этом случае, если значение для данного маркера в образце пациента составляет от 0 до 5726 м.д. или превышает этот диапазон максимум на 20%, например составляет от 0 до 6871 м.д., то делается вывод, что данный образец относится к контрольной группе. Если указанное значение составляет 12044 м.д. или ниже на 20% или выше, то есть его значение составляет от 9635 и более, то данный результат рассматривается как показание на наличие сосудистого заболевания.

Альтернативно, расстояние между измеренным значением и средним значением амплитуды может оцениваться как вероятность того, что данный образец принадлежит к той или иной группе.

Маркер частоты представляет собой вариант амплитудного маркера, где указанная амплитуда является низкой в некоторых образцах. Возможно превратить такие маркеры частоты в амплитудные маркеры за счет включения соответствующих образцов, в которых указанный маркер не найден, в расчеты амплитуды в случае очень малой амплитуды, относительно предела выявления.

Таблица 3. Амплитудные маркеры при их нормализации в соответствии с подходом 1

Но.	Сряня еипяпда, гапршмаяти1*^	амплитуда. ФртвЗДО	Νο.	Средтй Яиплпуда, юяролмя группа	Среди яв аМЛпуда,	N0.	Средняя штггда, «шрстым грдав	Средам зют туда, фунта СОД)
107	94	253	157	100	202	207	220	44
108	116	233	158	189	513	208	1195	546
109	50	123	169	1054	486	209	3909	1825
110	766	1878	160	161	412	210	406	167
111	45	175	161	123	456	211	149	58
112	89	419	162	229	517	212	1098	2400
113	69	146	163	273	554	213	769	164
114	174	416	164	196	517	214	527	1675
115	73	639	165	197	97	215	1173	416
116	47	99	166	176	506	216	711	324
117	59	188	167	1480	686	217	470	181
113	120	357	166	3107	880	218	723	333
119	317	2460	169	80	216	219	213	102
120	121	463	170	203	1328	220	345	169
121	172	380	171	344	848	221	677	334
122	796	1674	172	797	206	222	2489	744
123	167	888	173	1146	2842	223	132	63
124	1703	636	174	224	568	224	1451	717
125	768	3651	175	138	450	225	1324	299
126	340	1283	176	258	525	226	1689	741
127	193	583	177	15571	7296	227	88	233
123	135	320	176	367	745	228	191	701
129	243	566	179	185	575	229	361	из
130	95	214	180	260	130	230	5095	1789
131	161	768	181	1492	3433	231	601	241
132	118	299	182	784	351	232	1200	403
133	116	267	183	1158	2826	233	736	245
134	840	1950	184	919	371	234	1171	297
135	102	288	186	156	466	235	678	263
136	127	283	186	1694	4348	236	1597	482
137	5726	12044	187	201	68	237	115	353
138	263	728	188	1737	737	238	392	146
139	506	154	189	2810	6060	239	120	265
140	113	289	190	1703	766	240	1127	465
141	150	301	191	461	1095	241	623	140
142	136	290	192	707	6665	242	250	115
143	51	189	193	493	1490	243	633	ЗОВ
144	168	343	194	346	799	244	224	81
145	196	769	195	3338	9120	245	120	60
146	119	250	196	240	654	246	1275	43В
147	161	358	197	80	203	247	283	89
148	227	58	198	490	236	248	1514	737
149	130	289	199	259	533	249	264	91
150	97	196	200	1142	421	250	900	278
151	192	504	201	1241	2506	251	776	338
152	301	128	202	1511	749	252	411	97
Ϊ53	442	108	203	294	107	253	227	103
154	154	1119	204	1090	2230	254	186	53
155	197	725	205	1151	456	255	890	332
156	82	201	206	983	475	256	469	1170

- 7 014529

Νο.	Средняя аылмтуда, контрольная труппа	Средняя амплитуда, группа СЮ	Νο.	Средняя аипмпуда, контр смытая группа	Средняя амляшуда, группа СЮ	Νο.	Средняя анплуда, контрольная группа	Средняя амплитуда, группа СУО
257	152	70	307	97	39	357	789	179
258	21200	7156	308	48	104	358	263	104
259	282	116	309	176	375	359	184	84
260	474	152	310	87	185	360	206	52
261	117	274	311	187	91	361	755	287
262	1359	517	312	143	43	362	246	26
263	421	195	313	381	143	383	Мб	106
264	183	83	314	402	194	364	1329	142
265	151	64	315	237	113	365	122	23
266	206	99	316	519	207	Ж	105	46
267	588	256	317	115	56	367	311	127
266	304	119	318	197	61	363	131	56
269	147	61	319	254	1335	369	206	38
270	172	66	эго	283	140	370	104	41
271	338	157	321	88	201	371	126	43
272	292	13а	322	119	56	372	345	110
273	227	110	323	129	46	373	416	161
274	142	387	324	125	50	374	209	86
275	166	79	325	3240	7677	375	268	54
276	179	385	32В	114	51	376	549	188
277	200	75	327	236	89	377	115	36
278	211	81	328	163	79	378	353	110
279	169	68	329	702	204	379	379	135
280	359	157	330	481	159	380	503	52
281	141	284	331	407	175	381	753	360
282	244	104	332	228	79	382	335	2617
283	832	331	333	200	98	383	97	31
284	903	324	334	356	80	384	1280	178
285	231	96	335	152	72	365	438	64
286	1420	457	336	170	64	386	374	92
287	2096	591	337	281	50	387	329	109
288	676	261	338	293	104	368	283	124
289	470	234	339	796	299	389	273	36
290	169	49	340	174	63	390	3045	864
291	234	517	341	1025	194	391	51	25
292	624	309	342	209	95	392	711	69
293	279	Ш	343	407	145	393	187	82
294	444	130	344	144	462	394	74	29
295	752	1640	345	182	74	395	197	61
296	543	191	346	95	42	395	320	100
297	164	66	347	92	16	397	712	156
298	785	274	34В	150	36	398	187	46
299	185	79	349	256	96	399	337	.7 . .
300	234	99	350	130	51	400	133	59
301	179	46	351	96	46	401	297	110
302	360	141	352	330	157	402	164	55
303	106	37	353	248	107	403	876	4574
304	146	47	354	205	69	404	820	309
305	730	323	355	310	36	405	845	288
306	373	40	356	411	139	406	475	119

Νο.	Средняя аитпиуда, контрольная группа	Средейя аиппттуда, группа СУО
407	275	91
406	1590	291
409	1343	334
410	180	51
411	149	13
412	298	135
413	469	42

- 8 014529

Таблица 4. Амплитудные маркеры, при их нормализации в соответствии с подходом 2

Νο.	Средняя амплитуда, контрольная группа	Средняя амплитуда, группа СУР	Νο.	Средняя амплитуда, контрольная группа	Средняя амплитуда, групп» СУР
414	3214	2678	471	358	423
415	514	250	472	3360	3317
416	1359	615	473	4000	2575
417	581	174	474	1388	2785
418	630	499	475	335	3122
419	212	141	476	302	237
420	681	381	477	351	847
421	445	227	478	186	145
422	1178	103	479	3094	2397
423	540	348	480	4737	2446
424	138	206	481	1468	2644
425	1540	687	482	566	974
426	569	914	483	535	429
427	301	106	484	2818	4530
428	976	511	485	17423	37226
429	972	515	486	3087	1793
430	1320	729	487	25	319
431	278	210	488	3397	6633
432	1682	1196	489	2904	6138
433	589	287	490	239	198
434	384	502	491	1794	3083
435	1006	399	492	2558	1701
436	1064	800	493	428	419
437	270	216	494	1326	2891
438	3453	2235	495	181	788
439	837	790	496	212	207
440	1353	684	497	741	600
441	710	733	498	135	197
442	809	627	499	4632	4647
443	8328	3904	500	331	461
444	596	661	501	302	414
445	380	593	502	206	306
446	2389	1375	503	1521	3346
447	297	285	504	349	561
448	4154	2314	505	211	315
449	532	953	506	208	247
450	1145	733	507	1270	1039
451	744	845	508	305	334
452	2878	2433	509	213	266
453	8725	4307	510	2436	3827
454	1109	1620	511	460	294
455	750	409	512	389	924
456	687	971	513	197	273
457	2155	1229	514	152	448
458	1622	1964	515	743	575
459	50512	45582	516	428	713
460	2259	2915	517	186	298
461	4142	4664	518	219	296
462	6265	8932	519	4218	7613
463	1969	2931	520	75	148
464	36818	19376	521	96	214
465	1352	1531	522	58	92
466	5789	1562	523	208	316
467	2562	1358	524	349	729
468	91735	90455	525	543	1220
469	7723	4053	526	388	684
470	2496	1342

Субъект, для которого отбирают образец и определяют наличие или отсутствие одного или нескольких полипептидных маркеров, может быть любым субъектом, который страдает от СЗ. Предпочтительно указанный субъект представляет собой млекопитающее и наиболее предпочтительно человека.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют не один полипептидный маркер, но сочетание полипептидных маркеров для определения тяжести СЗ, где заключение о тяжести СЗ делается на основании их наличия или отсутствия. При сравнении множества полипептидных маркеров снижается или устраняется двойственность в общей оценке результатов, в случае нескольких индивидуальных отклонений от типичной вероятности наличия у больного индивидуума или у контрольного индивидуума.

Образец, в котором определяют наличие или отсутствие одного или нескольких пептидных маркеров согласно настоящему изобретению, может быть любым образцом, который получают из организма субъекта. Указанный образец представляет собой образец, который имеет полипептидный состав, подхо

- 9 014529 дящий для обеспечения соответствующей информацией о состоянии субъекта (наличие СЗ или отсутствие). Например, это может быть образец крови, мочи, синовиальной жидкости, тканевой жидкости, секрета организма, пота, цереброспинальной жидкости, лимфы, кишечного, желудочного сока или сока поджелудочной железы, желчи, слезной жидкости, образец ткани, спермы, вагинальной жидкости или образец кала. Предпочтительно образец представляет собой жидкий образец.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный образец представляет собой образец мочи или образец крови, где образец крови может представлять сыворотку (крови) или образец плазмы (крови).

Образцы крови могут быть отобраны по методике, преимущественно используемой в данной области. Предпочтительно используют образец из средней струи мочи, в качестве образца согласно настоящему изобретению. Например, образец мочи может быть отобран с помощью аппарата для мочеиспускания, описанного в \УО 01/74275.

Образцы крови могут быть отобраны по известным в данной области методикам, например, из вены, артерии или капилляра. Обычно образец крови получают при отборе венозной крови с помощью шприца, например из руки субъекта. Термин образец крови включает образцы, полученные из крови при дальнейшем использовании методов очистки и разделения, с получением образцов плазмы крови или сыворотки крови.

Наличие или отсутствие полипептидного маркера в образце может быть определено по любому методу, известному в данной области, который подходит для определения полипептидных маркеров. Такие методы известны специалистам в данной области. В принципе, наличие или отсутствие полипептидного маркера может быть определено с использованием прямых методов, таких как масс-спектрометрия, или опосредованных методов, например, при оценке лигандов.

Если требуется или если желательно, образец от субъекта, например образец мочи или крови, может быть подвергнут предварительной обработке любыми подходящими методами и, например, подвергнут очистке или разделению перед определением наличия или отсутствия одного или нескольких полипептидных маркеров. Указанная обработка может включать, например, очистку, разделение, разбавление или концентрирование. Применяемые при этом методы могут представлять собой, например, центрифугирование, фильтрование, ультрафильтрацию, диализ, осаждение или хроматографические методы, такие как аффинное разделение или разделение с помощью ионообменной хроматографии, электрофоретическое разделение, например разделение на основе различного характера миграции электрически заряженных частиц в растворе под действием электрического поля. Конкретные примеры таких методов включают гель-электрофорез, двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2Э-ПААГ), капиллярный электрофорез, хроматография, основанная на аффинности к металлу, хроматография, основанная на иммобилизации, определяемой аффинностью к металлу (1МАС), аффинная хроматография, основанная на сродстве к лектину, жидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ВЭЖХ с нормальной и обращенной фазой, катионообменная хроматография и методы, основанные на селективном связывании с поверхностями. Все перечисленные методы хорошо известны в данной области и любой специалист со средним уровней знаний способен выбрать соответствующую методику как функцию используемого образца, а также метод определения наличия или отсутствия одного или нескольких полипептидных маркеров.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный образец перед проведением разделения с помощью капиллярного электрофореза подвергают разделению, очистке ультрацентрифугированием и/или разделению методами ультрафильтрации на фракции, которые содержат полипептидные маркеры определенного молекулярного размера.

Предпочтительно используют метод масс-спектрометрии для определения наличия или отсутствия полипептидного маркера, где очистка или разделение образца могут быть проведены с учетом результатов данного метода. В сравнении с используемыми в настоящее время методиками, массспектрометрический анализ имеет то преимущество, что в ходе одного анализа может быть определена концентрация большого числа (>100) полипептидов в образце. При этом может использоваться любой масс-спектрометр. С использованием масс-спектрометрии в сложной смеси возможно измерить полипептидный маркер на уровне 10 фмолей, то есть 0,1 нг белка размером 10 кД, в рамках рутинного исследования с достоверностью примерно ±0,01%. В масс-спектрометрах ионобразующую единицу связывают с подходящим анализируемым устройством. Так, например, для измерения в жидких образцах чаще всего используют интерфейсы с электронапылением-ионизацией (Ε8Ι), тогда как метод ΜΑΕΌΙ (лазерная десорбция/ионизация, связанная с матрицей) используют для измерения уровня ионов в образцах, кристаллизованных в матрице. Для анализа образованных ионов могут использоваться анализаторы квадруполей, ионные ловушки или устройства для определения времени полета (ТОЕ).

При проведении ионизации электронапылением (Ε8Ι) молекулы, присутствующие в растворе, подвергаются атомизации, в частности при воздействии тока высокого напряжения (например, 1-8 кВ), при этом вначале образуются заряженные капельки, которые становятся меньше при испарении растворителя. В итоге, так называемые кулоновские взрывы приводят к образованию свободных ионов, которые могут быть выявлены и проанализированы.

- 10 014529

При проведении анализа ионов с помощью метода ΤΘΕ, достигают ускорения при определенном значении напряжения, которое сообщает одинаковое количество кинетической энергии ионам. После этого очень тщательно измеряют время, необходимое соответствующим ионам для преодоления определенного расстояния при полете через трубку. Поскольку при условии равного уровня кинетической энергии скорость ионов зависит от их массы, то последний параметр может быть определен. Анализаторы, функционирующие по принципу ΤΘΕ, обладают очень высокой скоростью сканирования и, в этой связи, позволяют достичь хорошего разрешения.

Предпочтительные методики, используемые для определения наличия или отсутствия пептидных маркеров, включают спектрометрию ионов в газовой фазе, такую как лазерная масс-спектрометрия десорбции/ионизации МАЬБ1-ТОЕ М8, 8ΕΕΌΙ-ΤΘΕ М8 (лазерная десорбция/ионизация), усиленная поверхностным взаимодействием, М8 ЬС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия), 2Б-ПААГ/М8 и методы капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии (СТ-М8). Все указанные методики известны специалистам в данной области.

Особенно предпочтительной является методика СЕ-М8, в рамках которой капиллярный электрофорез объединен с масс-спектрометрией. Данный метод описан более детально, например, в заявке на патент Германии ΌΕ 10021737, а также в работах Кайзера с соавт. (Ка18ег е! а1., 1. Сйгоша!одг. А, 2003, Уо1, 1013: 157-171; и Е1ес!горйоге818, 2004, 25: 2044-2055) и Виттке с соавт.(\УШке е! а1., 1. Сйгоша!одг. А, 2003, Уо1, 1013: 173-181). Методика СЕ позволяет определить одновременно в течение короткого периода времени наличие нескольких сотен полипептидных маркеров в образце в малом объеме и с высокой чувствительностью. После измерения образца описывается характер данных полипептидных маркеров с тем, чтобы полученную картину можно было сравнить с эталонными картинами больных или здоровых субъектов. В большинстве случаев достаточно использовать ограниченное число полипептидных маркеров для диагностики ИА8. Наиболее предпочтительным методом является метод СЕ-М8, который включает СЕ, объединенный в формате одного анализа с Ε8Ι-ΤΘΕ М8.

В случае СЕ-М8 предпочтительно использование летучих растворителей и лучше всего проводить работу в практически бессолевых условиях. Примеры таких растворителей включают ацетонитрил, изопропанол, метанол и т.п. Данные растворители могут быть разбавлены водой или слабой кислотой (например, 0,1-1% муравьиной кислотой) для протонирования анализируемого компонента, предпочтительно полипептидов.

При использовании капиллярного электрофореза можно проводить разделение молекул на основе их заряда и размера. Нейтральные частицы будут мигрировать со скоростью электроосмотического потока при подведении электрического тока, при этом движение катионов ускоряется в направлении к катоду, а поток анионов затормаживается. Преимущество капилляров при проведении капиллярного электрофореза заключается в возможности благоприятного соотношения поверхности к объему, что позволяет достичь хорошего рассеяния джоулевской тепловой энергии, генерированной под действием тока. Это, в свою очередь, позволяет использовать высокое напряжение (обычно до 30 кВ) и, соответственно, достичь высокого качества разделения, проводя анализ в течение короткого периода времени.

При проведении капиллярного электрофореза обычно используют капилляры из силикатного стекла, имеющие, в типичном случае, внутренний диаметр от 50 до 75 мкм. Длины используемых капилляров составляют, например, 30-100 см. Следует также отметить, что разделяющие капилляры обычно выполнены из силикатного стекла с пластиковым покрытием. При этом указанные капилляры могут быть также необработанными, то есть могут содержать экспонированные гидрофильные группы на внутренней поверхности или они могут содержать покрытие на внутренней поверхности.

Для улучшения разрешения может использоваться гидрофобное покрытие. В дополнение к подаче напряжения, можно также воздействовать за счет давления, которое в типичном случае варьирует от 0 до 1 фунт/дюйм² (0-5668,92 Па). Давление может быть также применено только при разделении или в ином соответствующем варианте.

В предпочтительном методе измерения полипептидных маркеров указанные маркеры в образце разделяют с помощью капиллярного электрофореза и затем подвергают прямой ионизации и переносят на поточную линию анализа с масс-спектрометром для выявления наличия маркеров.

В рамках методики согласно настоящему изобретению удобно использовать несколько полипептидных маркеров при диагностике СЗ, в частности используют по меньшей мере три полипептидных маркера, например маркеры 1, 2 и 3; 1, 2 и 4; и т. п.

Более предпочтительно использовать 4, 5 или 6 маркеров.

Еще более предпочтительно использовать по меньшей мере 11 маркеров, например маркеры 1-11.

Наиболее предпочтительно использовать все 526 маркеров, указанных в табл. 1.

Для определения вероятности наличия тяжелой формы СЗ при использовании нескольких маркеров применяют статистическое методы анализа, известные специалистам в данной области. Так, например, может быть использован метод Вапбот Еогекб, описанный в Вайссингером с соавт. (^е1881идег е! а1., К1биеу Ιη!. 2004, 65; 2426-2434), с включением в данную методику компьютерной программы, такой как 8-Р1и5, или вспомогательных векторных устройств, описанных в той же публикации.

- 11 014529

Примеры

1. Подготовка образца.

Для выявления полипептидных маркеров с целью диагностики СЗ используют мочу. Мочу собирают от здоровых доноров (контрольная группа), а также от пациентов, имеющих тяжелую форму СЗ.

Для последующих измерений по методу СЕ-М8 разделяют путем ультрафильтрации белки, которые также содержатся в моче пациентов в повышенных концентрациях, такие как альбумин и иммуноглобулины. Для этого смешивают 700 мкл собранной мочи с 700 мкл буфера для фильтрации (2 М мочевины, 10 мМ аммиака, 0,02% ДСН). Указанный образец объемом 1,4 мл подвергают ультрафильтрации (20 кДа, 8айогш5, Сойтдеп, Германия). Ультрафильтрацию проводят со скоростью 3000 об/мин в центрифуге до получения ультрафильтрата объемом 1,1 мл.

Затем полученный фильтрат объемом 1,1 мл наносят на колонку ΡΌ 10 (Атегкйат Вюкшепсе, Иррка1а, Швеция), проводят элюцию с использованием 2,5 мл 0,01% ΝΗ₄ΟΗ и лиофилизируют. Для измерения в рамках методики СЕ-М8 полипептиды снова ресуспендируют в 20 мкл воды (качества для ВЭЖХ, Мегск).

2. Измерение по методу СЕ-М8.

Измерения по методу СЕ-М8 проводят с использованием системы для проведения капиллярного электрофореза от Весктап СоиИег (система Р/АСЕ МЭР: Весктап СоиИег 1пс., Ри11ег1оп, СА. США) и масс-спектрометра Е81-ТОР от компании Вгикег (тюго-ТОР М8, Вгикег Оа11оп1к, Вгетеп, Германия).

СЕ капилляры получают от компании Весктап Соикег, которые характеризуются показателями внутреннего диаметра/наружного диаметра, равными 50/360 мкм, и длиной 90 см. Мобильная фаза для разделения в формате СЕ состоит из 20% ацетонитрила и 0,25% муравьиной кислоты в воде. Для достижения хорошего оболочечного тока при проведении М8 используют 30% изопропанол с 5% муравьиной кислотой со скоростью течения 2 мкл/мин. Объединение СЕ и М8 реализуется в наборе СЕ-Е81-М8 8ргауег (Адйеп! Тесйпо1од1е8, ^аШЬгопп, Германия).

Для инъекции образца подводят давление от 1 до максимум 6 фунт/дюйм² (34013,52 Па) и длительность инъекции составляет 99 с. При соблюдении указанных параметров примерно 150 нл образца инъецируют в капилляр, что соответствует примерно 10% объема капилляра. Используют стекингтехнологию для концентрирования образца в капилляре. Для этого перед инъекцией образца 1М раствор ΝΗ₃ вводят в течение 7 с (под давлением 1 фунт/дюйм² (5668,92 Па)) и после этого инъецируют образец и 2М раствора муравьиной кислоты в течение 5 с. При подведении разделяющего напряжения (30 кВ) анализируемые компоненты автоматически концентрируются между указанными растворами.

Последующее разделение в рамках СЕ проводят с использованием методики подачи варьирующего давления: 40 мин при давлении 0 фунт/дюйм² (0 Па), затем 0,1 фунт/дюйм² (566,892 Па) в течение 2 мин, 0,2 фунт/дюйм² (1133,784 Па) в течение 2 мин, 0,3 фунт/дюйм² (1700,676 Па) в течение 2 мин, 0,4 фунт/дюйм² (2267,5 68 Па) в течение 2 мин и, наконец, 0,5 фунт/дюйм² (2834,46 Па) в течение 32 мин. Общая длительность процесса разделения составляет 80 мин.

Для получения максимально возможной интенсивности сигнала на стороне М8 газ небулайзера доводят до наименьших возможных значений объема. Напряжение, подводимое к распылительной игле для достижения электронапыления, составляет 3700-4100 В. Оставшиеся параметры масс-спектрометра оптимизируют для целей выявления пептидов, в соответствии с инструкциями производителей. Спектры записывают в диапазоне масс, соответствующих показателям т/ζ 400 - т/ζ 3000 и аккумулируют каждые 3 с.

3. Стандарты для проведения измерения СЕ.

Для проверки и стандартизации СЕ измерений используют следующие белки или полипептиды, которые охарактеризованы по указанным показателям времени миграции СЕ:

Белок/полипептид	Время миграции
Апротинин (31дта, Таи£кхгскеп, 0Е, Сад. # ΑΙ 153) Рибонуклеаза (3£дта, Таи£к1гсйеп, ЦЕ, Са£ . # Р4875) Лизоцим (51дта, Таи£к1гсЬеп, ЦЕ, Са£. # Ь7651) «КЕУ», последовательность; КБУ03К16УСК<Э113 «ЕЬМ», последовательность: Ε1,ΜΤ6ΕΕΡΥ3ΗΙΝΝΗ0ζ)ΙΙΓΜν6Ιΐ «ΚΙΝ3ΟΝ», последовательность: ТСЗЬРУЗШСЗНООЫГМУСК «Οίνΐ,Υ», последовательность: О1УЬУЕЬМТ6ЕЬРУ5Н1Ы	9,2 мин. 10.9 мин. 8.9 мин. 15,6 мин. 23,4 мин. 20,0 мин. 36,8 мин.

- 12 014529

Белки/полипептиды используют в концентрации 10 фмоль/мкл, каждый, в воде. КЕУ, ЕЬМ, ΚΙΝΟΟΝ и бГУЬУ представляют собой синтетические пептиды.

Значение молекулярных масс пептидов и показателей т/ζ для определенных заряженных состояний, наблюдаемых при М8, показаны ниже в таблице:

н ( моно )	1,0079	1,0079	1,0079	1,0079	1,0079	1,0079	1,0079
т/ζ	Апротинин	Рибонуклеаза	Лизоцим	К Εν	ΚΙΝΟΟΝ	Еьм	οινιγ
	Моно, масса	Моно, масса	Моно, масса	Моно, масса	Моно, масса	Моно, масса	Моно, масса
0	6513,09	13681,32	14303,88	1732,96	2333,19	2832,41	2048,03
1	6514,0979	13662,328	14304,888	1733,9679	2334,1979	2833,4179	2049,0379
2	3257,5529	6841,6679	7152,9479	867,4879	1167,6029	1417,2129	1025,0229
3	2172,0379	4561,4479	4768,9679	578,6612	778,7379	945,1446	683,6846
4	1629,2604	3421,3379	3576,9779	434,2479	584,3054	709,1104	513,0154
5	1303,6259	2737,2719	2861,7839	347,5999	467,6459	567,4899	410,6139
6	1086,5229	2281,2279	2384,9879	289,8346	389,8729	473,0762	342,3462
7	931,4494	1955,4822	2044,4193	248,5736	334,3208	405,6379	293,5836
8	815,1442	1711,1729	1788,9929	217,6279	292,6567	355,0592	257,0117
9	724,6846	1521,1546	1590,3279	193,559	260,2512	315,7201	228,5668
10	652,3169	1369,1399	1431,3959	174,3039	234,3269	284,2489	205,8109
11	593,107	1244,7643	1301,3606	158,5497	213,1161	258,4997	187,1924
12	543,7654	1141,1179	1192,9979	145,4212	195,4404	237,0421	171,6771
13	502,0148	1053,4171	1101,3063	134,3125	180,4841	218,8856	158,5486

В принципе, для каждого специалиста со средним уровнем знаний в данной области очевидно, что могут иметь место небольшие вариации по времени миграции при разделении методом капиллярного электрофореза. Однако в описанных условиях порядок миграции не меняется. Любой специалист со средним уровнем в данной области, который знает указанные массы и показатели времени СЕ, может без труда сопоставить результаты своих собственных измерений с показателями полипептидных маркеров согласно настоящему изобретению. Так, например, анализ может быть проведен следующим образом: вначале выбирают один из полипептидов, выявленных в данном измерении (пептид 1), и пытаются найти один или несколько вариантов идентичных масс с временным окном, соответствующим указанному времени СЕ (например, ±5 мин). Если найдена только одна идентичная масса в данном интервале, сопоставление заканчивают. Если найдено несколько соответствующих масс, следует сделать более точный выбор по результатам поиска соответствий. Так, выбирают второй пептид (пептид 2) из результатов измерений и пытаются идентифицировать соответствующий полипептидный маркер, снова принимая в расчет соответствующий показатель временного окна.

И вновь, если обнаруживается несколько маркеров соответствующей массы, самым вероятным соответствием будет такое, для которого отмечается по существу линейная зависимость между сдвигом пептида 1 и соответствующим параметром пептида 2.

В зависимости от сложности проблемы сопоставления, можно рекомендовать специалисту в данной области, в необязательном порядке, использовать другие белки из имеющегося образца для сопоставления, например десять белков. В типичном случае показатель времени миграции либо расширяется, либо сокращается на определенные абсолютные величины, либо может иметь место компрессия или расширение всего диапазона. При этом, в таких условиях совместно мигрирующие белки будут продолжать совместно мигрировать.

Кроме того, специалист в данной области может использовать характер миграции, описанный Цюрбигом с соавт. (Ζιιοώίβ с1 а1., Е1сс1гор1югс515 27 (2006), рр. 2111-2125). Если строить график по результатам измерений, где в виде простой диаграммы выражают зависимость показателя т/ζ от времени миграции (например, с использованием программы М8 Ехсе1), можно также выявить линейный характер прямой. И в этом случае возможно простое сопоставление индивидуальных полипептидов путем подсчета числа линий.

Возможны также другие подходы для проведения сопоставления. В основном, специалист в данной области может использовать пептиды, указанные выше, в качестве внутренних стандартов для сопоставления с результатами, полученными при измерении в рамках СЕ методики.

- 13 014529

Список последовательностей <110> МОЗАЮиЕЗ ОГАСМОЗТТС АЙЭ ТНЕНАРЕЦТ1СЗ АС <120> ПОЛИПЕПТИДНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОЦЕНКИ СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ <130 062766^0 <14 0> РСТ/ЕР2006/069096 <141> 2006-11-30 <150> 0Е102005057382.7 <151> 2005-11-30

<160>	4
<170>	РаЬепсЬп ν^Γδίοη 3.3
<210> <211> <212> <213>	1 15 РЕТ Искусственный

<220> <223>

Синтетический пептид

<400>1

Агд С1и. Уа1 С1п Зег Ьуз Не С1у Туг С1у Агд С1п Не Не Зег 15 1015 <210> 2 <211>24 <212> РЯТ <213> Искусственный <220>

<223> Синтетический пептид <400> 2

С1и	Ьеи	Мес	Ткг С1у	С1и	Ьеи Рго Туг	Зег Н1з	Не Азп Азп Агд Азр
1			5			10	15
С1п	Не	Не	РЬе МеС 20	Уа1	С1у Агд

- 14 014529 <210> 3 <211> 21 <212> ΡΗΤ <213> искусственный <220>

<223> Синтетический пептид <400>3

ТЬг С1у Зег Ьеи Рго Туг Зег Нхе Не С1у Зег Агд Азр С1п 11е 11е

1015

РЬе МеЬ Уа1 С1у Агд

<210>	4
<211>	18
<212>
<213>	Искусственный

<220>

<223> Синтетический пептид <400> 4

61у Не Уа1 Ьеи Туг С1и Ьеи МеЬ ТЬг С1у С1и Ьеи Рго Туг 5ег Н1з

5 1015

Не Азп

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ диагностики сосудистых заболеваний (СЗ), включающий стадию определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного полипептидного маркера в образце, где указанный полипептидный маркер выбирают из маркеров 1-526, которые характеризуются следующими значениями молекулярной массы и времени миграции:

   - 15 014529

   Νο. Масса СЕ время Νθ. Масса СЕ врем N0. Масса СЕ время Νο. Масса СЕ время Νο. Масса СЕ время ι 1166,61 23,86 51 11058,16 21,38 101 3984,81 21,29 151 2082.01 33,67 201 1013,41 25,33 2 2431,50 24,10 52 1352,61 29.88 102 4830,78 26.61 152 1768,90 20,77 202 1016,49 25,88 3 1922,93 31,99 53 2602,85 36,35 103 3031,39 35,93 153 3442,09 33,32 203 1493,74 22,06 4 2509,16 25,76 54 4890,68 26,48 104 3788,76 2М1 154 876,42 35,07 204 2104,04 32,97 5 3194,22 30,34 55 5212,06 26,98 155 2352,14 26,74 205 3718,81 32,39 6 1705,60 40,47 56 945,45 25,80 шж 156 937,50 34,12 206 4251,98 28,66 7 1962,95 31,77 57 1065,55 25,50 107 2241,51 24,11 157 1445,72 28,36 207 4538,67 26.20 8 3822,12 24,72 58 1137,58 26,41 108 2461,11 30.84 158 1893,10 28,85 208 2067,93 20,68 9 2212,32 24,94 59 1542,77 23,91 109 1965,98 23,62 159 2839,43 24,14 209 2292,11 27,26 10 3015,78 35,86 60 1693,63 23,47 110 2189,08 27,17 160 1600,76 29,61 210 3702,39 32,39 11 1784,95 20,94 61 3361,42 24,26 111 1127,58 20,82 161 1565,75 26,35 211 965,46 27,84 12 1902,92 31,87 62 3617,74 26,97 112 1400,71 20,35 162 1627,76 29,47 212 2186,07 25,89 13 2329,15 27,17 63 3737,69 37,15 113 1512,75 39,51 163 1812,90 39,98 213 2584,29 35,08 14 2154,05 21,78 64 980,54 22,44 114 1860,53 34,24 164 3137,52 30,29 214 2841,13 24,50 15 2166,03 27,89 65 1221,63 26,82 115 1442,69 27,72 165 1364,67 28.65 215 9866,76 20,85 16 2258,27 21,99 66 2952,27 25,14 118 2590.78 27,96 166 2298,07 33,82 216 1099,53 28,33 17 2573,84 20,49 67 3696,88 26,94 117 1556,72 27,90 167 3017,74 49,66 217 2471,25 34,69 16 1270,75 37,92 6в 5574,46 23,24 118 2309,15 21,95 166 1235,61 26,67 218 3734,85 32,41 19 1611,64 40,12 69 1182.59 28,34 119 2389,33 22,34 169 1741,81 30,21 219 3927,86 33,50 20 1791.87 41.04 70 1963,96 31,76 120 1478,68 39,28 170 1818,90 30,93 220 3163,32 22,10 21 2030,00 25,23 71 682,54 23,81 121 1795.90 24,66 171 1892,95 22,22 221 2339,08 33,95 22 1290,40 30,87 72 4002,72 20,69 122 2211,03 35,06 172 3280,69 22,69 222 2563,76 22,05 23 1441,74 39,13 73 4059,96 20,44 123 1223,63 19,52 173 2656,34 19,50 223 3219,35 35,00 24 2924,25 24,05 74 1186,59 22,31 124 1829,04 21,22 174 1407,71 27,46 224 3359,66 31,84 25 816,41 21,10 75 1825.87 31,80 125 1878,66 30.19 175 1622,79 26,82 225 4097,93 24,59 26 963,52 21,71 76 3401,66 23,42 126 2009,96 32,27 176 1684.76 29,64 226 4654.14 25,81 27 1503,74 29,63 77 1496,75 30.36 127 2110,00 24.10 177 1321,65 28,39 227 1584,77 29.72 28 2849,59 23,02 78 1632,92 31,91 128 1552,79 29,75 178 1350,66 27,13 228 2148,10 25.54 29 3133,20 31,20 79 2281,35 36,34 129 1577,75 40,03 179 1549,76 39,52 229 2639,45 21,33 30 1283,62 27,30 80 2344,34 33,66 130 1936,94 34,71 180 2233,10 22,47 230 3013,27 22.27 31 1495,75 23,31 61 3944,82 24,59 131 2368,13 26,75 181 2679,27 23,48 231 3205,39 19,71 32 1513,70 29,29 62 3002,23 23,80 132 3633,05 33.25 182 1835,79 20,02 232 3831,86 28.39 33 1612,83 23,36 83 3416,77 36,76 133 1510,72 28,30 183 3421,66 25,96 233 1050,52 27,03 34 2319,19 33,80 84 3501,66 31,79 134 1668,87 40,49 184 1708,85 30,44 234 2157,06 22,19 35 2436,23 22,87 85 6783,03 26,61 135 2227,05 33.43 185 1993,96 32,16 235 2407,16 27,65 36 2557,42 28,22 66 14111,27 21,97 136 1495,75 39,41 186 2695,31 23,46 236 2837,93 23,99 37 2626,85 28,00 87 2616,02 28.35 137 1631,77 45.38 187 1204,65 21,93 237 3058,02 30,20 38 2933,46 27,68 88 2810,45 36,73 138 3158,60 29,62 188 1467,86 24,38 238 1658,67 21,53 39 2994,09 29,50 69 2940,95 29,07 139 1522,78 22,76 169 1767,07 24,10 239 3311,32 24,46 40 4101,34 28,51 90 2946,45 34,98 140 1727.67 39,61 190 8176,30 19,57 240 3555,63 23,64 41 935.49 23,69 91 1494,72 30,40 141 1883,94 40,14 191 1143,56 36,97 241 1085,50 21,70 42 1521,75 30,42 92 1080,53 27,86 142 1460,71 19.83 192 1834,90 31,05 242 1199,63 21,91 43 1669,79 21,48 93 2349,14 27,36 143 1805,88 29,92 193 2025,95 32,21 243 1247,58 22,00 44 2758,37 28.94 91 3303,00 23.07 144 1898,93 40,30 194 3489,70 31,45 244 1608,76 22,36 45 3548,94 26,22 96 4081,56 24,51 145 2237,06 27.12 195 1268,62 27,29 245 2501,20 34,30 46 3609,63 20,22 96 4670,27 25,84 146 3178,33 30,26 196 1659,82 29,35 246 3021,52 23,52 47 3697,49 23,71 97 4671,99 23.33 147 1844,56 34,28 197 2405,59 22,16 247 4153,75 33,41 48 ¢278,73 23,34 98 8933,94 22,57 148 1378,57 37,16 198 2483,21 27,54 248 5000,17 24,43 49 4421,04 20,73 99 1523,90 29,72 149 1764,88 29,88 199 2599,21 26,20 249 8917,46 22,53 50 4805,67 26,49 100 3956,82 25,20 150 1791,88 30,77 200 4170,01 33,51 250 1750,86 23,80

   - 16 014529

   251 2235,13 34,10 301 1649,79 19,59 351 2073,17 27,43 401 1749,88 30,54 252 2644,25 21,13 302 4025,68 20,73 352 7958,65 34,32 402 1956,97 21,44 253 3943,96 33,53 303 980,33 35,59 353 1837,88 30,54 403 2189,12 26,54 254 11967,96 20,50 304 1096,41 35,95 354 2939,03 33,75 404 2257.63 36.10 255 2553,23 34,14 305 1698,65 37,60 355 2977,31 19,59 405 2917,54 28,99 256 1209,58 26,31 306 2361,21 20,77 356 3596,46 21,54 406 3633,69 26,99 257 1399,94 21,41 307 3148,50 24,22 357 3851,68 24,97 407 6055,77 21,03 258 1680,00 23,77 308 3157,23 34.74 358 1135,52 27,83 408 6186,02 24,99 259 2195,06 20,15 309 1304,59 27,95 359 3378,05 38,81 409 1858,92 24,17 260 3064,41 20.55 310 3575,78 32,27 360 3590,72 28,99 410 2274,11 33,47 261 3554,07 31,11 311 1510,75 20,12 361 3959,80 19,95 411 4522,51 26,20 262 3686,03 22,16 312 2485,20 34,25 362 1258,41 36,10 412 6237,35 31,39 263 3802,12 33,10 313 3076,33 19,64 363 1513,50 36,82 413 9883,82 20,84 264 4048,05 25,42 314 3343,39 31,80 364 1716,38 20,59 ЭД ’· 3385,59 25,47 265 2300,16 36,48 315 1405,71 20,16 365 2022,97 33,38 1=...¹½ =; 3745,55 26,65 266 1352,83 24,38 316 2587,16 21,07 366 2914,54 24,29 ./Ж 1408,72 39,13 267 1638,80 20,26 317 5213,25 22,47 367 5527,56 27,58 2551,32 34,75 268 2864,18 20,19 318 2320,16 20,73 368 931,51 20,00 /Ж? 3265,33 36,02 269 3754,66 37,16 319 4491,39 2623 369 973,26 35,59 ==Ж= 2739,25 28,4 270 4185,91 33,47 320 10199,91 21,11 370 1385,67 27,92 • -40-.,= 2065 24.48 271 858,42 23,26 321 854,38 34,92 371 2272,31 23,80 ; 4ГГ 2264,12 22,67 272 1159,64 26,05 322 1084,56 36,85 372 4024,87 33,20 1058,53 24,94 273 1407,71 37,25 323 1814,78 3729 373 2216,11 33,79 ...:423 4467,94 29,05 274 1439,72 29,62 324 2078,05 22,47 374 2756,23 35,16 ж.' 2887,42 35,66 275 1720,76 19,72 325 2175,08 3326 375 2777,71 21,55 . :4:25-- 1635,84 40,33 276 1846,93 32,04 326 2411,78 26,97 376 3521,02 30,73 2525,21 27,72 277 3177,14 22,48 327 3738,59 24,76 377 3750,72 32,45 1526,75 23,63 278 4113,80 24,58 328 3935,57 34,15 378 4229,09 29,08 1664,82 29,87 279 2744,07 35,03 329 4863,21 26,66 379 4846,50 26,40 эд. 2583,33 28,31 280 2767,26 21,52 330 860,39 26,25 380 1046,55 25,35 юЖ·'·’ 2663,27 23,44 281 1310,64 27,11 331 1567,78 2023 381 1608,80 30,94 ! 1878,87 42,18 282 1613,88 23,95 332 2308,11 27,32 382 1878,78 31,5В ЭД · 1462,67 39,31 283 1703,90 33,64 333 2923,77 36,44 363 2589,16 22,45 1834,92 24 284 2761,40 21,46 334 3295,55 25,40 364 4369,06 20,25 -Ж- 1893,06 24,64 285 3242,42 22,78 335 3870,85 33,39 385 12717,08 26,92 435 1933,95 21,63 286 3338,17 23,36 336 1099,56 21,63 366 1210,43 36,48 -.Ж··· 1367.7 38,87 287 3371,74 22,96 337 1359,70 22,92 387 3092,54 36,22 н ж · 1009,49 27,33 288 3593,53 20,25 338 2059,02 23,12 388 3248,61 25,65 ,м, 3405,09 25,92 289 3877,52 24,49 339 2077,03 21,78 389 4012,41 20,81 2314,1 33,67 290 1624,80 30,81 340 3349,34 35,81 390 11016,34 21,31 3996,84 20,93 291 2210,92 37,55 341 8853,85 21,08 391 1284,61 29,17 .== =441¹. 2823,6 29,07 292 3290,37 24,12 342 1734,80 2024 392 1460,83 22,53 ...ЭД? 1179,57 27,15 293 4413,76 29,03 343 1847.95 43,93 393 1807,88 23,98 ЭД·.^: 1435,72 28,86 294 1482,73 22,47 344 2045,95 34,04 394 2596,33 34,86 2430,72 35,39 295 1813,78 31,87 345 2289,47 33,56 395 2686,97 29,06 .' 44$·... 1134,63 23,68 296 1934,87 20,04 346 2421,15 34,74 396 3871,59 27,51 2013,98 25,18 297 2249,89 34,14 347 2480,67 23,00 397 4069,63 25,30 ... ЭД- 2577.29 24,55 298 3280,59 25,76 348 2576,25 34,17 398 4288,98 25,94 ЭД' 1194,6 26,73 299 1098,56 21,46 349 3353,93 23,53 399 4426,21 20,09 -ЭД?? 1588,77 30,2 300 1125,58 21,76 350 1083,52 26,24 400 1071,55 21,41 :/ЭД-·· 2056,02 25,44

   - 17 014529

   2442,16 34,11 1173,58 37,51 1422,66 21,72 1100,55 36,99 1623,6 24,15 1128,44 33,71 ¹ 4&4 ' 1624,61 37,73 3149,6 31,22 :............. 3298,48 36,06 1068,56 21,69 ......: 1016,31 35,67 1349,48 36,47 1580,94 24,31 1689,81 40,57 1157,58 37,41 ВВЙЖжй: 2305,7 34,8 Ж' >. 1250,61 27,94 ' ‘Ж ¹. 840,44 23,94 1378,67 28,85 911,3 34,39 ОтоЗЖтТ 1392,68 21,75 1299,64 22,42 ХЙЖ» 1409.64 22,06 911,47 25,92 1425,65 22,34 1025,51 25,44 1451,71 29,19 3400,07 42,03.. 465 1576.66 26,5 йОЙЖй®?: 1901,89 43,92 1651,85 40,6 1110,42 34,37 1876,94 22,29 1032,5 25,89 1911,12 24,98 1040,52 25,11 ’У’ДЖ;·.^ 2064,01 21,95 жк 1265,64 27,14 2150,04 27,76 1171,55 29,24 2751,59 29,16 1012,53 35,08 4289,94 28,69 1286,49 36,78 4306,05 28,78 2932,36 34,11 ММ 4800,18 23,83 1215,49 27,61 1111,32 35,47 : 525 1423,68 21,47 Χ^:««δίίίΤ 1181,49 36,79 1487,71 29,58 ив 3168,38 24,69 1229,57 36,29 ШМ 1579,78 29,83 1680,82 30,02 ^:*;Ж:Жк 1725,66 38,3 вйв 5228,15 27,04 янв 1769,78 28,25 1114,54 25,52 Ж&ЙЙ^Й 1390,5 37,05 2046,99 32,56 :ЖЙЖ»Ж 2899,33 49,62 1096,53 26,12 ‘’Ж · 1257,49 34,26 868,45 23,35 1160,43 35,6 1539,8 40,36 ......Ж........ 3318,91 36,01 : -Ж 1084,48 25,31 1388,39 58,99 ТГЖлТ 3129,86 35,93 1255,56 36,33 1383,69 39,02 1561,75 40,72 »:;ЖО' 3108,55 31,25
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что оценку устанавливаемого наличия или отсутствия маркеров 1-106 проводят с помощью следующих эталонных значений:

   - 18 014529

   Νο. Встречаемости, контроль Встречаемость, СТО Νο. Встречаемость, контроль Встречаемость, I суо 1 1 0,01 0,58 54 0,52 0,08 2 0,18 0,75 55 0,59 0,17 3 0,14 0,67 56 0,65 0,21 4 0,25 0,75 57 0,48 0,04 5 0,08 0,58 58 0,57 0,13 6 0,05 0,54 59 0,56 0,13 7 0,36 0,83 60 0,44 0,00 8 0,31 0,79 61 0,57 0,13 9 0,26 0,71 62 0,44 0,00 10 0,14 0,58 63 0,73 0,29 11 0,06 0,50 64 0,53 0,08 12 0,15 0,58 65 0,50 0,04 13 0,31 0,75 66 0,49 0,04 14 0,32 0,75 67 0,70 0,25 15 0,12 0,54 68 0,91 0,46 16 0,03 0,46 69 0,71 0,25 17 0,25 0,67 70 0,63 0,17 18 0,18 0,58 71 0,47 0,00 19 0,47 0,88 72 0,81 0.33 20 0,18 0,58 73 0,59 0,13 21 0,09 0.50 74 0,90 0,42 22 0,27 0,67 75 0,77 0,29 23 0,18 0,58 76 0,94 0,46 24 0,10 0,50 77 0,69 0,21 25 0,44 0,04 78 0,49 0,00 26 0,44 0,04 79 0,66 0,17 27 0,44 0,04 00 0,53 0,04 28 0,48 0,08 81 0,53 0,04 29 0,74 0,33 82 0,67 0,17 30 0,62 0,21 83 0,50 0,00 31 0,45 0,04 84 0,50 0,00 32 0,41 0.00 85 0,62 0,13 33 0,62 0,21 86 0,88 0,38 34 0,74 0,33 87 0,63 0,13 35 0,41 0,00 88 0,55 0,04 36 0,78 0.38 89 0,52 0.00 37 0,45 0,04 90 0,61 0.08 38 0,70 0,29 91 0,91 0,38 39 0,78 0,38 92 0,75 0,21 40 0,41 0,00 93 0,67 0,13 41 0,67 0,25 94 0,73 0,17 42 0,59 0.17 95 0,60 0,04 43 0,67 0.25 96 0,69 0,13 44 0,54 0,13 . 9? . . 0,85 0,29 45 0,63 0,21 98 0,60 0.04 46 0,42 0.00 99 0,70 0,13 47 0,80 0,38 100 0,71 0,13 48 0,54 0,13 101 0,58 0,00 49 0,42 0,00 102 0.59 0,00 50 0,58 0,17 103 0,80 0,17 51 0,42 0,00 104 0,77 0,08 52 0,72 0,29 А'-Л-одае. ν. 53 0,52 0,08 ТУШ·.·:
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что оценку амплитуды маркеров 107-413 проводят с помощью следующих эталонных значений:

   - 19 014529

   Νο. Средо амйймдо, кифолывя футта гррзСУО N0. Средек аыгигтуда, кочтролывягругле Средчяйаыгтудз, грута СУО Ко. Средой жтатуда. шнгршдоягррти Срмняяжпмиаа. грциге СУО 107 94 253 157 100 202 207 220 44 108 116 233 158 189 513 208 1195 546 109 50 123 159 1054 486 209 3909 1825 110 766 1878 160 161 412 210 406 167 111 45 175 161 123 456 211 149 58 112 89 419 162 229 517 212 1098 2400 113 69 146 163 273 554 213 769 164 114 174 418 164 196 517 214 527 1675 115 78 689 165 197 97 215 1173 416 116 47 99 166 176 506 216 711 324 117 59 183 167 1480 686 217 470 181 118 120 357 168 3107 880 218 723 333 119 317 2460 169 80 216 219 213 102 120 121 463 170 203 1328 220 345 169 121 172 380 171 344 848 221 677 334 122 796 1674 172 797 206 222 2489 744 123 167 888 173 1146 2842 223 132 63 124 1703 636 174 224 568 224 1451 717 125 768 3651 175 138 450 225 1324 299 126 340 1283 176 258 525 226 1689 741 127 193 583 177 15571 7296 227 88 238 128 135 320 178 367 745 228 191 701 129 243 566 179 185 575 229 361 118 130 95 214 180 260 130 230 5095 1789 131 161 768 181 1492 3433 231 601 241 132 118 299 182 784 351 232 1200 403 133 116 267 183 1158 2826 233 736 245 134 840 1950 184 919 371 234 1171 297 135 102 288 185 156 466 235 678 263 136 127 283 186 1694 4348 236 1597 482 137 5726 12044 187 201 66 237 115 353 138 203 728 188 1787 737 238 392 146 139 506 154 189 2610 6060 239 120 265 140 113 289 190 1703 766 240 1127 465 141 150 301 191 461 1095 241 623 140 142 136 290 192 707 6865 242 250 115 143 51 189 193 493 1490 243 633 306 144 168 343 194 346 799 244 224 81 145 196 769 195 3338 9120 245 120 60 146 119 250 196 240 654 246 1275 438 147 161 358 197 80 203 247 283 89 148 227 58 198 490 236 248 1514 737 149 130 289 199 259 533 249 264 91 150 97 196 200 1142 421 250 900 278 151 192 504 201 1241 2506 251 776 338 152 301 123 202 1511 749 252 411 97 153 442 108 203 294 107 253 227 103 154 154 1119 204 1090 2230 254 186 53 155 197 725 205 1151 456 255 890 332 158 82 201 206 983 475 256 469 1170

   - 20 014529

   257 152 70 307 97 39 357 789 179 258 21200 7156 эоа 48 104 358 263 104 25Э 282 115 309 176 375 359 134 84 2® 474 152 310 87 185 360 206 52 261 117 274 311 187 91 361 755 287 262 1359 517 312 143 43 362 246 26 263 421 195 313 381 143 363 316 106 264 183 83 314 402 194 364 1329 142 265 151 64 315 237 113 365 122 23 266 206 99 316 519 207 366 105 46 2® 588 256 317 115 56 367 311 127 268 304 119 318 197 61 368 131 56 269 147 61 319 254 1335 369 206 38 270 172 66 320 283 140 370 104 41 271 338 157 321 68 201 371 126 43 272 292 138 322 119 56 372 345 110 273 227 110 323 129 46 373 416 151 274 142 367 324 125 50 374 209 86 275 166 79 325 3240 7677 375 268 54 276 179 385 326 114 51 376 549 188 277 200 75 327 236 89 377 115 36 276 211 81 328 163 79 378 353 110 279 1® 68 329 702 204 379 379 135 2® 359 157 330 481 159 380 503 52 261 141 284 331 407 175 381 753 360 232 244 104 332 228 79 382 335 2617 283 882 331 333 200 98 383 97 31 284 903 324 334 356 60 364 1280 178 265 231 98 335 752 72 385 438 64 266 1420 457 336 178 64 386 374 92 287 2096 591 337 281 50 387 329 109 288 676 261 338 293 104 388 283 124 289 470 234 339 796 299 389 273 36 290 169 49 340 174 63 390 3045 864 291 234 517 341 1025 194 391 51 25 292 624 309 342 209 95 392 711 69 293 279 111 343 407 145 398 187 82 294 444 130 344 144 462 394 74 29 295 752 1640 345 182 74 395 197 61 296 543 191 346 90 42 396 320 100 297 164 66 347 16 397 712 156 298 7® 274 348 150 36 398 167 48 299 79 349 256 96 399 337 7 300 234 99 350 130 51 400 133 59 301 179 46 351 96 46 401 297 110 302 зео 141 352 330 157 402 164 55 зсз 106 37 353 248 107 468 876 4574 304 146 47 354 205 69 404 820 309 305 730 323 355 310 36 405 6« 288 306 373 40 356 411 139 406 475 119 Мп Средняя аыплтуда, Средняя амплитуда, контрольная группа группа СИ) 407 275 91 408 1590 291 409 1343 334 410 180 61 411 149 13 412 29В 135 413 469 42

   а для маркеров 414-526 ее проводят с помощью следующих эталонных значений:

   - 21 014529

   N0. Средняя амплитуда, крнтдолъдея групп» Средняя амплитуда, фуппэ СУО Νο. Средняя аиипчтуда, контрольная группа Средняя амплитуда группа СТО 414 3214 2678 471 358 423 415 514 250 472 3360 3317 416 1359 615 473 4000 2575 417 581 174 474 1388 2785 416 630 499 475 335 3122 419 212 141 476 302 237 420 681 381 477 351 847 421 445 227 478 186 145 422 1178 103 479 3094 2397 423 540 348 480 4737 2446 424 188 206 481 1468 2644 425 1540 687 482 566 974 426 569 914 483 535 429 427 301 106 484 2818 4530 428 976 511 485 17423 37226 429 972 515 486 3087 1793 430 1320 729 487 25 319 431 278 210 488 3397 6633 432 1682 1196 489 2904 6138 433 589 287 490 239 198 434 384 502 491 1794 3083 435 1006 399 492 2558 1701 436 1064 800 493 428 419 437 270 216 494 1326 2891 438 3453 2235 495 181 788 439 837 790 496 212 207 440 1353 684 497 741 600 441 710 733 498 135 197 442 809 627 499 4632 4647 443 8328 3904 500 331 461 444 596 661 501 302 414 445 380 593 502 206 306 446 2389 1375 503 1521 3346 447 297 285 504 349 561 448 4154 2314 505 211 315 449 532 953 506 208 247 450 1145 733 507 1270 1039 451 744 845 508 305 334 452 2878 2433 509 213 266 453 8725 4307 510 2436 3827 454 1109 1620 511 460 294 455 750 409 512 389 924 456 687 971 513 197 273 457 2155 1229 514 152 448 458 1622 1964 515 743 575 459 50512 45582 516 428 713 460 2259 2915 517 186 298 481 4142 4664 518 219 296 462 6265 8932 519 4218 7618 463 1969 2931 520 75 148 464 36818 19376 521 96 214 465 1352 1591 522 56 92 466 5789 1562 523 208 316 467 2562 1358 524 349 729 468 91735 90455 525 543 1220 469 7723 4053 526 388 684 470 2496 1342
4. 4. Способ по п.1, где используют по меньшей мере два, или по меньшей мере три, или по меньшей мере пять или шесть, или по меньшей мере десять, или все полипептидные маркеры, определенные в п.1.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где указанный образец, взятый у субъекта, представляет собой образец мочи или образец крови (образец сыворотки или плазмы крови).
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где используют капиллярный электрофорез, ВЭЖХ, ионную спектрометрию и/или масс-спектрометрию в газовой фазе для выявления наличия или отсутствия указанного полипептидного маркера или маркеров.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, где капиллярный электрофорез проводят перед измерением молекулярной массы указанных полипептидных маркеров.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, где масс-спектрометрию используют для выявления наличия или отсутствия указанного полипептидного маркера или маркеров.

   - 22 014529
9. 9. Применение по меньшей мере одного полипептидного маркера, выбранного из маркеров 1-526, который характеризуется значениями молекулярной массы и времени миграции по п.1, для диагностики сосудистых заболеваний.
10. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что время СЕ определяют с помощью стеклянного капилляра длиной 90 см, имеющего внутренний диаметр (в/д) 50 мкм, при напряжении 25 кВ, где в качестве растворителя мобильной фазы используют 20% ацетонитрил, 0,25М муравьиную кислоту в воде.
11. 11. Способ диагностики сосудистых заболеваний (СЗ), включающий стадии:

    a) разделения образца по меньшей мере на три, предпочтительно 10, подобразцов;

    b) анализа по меньшей мере двух подобразцов для определения наличия или отсутствия амплитуды по меньшей мере одного полипептидного маркера в образце, где указанный полипептидный маркер выбирают из маркеров 1-526, которые характеризуются значениями молекулярной массы и времени миграции (времени СЕ) по п.1.
12. 12. Способ по п.11, где проводят измерение по меньшей мере 10 подобразцов.
13. 13. Способ по меньшей мере по одному из пп.1-8 и 11, 12, отличающийся тем, что время СЕ определяют с помощью стеклянного капилляра длиной 90 см, имеющего внутренний диаметр (в/д) 50 мкм, при напряжении 25 кВ, где в качестве растворителя мобильной фазы используют 20% ацетонитрил, 0,25М муравьиную кислоту в воде.
14. 14. Комбинация маркеров, включающая по меньшей мере 10 маркеров, выбранных из маркеров 1526, которые характеризуются значениями молекулярной массы и времени миграции (времени СЕ) по п.1.

    Евразийская патентная организация, ЕАПВ

    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2