JP5165580B2 - 血管疾患の診断および評価のためのポリペプチドマーカー - Google Patents

Description

本発明は、血管疾患（ＶＤ）の重症度の診断および評価のための、対象からの試料中の１つ以上のペプチドマーカーの有無の使用、およびペプチドマーカーの有無がＶＤの重症度を示すこのような血管疾患の診断および評価のための方法に関する。

血管疾患は、生物の血管および結果的に心臓、脳、腎臓などのような器官を冒す疾患である。これらは、例えば、動脈硬化、循環障害、高血圧および不整脈を含む。

血管：
動脈硬化は、血管沈着物による動脈の硬化を指す。コレステロール結晶の沈着物は、炎症性病巣（アテローム）の形成をもたらし、そこには血液成分、脂質、代謝スラグおよび石灰塩が沈殿しがちである。二次元の硬化症であるいわゆるプラークが形成され、これにより血管壁はより固く、より狭くなる。動脈は、弾性を失い、この仕事、すなわち、体の個々の領域への心臓からの血液の輸送の遂行が困難である。二次疾患は、例えば、狭心症、心筋梗塞、循環虚脱、脳卒中を含む。循環障害はたいてい、体の下部、腹部大動脈から足動脈までを冒し、ならびに筋肉組織への血流および酸素供給の減少をもたらし、次第に壊死性になる。最終段階では、潰瘍が生じ、切断手術が不可避になる程度まで血管を閉塞する。高血圧には明確な原因がなく、例えば、薬剤の摂取または副腎ホルモンの過剰分泌は、血圧を急増させることがある。高血圧は、永続的ストレスでも見られ、これは血管痙攣に帰着する。高血圧は血管壁を損傷するため、裂傷または閉塞の危険がある。心臓拍動の規則性が乱されるならば、この状態は不整脈と呼ばれる。心臓拍動は、速過ぎる（頻脈）、遅過ぎる（徐脈）、または不規則である（不整脈）のいずれかであり得る。血管疾患は、不健康な、ならびに不自然な生活行動によっても起こるので、予防により避けることができる。生活様式の徹底的転換によって、初期段階の動脈硬化は、例えば、血圧ならびに血液脂質量を低下させることによって避けることができる。血管疾患の進行は、医薬治療（例えば、アセチルサリチル酸、β受容体遮断薬、ＡＣＥ阻害剤など）によりさらに遅らせることができる。しかし、損傷した血管は修復できないこと、および悪化した段階での過程は不可逆であることに注意するべきである。従って、血管疾患の早期発見は特に重要である。

心臓：
冠動脈心疾患では、ＶＤの診断は、危険因子の評価により、ならびに血圧、休息時および運動負荷心電図の測定、および脂質状態（ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド）、空腹時血糖値および、必要であれば、ＨｂＡ１ｃを定量するための血液像のような非侵襲性の検査により、まず間接的に行われる。このような検査がハイリスク特徴の存在を生じ、すなわち重度血管事象（死亡、心筋梗塞）が近い将来に予想される場合、より正確な診断が、侵襲的診断学により、例えばカテーテル検査または冠動脈造影の形で行われる。このようにして、心臓および冠動脈血管および他の血管は、カテーテルにより、またはＸ線法で検査される。Ｘ線造影剤は、Ｘ線画像上での心臓および血管のよりよい視覚化のために使用される。障害または疾患のために非侵襲的検査が可能でない患者、および冠動脈心疾患の疑いを確実に排除することが、仕事関係の理由で不可欠な患者（例えばパイロット、消防士）に、非侵襲的診断学が信頼できる結果を提供できなかった場合に、冠動脈造影の表示は、低または中程度の予備検査的確率を含む。しかし、冠動脈造影は、上記の予備検査に加えて、甲状腺機能亢進症または造影剤に対するアレルギーのような様々な合併症が排除される場合に限り実施できる。加えて、造影剤は腎臓を通って分泌されるので、十分な腎機能が確保されなければならず、または透析依存対象については、検査に引き続き常に透析を実施しなければならない。従って、血管疾患の早期で信頼できる診断が非侵襲的にできることの必要性が明らかになる。

腎臓：
腎臓の血管疾患は、
・腎動脈狭窄
・腎動脈血栓症
・腎動脈塞栓症
・腎静脈血栓症
を含む。

腎動脈狭窄は、腎動脈またはこの主要分枝の片側または両側狭窄である。これは動脈高血圧の原因となることもあり、従って腎血管性高血圧と呼ばれる。

この原因は、症例の約７０％で動脈硬化（圧倒的に高齢者で）、および症例の約２０％で線維筋性形成異常（結合組織の異常）である。まれに、大動脈または腎動脈の動脈瘤、脈管炎、腫瘍または嚢腫による機械的圧迫、塞栓症または血栓症が原因になる。

腎動脈の狭窄は、冒された腎臓を通る血流の減少をもたらす。血圧の推定される（局所的）低下を補うため、腎臓はレニンの産生を亢進し、これは、アンギオテンシン・アルドステロン機構を通じて体全体の血液量の増加および血圧の上昇、したがって動脈高血圧をもたらす。従って、腎動脈狭窄は、すでに高血圧の状態のときにたいてい発見されるが、全高血圧の約１から２％のみがこれに起因する。

治療に関して、様々な可能性がある。
ＰＴＡ（経皮経管的カテーテル血管形成術）：挿入バルーンカテーテルによる狭窄の拡張（バルーン拡張）
・ステント：血管を開いたままにする金網（ステント）の挿入；
・狭窄の外科的除去。

腎動脈血栓症のよくある原因は、例えば、心房細動中の心臓由来の塞栓症であり、横腹の痛み、タンパク尿、非常に高いＬＤＨのような症状を伴う。横腹の痛みは、腎静脈血栓症でも観察されるが、加えて、タンパク尿および、症例によっては、血尿またはネフローゼ症候群が観察される。

脳：
脳領域の狭窄血管は、酸素供給の減少をもたらし、（例えば、動脈硬化からの変化よる急性凝血により）動脈がふさがれると、知覚の消失、麻痺、言語障害などとともに、脳卒中が起こる。大動脈におけるような脳動脈では、動脈硬化が、まれな症例で、血管壁の動脈瘤をもたらすことがあり、また高血圧のような危険因子とともに、血管壁が裂け、致命的な内出血を起すこともある。

驚くべきことに、対象からの尿試料中の特定のペプチドマーカーが、ＶＤの診断、したがって医薬治療が必要かどうかを決めるために、使用され得ることが見出された。

本発明は、血管疾患の診断のための、対象からの尿試料中の、少なくとも１つのペプチドマーカー、理想的には幾つかのポリペプチドマーカーの有無の使用に関連し、前記ポリペプチドマーカーは、表１に明示されるような分子質量および移動時間により特徴づけられる、ポリペプチドマーカー番号１から番号５２６から選択される。

好ましくは、マーカー１から１０４および／または１０７から４１３が用いられる。

本発明により、ＶＤの重症度を決定することも可能である。本情報は、どんな治療手段を採用するかを決めるのに役立つ。

移動時間は、例えば、実施例第２項に説明されているように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により測定される。例えば、７５μｍの内径（ＩＤ）および３６０μｍの外径（ＯＤ）を有する長さ９０ｃｍのガラス毛細管を電圧３０ｋＶで作動する。試料用の溶媒として、３０％メタノール、０．５％ギ酸の水溶液を使用する。

ＣＥ移動時間は変わることもあることが知られている。しかし、ポリペプチドマーカーが溶出される順序は、使用されるどのＣＥ系についても一般的には同じである。移動時間の差を釣り合わせるために、移動時間がわかっている標準物質を用いて系を正規化することが可能である。これらの標準物質は、例えば、実施例（実施例第３項を参照）に明示されているポリペプチドであってもよい。

表１から３に示されるポリペプチドマーカーの特徴づけは、例えば、Ｎｅｕｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１４９−１５６）により詳細に記述されている方法、すなわち、キャピラリー電気泳動／質量分析（ＣＥ−ＭＳ）により決定された。個々の測定間の、または異なる質量分析計間の分子質量の変動は、比較的小さく、典型的には±０．１％の範囲内、好ましくは±０．０５％の範囲内、より好ましくは±０．０３％の範囲内、なお一層好ましくは±０．０１％の範囲内である。

本発明に従うポリペプチドマーカーは、タンパク質またはペプチドまたはタンパク質またはペプチドの分解生成物である。これらは、例えば、糖鎖形成、リン酸化、アルキル化またはジスルフィド架橋のような翻訳後修飾により、もしくは、例えば、分解の範囲内の他の反応により、化学的に修飾されてもよい。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製の範囲内で、化学的に変えられる、例えば、酸化されてもよい。

ポリペプチドマーカーを決めるパラメーター（分子重量および移動時間）から進んで、先行技術で知られる方法により、該当するポリペプチドの配列を同定することは可能である。

本発明に従うポリペプチド（表１から４を参照）は、ＶＤの重症度を診断するために使用される。「診断」は、症状または現象を疾患または障害に当てはめることによる、知識獲得の過程を意味する。本症例の場合、ＶＤの重症度は、特定のポリペプチドマーカーの有無から結論される。したがって、本発明に従うポリペプチドマーカーは対象からの試料で定量され、この有無がＶＤの重症度を結論することを可能にする。ポリペプチドマーカーの有無は、先行技術で知られる任意の方法により測定され得る。既知であり得る方法を以下に例示する。

ポリペプチドマーカーは、この測定値がこの閾値と少なくとも同じ高さであれば、存在すると考えられる。測定値がより低ければ、この場合、前記ポリペプチドマーカーは存在しないと考えられる。閾値は、測定方法の感度（検出限界）によるか、または実験に基づいて決めることも可能である。

本発明において、好ましくはある分子質量についての試料の測定値が空試料（例えば、緩衝液または溶媒のみ）の値の少なくとも２倍であれば、閾値を超えていると考えられる。

ポリペプチドマーカーは、これの／これらの有無が測定され、その有無がＶＤの重症度を示す（頻度マーカー）ような仕方で使用される。ＶＤを有する対象には典型的に存在するが、ＶＤをもたない対象には頻繁には存在しないか、欠けているポリペプチドマーカー、例えば、１−２４（表２）がある。さらに、ポリペプチドマーカー番号２５から１０６のように、ＶＤを有する患者には存在するが、ＶＤをもたない患者には頻繁には存在しないか、全く存在しないポリペプチドマーカーがある。

頻度マーカー（有無の決定）に加えて、または代わりに、表３に明示するような振幅マーカーもＶＤの診断に用いることが可能である（番号１０７から５２６）。振幅マーカーは、有無が決定的でないが、シグナルが両群に存在するならば、シグナルの高さ（振幅）が結論づけるという仕方で使用される。表３および４に、（質量および移動時間により特徴づけられた）相当シグナルで、測定された全試料について平均されたものの平均振幅が明示されている。別々に濃縮された試料または異なる測定法の間の比較性を達成するために２つの正規化法が可能である。第１の方法では、１つの試料の全ペプチドシグナルを総振幅１００万カウントに正規化する。従って、個々のマーカーのそれぞれの平均振幅は、１００万分の１（ｐｐｍ）として明示される。本法により得られた振幅マーカーを表３に示す（番号１０７−４１３）。

さらに、別の正規化法によりさらなる振幅マーカーを規定することも可能である。この場合、１つの試料の全ペプチドシグナルを、共通の正規化係数で量る。したがって、個々の試料のペプチド振幅およびすべての既知ポリペプチドの基準値の間に線形回帰が形成される。この回帰直線の勾配は、ちょうど、相対的濃度に相当し、本試料の正規化係数として使用される。本正規化法により得られたバイオマーカーを表４に示す（番号４１４−５２６）。

信頼性のある平均振幅を得るために、用いられるすべての群は、少なくとも２０の個別の患者または対照の試料からなる。診断の決定（（ＶＤまたは非ＶＤ）は、患者試料中のそれぞれのポリペプチドマーカーの振幅が、対照群またはＶＤ群の平均振幅と比較して、どれだけ高いかの関数としてなされる。振幅がＶＤ群の平均振幅にむしろ該当するのであれば、血管疾患の存在が考えられることになり、および対照群の平均振幅にむしろ該当するのであれば、ＶＤの非存在が考えられる。測定値と平均振幅との隔たりは、試料が一定の群へ属する確率と考えることができる。例示的な説明は、マーカー番号１３７により与えられる（表３）。前記マーカーの平均振幅は、ＶＤで有意に増加している（対照群の５７２６ｐｐｍに対して１２０４４ｐｐｍ）。さて、患者試料におけるこのマーカーの値が０から５７２６ｐｐｍである、または最高２０％までこの範囲を超える、すなわち０から６８７１ｐｐｍであるならば、この試料は対照群に属する。この値が１２０４４ｐｐｍまたはそれより２０％まで低いか、もしくはそれより高い、すなわち９６３５と非常に高い値との間であれば、これは血管疾患の徴候と考えるべきである。

または、測定値と平均振幅との間の隔たりは、試料が一定の群へ属する確率と考えてもよい。

頻度マーカーは、一部の試料で振幅が低い振幅マーカーの変異型である。検出限界とほぼ同程度の非常に小さい振幅を有し、振幅の計算にマーカーが見いだせない該当試料を含めることにより、振幅マーカーへこのような頻度マーカーを変換することが可能である。

１つ以上のポリペプチドマーカーの有無が決定される試料を得る対象は、ＶＤに罹ることが可能な任意の対象であってもよい。好ましくは、対象は哺乳動物であり、最も好ましくは、これはヒトである。

本発明の好ましい実施形態では、たった１つのポリペプチドマーカーではなく、ポリペプチドマーカーの組合せを使用して、ＶＤの重症度を決めるが、ＶＤの重症度はこれらの有無から結論することが可能である。複数のポリペプチドマーカーを比較することにより、疾病または対照個人における典型的存在確率からの少数の個人偏差に由来する総合結果の偏りを、減らすまたは避けることも可能である。

本発明に従いペプチドマーカーの有無が測定される試料は、対象の体から得られる任意の試料であってもよい。試料は、対象の状態に関する情報（ＶＤまたはそうでない）を提供するのに適したポリペプチド組成物を有する試料である。例えば、これは、血液、尿、滑液、組織液、体分泌物、汗、脳脊髄液、リンパ、腸、胃または膵臓の汁、胆汁、涙液、組織試料、精液、膣液または糞便試料であってもよい。好ましくは、これは液体試料である。

好ましい実施形態では、試料は尿試料または血液試料であり、ここで血液試料は血清または血漿試料であってもよい。

尿試料は、先行技術で好まれているように採取することが可能である。好ましくは、中流尿試料が、本発明の状況での前記尿試料として使用される。例えば、尿試料は、ＷＯ ０１／７４２７５に記載されているような排尿装置により採取することも可能である。

血液試料は、例えば、静脈、動脈または毛細血管から、先行技術で知られる方法により採取可能である。通常、血液試料は、例えば、対象の腕から注射器により静脈血を回収することにより得る。用語「血液試料」は、血漿または血清のように、別の精製および分離方法により血液から得られる試料を含む。

試料中のポリペプチドマーカーの有無は、ポリペプチドマーカーを測定するのに適している先行技術で知られる任意の方法により決定することができる。このような方法は当業者には既知である。原則として、ポリペプチドマーカーの有無は、質量分析のような直接的方法により、または例えば、リガンドによる間接的な方法により決定することが可能である。

必要であるかもしくは望ましい場合、対象からの試料、例えば、尿または血液試料は、任意の適切な手段により前処理され、例えば、ポリペプチドマーカーの有無が測定される前に精製または分離されることも可能である。処理は、例えば、精製、分離、希釈または濃縮を含んでもよい。方法は、例えば、遠心分離、濾過、限外濾過、透析、沈殿、もしくはアフィニティー分離またはイオン交換クロマトグラフィーによる分離のようなクロマトグラフ的方法、電気泳動的分離、すなわち電場の適用で溶液中の電気的に荷電した粒子の異なる移動行動による分離であってもよい。これらの特定の例は、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンに基づくアフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相および逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび表面への選択的結合である。これらの方法はすべて、当業者には周知であり、ならびに当業者は、用いられる試料の働きのような方法およびポリペプチドマーカーの有無を決定するための方法を選択することも可能である。

本発明の１つの実施形態では、試料は、キャピラリー電気泳動により分離される前に、超遠心分離により分離され、精製され、および／または、特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含有する画分へ限外濾過により分けられる。

好ましくは、質量スペクトル的方法がポリペプチドマーカーの有無の決定に使用され、試料の精製または分離は、このような方法の上流で行われてもよい。広く用いられている方法に比べて、質量スペクトル分析は、１つの試料の多くの（１００より多い）ポリペプチドの濃度が、一回の分析で測定可能であるという長所を有する。任意のタイプの質量分析計を用いることが可能である。質量分析によって、ポリペチドマーカー１０ｆｍｏｌ、すなわち１０ｋＤタンパク質０．１ｎｇを、複雑な混合物中約±０．０１％の測定精度で日常的な事柄として測定することが可能である。質量分析計では、イオン形成ユニットが適切な分析デバイスと結合されている。例えば、電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）インターフェイスは、たいてい、液体試料中のイオンを測定するのに使用され、これに対して、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）は、マトリックス中に結晶化された試料からのイオンを測定するために使用される。形成されたイオンを分析するために、例えば、四重極型、イオントラップ型または飛行時間型（ＴＯＦ）の分析計を用いることも可能である。

電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、とりわけ、高電圧（例えば１−８ｋＶ）の影響下で原子化され、これはまず荷電小滴を形成し、これらは溶媒の蒸発により次第に小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発が遊離イオンの形成をもたらし、次いでこれらは分析され、検出可能である。

ＴＯＦを用いるイオンの分析では、イオンに等量の運動エネルギーを与える、特定の加速電圧が加えられる。その後、それぞれのイオンが飛行チューブを通って特定の漂流距離を移動するのにかかる時間が、非常に正確に測定される。等量の運動エネルギーの場合、イオンの速度はこれらの質量に依存するので、これによって後者が測定可能である。ＴＯＦ分析計は、非常に高い走査速度を有するので、したがってよい分離を達成する。

ポリペプチドマーカーの有無の決定のための好ましい方法は、レーザー脱離／イオン化質量分析のような気相イオン分光測定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳおよびキャピラリー電気泳動／質量分析（ＣＥ−ＭＳ）、を含む。上記のすべての方法も、当業者には知られている。

特に好ましい方法はＣＥ−ＭＳであり、キャピラリー電気泳動が質量分析と組み合せられている。本方法は、例えば、ドイツ特許出願ＤＥ１００２１７３７中、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００３，Ｖｏｌ．１０１３；１５７−１７１およびＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４，２５：２０４４−２０５５）中、および Ｗｉｔｔｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００３，１０１３：１７３−１８１）中にある程度詳しく説明されている。ＣＥ−ＭＳ技術は、１つの試料の数百のポリペプチドマーカーの存在を、同時に、短時間内に、ならびに小容量、高感度で定量することを可能にしている。試料が測定された後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作製され、ならびに本パターンは、病気のまたは健康の対象の基準パターンと比較することができる。ほとんどの場合、ＵＡＳの診断のためにわずかな数のポリペプチドマーカーを使用するのに十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳにオンラインで組み合せたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法は、さらに好ましい。

ＣＥ−ＭＳには、揮発性溶媒の使用が好ましく、ならびにこれは、実質的に無塩の条件下で最もよく作動する。このような溶媒の例は、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノールを含む。被検体、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために、溶媒は、水または弱酸（例えば、０．１％から１％ギ酸）を用いて希釈してもよい。

キャピラリー電気泳動を用いて、電荷およびサイズにより分子を分離することができる。中性粒子は、電流を加えると電気浸透流の速度で移動するのに対して、陽イオンは陰極方向に加速され、および陰イオンは遅延する。電気泳動における毛細管の長所は、容積に対する表面の適切な比にあり、これは、電流フローの際に発生するジュール熱の良好な消散を可能にする。これは次に、高電圧（通常、３０ｋＶまで）の適用を可能にし、したがって、高い分離性能および短時間での分析を可能にする。

キャピラリー電気泳動では、典型的には５０から７５μｍの内径を有する石英ガラス毛細管が通常用いられる。用いられる長さは、例えば、３０から１００ｃｍである。さらに、分離用毛細管は、通常、プラスチックでコートされた石英ガラスで作られる。毛細管は、無処理、すなわち、内表面上にこれらの親水性基を露出し、または内表面がコートされているかのいずれでもよい。分離を向上させるために、疎水性コーティングを使用してもよい。電圧のほかに、圧力をかけることも可能で、これは、典型的には０から１ｐｓｉまでの範囲内である。圧力は、分離の間だけかける、もしくはその間に変えることも可能である。

ポリペプチドマーカーを測定するための好ましい方法では、試料のマーカーは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、および検出用の連結された質量分析計へオンラインで移される。

本発明に従う方法では、ＶＤを診断するための幾つかのポリペプチドマーカーを用いるのが有利である。特に、少なくとも３つのポリペプチドマーカー、例えば、マーカー１、２および３；１、２および４；などを使用してもよい。

少なくとも４、５または６マーカーの使用がさらに好ましい。

少なくとも１１マーカー、例えば、マーカー１から１１の使用は、なお一層好ましい。

表１から４に明示された全５２６マーカーの使用は、最も好ましい。

重度ＶＤの存在の確率を定量するために、幾つかのマーカーが使用される場合、当業者に知られる統計的方法を用いることも可能である。例えば、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００４，６５：２４２６−２４３４）により記載されているＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ法を、Ｓ−Ｐｌｕｓのようなコンピュータープログラム、または同刊行物に記載されているサポートベクタマシンを用いることにより使用することも可能である。

１．試料調製
ＶＤを診断するためのポリペプチドマーカーを検出するために、尿が採用された。尿は、重度ＶＤに罹っている患者からだけでなく、健康なドナー（対照群）からも集められた。

後のＣＥ−ＭＳ測定のために、アルブミンおよび免疫グロブリンのような高濃度で患者の尿にも含有されるタンパク質も、限外濾過により除去しなければならなかった。従って、尿７００μｌを集め、濾過緩衝液（２Ｍ尿素、１０ｍＭアンモニア、０．０２％ＳＤＳ）７００μｍと混合した。この試料容量１．４ｍｌを限外濾過した（２０ｋＤａ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）。限外濾過は、限外濾過液１．１ｍｌが得られるまで、遠心分離機中３０００ｒｐｍで行った。

次に、得られた濾過液１．１ｍｌを、ＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）にかけ、０．０１％ＮＨ_４ＯＨ ２．５ｍｌで溶出し、凍結乾燥した。次に、ＣＥ−ＭＳ測定のために、これらのポリペプチドは、水（ＨＰＬＣ級、Ｍｅｒｃｋ）２０μｌで再懸濁した。

２．ＣＥ−ＭＳ測定
ＣＥ−ＭＳ測定は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，米国）からのキャピラリー電気泳動システムおよびＢｒｕｋｅｒ（ｍｉｃｒｏ−ＴＯＦ ＭＳ，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ，Ｂｒｅｍｅｎ，ドイツ）からのＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計で行った。

ＣＥ毛細管はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製で、内径／外径５０／３６０μｍおよび長さ９０ｃｍであった。ＣＥ分離の移動相は、２０％アセトニトリルおよび０．２５％ギ酸の水溶液からなっていた。ＭＳ上の「シースフロー」用に、３０％イソプロパノールを０．５％ギ酸とともに用い、ここで２μｌ／分の流速であった。ＣＥおよびＭＳの連結は、ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳ Ｓｐｒａｙｅｒ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，ドイツ）により実験した。

試料を注入するために、１から最高６ｐｓｉまでの圧力を加え、および注入の時間は９９秒であった。これらのパラメーターで、試料約１５０ｎｌをキャピラリーに注入したが、これは、キャピラリー容積の約１０％に相当する。スタッキング手法を使用して、キャピラリー中の試料を濃縮した。例えば、試料を注入する前に、１Ｍ ＮＨ_３溶液を（１ｐｓｉで）７秒間注入し、および試料を注入後に、２Ｍギ酸溶液を５秒間注入した。分離電圧（３０ｋＶ）を加えると、被検体は、これらの溶液間に自動的に濃縮された。

その後のＣＥ分離は、圧力法で行った。０ｐｓｉで４０分間、次いで０．１ｐｓｉで２分間、０．２ｐｓｉで２分間、０．３ｐｓｉで２分間、０．４ｐｓｉで２分間、および最後に０．５ｐｓｉで３２分間。分離行程の総時間は、このように８０分であった。

ＭＳ側でできるだけよいシグナル強度を得るために、ネブライザーガスを、できるだけ低い値にした。電子スプレーを発生させる噴霧針にかける電圧は、３７００−４１００Ｖであった。質量分析計における残りの設定は、製造会社の説明書に従ってペプチド検出に最適化された。スペクトルは、ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ３０００の質量範囲にわたって記録され、３秒毎に積算された。

３．ＣＥ測定のための標準物質
ＣＥ測定を点検および標準化するために、明示されたＣＥ移動時間により特徴づけられる下記のタンパク質またはポリペプチドが用いられた。

該タンパク質／ポリペプチドは、いずれも水中１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で用いられた。「ＲＥＶ」、「ＥＬＭ」、「ＫＩＮＣＯＮ」および「ＧＩＶＬＹ」は合成ペプチドである。

前記ペプチドの分子質量およびＭＳに見られる個々の荷電状態のｍ／ｚ比を下表に明示する。

原則として、移動時間の僅かな変動がキャピラリー電気泳動による分離において起こり得ることは、当業者にはわかっている。しかし、既述の条件下では、移動の順序は変わらない。明示された質量およびＣＥ時間を知る当業者には、自分の測定値を、本発明に従うポリペプチドマーカーに帰属させることは、容易にできる。例えば、次のように進めることが可能である。まず、自分の測定で見いだされたポリペプチドの１つを選択し（ペプチド１）、明示されたＣＥ時間の時間帯内（例えば、±５分）に１つ以上の同じ質量を見つけるように努める。１つだけ同じ質量がこの間隔内に見つかる場合、帰属は完了する。幾つかの合致する質量が見られるならば、帰属についての決定はなお行うことになる。このようにして、測定からもう１つのペプチド（ペプチド２）が選択され、やはり相当する時間帯を考慮して、適合するポリペプチドマーカーを同定するように努める。

再び、幾つかのマーカーが相当する質量に見られるならば、最もあり得る帰属は、ペプチド１のシフトとペプチド２のシフトとの間に実質的に直線関係があるということである。

帰属問題の複雑さ次第で、帰属のための試料からさらにタンパク質、例えば１０のタンパク質を場合により使用することを当業者は思いつく。典型的には、移動時間は、特定の絶対値だけ延びたり縮んだりし、もしくは全コースの圧縮または拡大が起こる。しかし、共移動するペプチドは、このような条件下でも共移動する。

さらに、当業者は、Ｚｕｅｒｂｉｇ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２７（２００６），ｐｐ．２１１１−２１２５により記載された移動パターンを使用することも可能である。単純な図式により（例えば、ＭＳ Ｅｘｃｅｌで）、移動時間対ｍ／ｚの形で測定値をプロットすれば、記載の線パターンも明白になる。そうなれば、個々のポリペプチドの簡単な帰属は、これらの線を計数することにより可能である。

帰属の別のアプローチも可能である。基本的には、当業者は、自分のＣＥ測定値を帰属させるために、内部標準物質として上述のペプチドを使用することもできる。

Claims (10)

1. 血管疾患（ＶＤ）の評価のために、尿試料中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無または振幅を検出する方法であって、前記ポリペプチドマーカーは、下記の分子質量およびＣＥ時間により特徴づけられるマーカー１〜５２６から選択され、該ＣＥ時間は、２５ｋＶの印加電圧で５０μｍの内径（ＩＤ）を有する長さ９０ｃｍのガラス毛細管に基づき、移動溶媒として２０％アセトニトリル、０．２５Ｍギ酸水溶液が使用される、前記方法。
   

   

   

   
2. 下記の対照群および心血管疾患（ＣＶＤ）群におけるマーカー１〜１０６の発生率に基づいて果たされる血管疾患の評価のために、マーカー１〜１０６の少なくとも３つの有無が検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
   

   
3. 下記の対照群および心血管疾患（ＣＶＤ）群におけるマーカー１０７〜４１３の振幅に基づいて果たされる血管疾患の評価のために、
   

   

   

   および、下記の対照群および心血管疾患（ＣＶＤ）群におけるマーカー４１４〜５２６の振幅に基づいて果たされる血管疾患の評価のために、マーカー１０７〜５２６の少なくとも３つの振幅が検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
   

   
4. 請求項１に定義される少なくとも５つまたは６つ、または少なくとも１０個またはすべてのポリペプチドマーカーが使用される、請求項１に記載の方法。
5. 前記ポリペプチドマーカーの有無または振幅を検出するために、キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオン分光測定および／または質量分析が使用される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記ポリペプチドマーカーの分子質量が測定される前にキャピラリー電気泳動が行われる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 前記ポリペプチドマーカーの有無または振幅を検出するために、質量分析が使用される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 血管疾患を評価するための、請求項１に記載の分子質量およびＣＥ時間により特徴づけられるマーカー１〜５２６から選択される、少なくとも３つのポリペプチドマーカーの使用。
9. 血管疾患の評価のために、
   ａ）尿試料を少なくとも３つのサブ試料に分ける段階；および
   ｂ）少なくとも２つの前記サブ試料を分析する段階；
   を含む、前記尿試料中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無または振幅を検出する方法であって、前記ポリペプチドマーカーは、請求項１に記載の分子質量およびＣＥ時間により特徴づけられるマーカー１〜５２６から選択され、該ＣＥ時間は、２５ｋＶの印加電圧で５０μｍの内径（ＩＤ）を有する長さ９０ｃｍのガラス毛細管に基づき、移動溶媒として２０％アセトニトリル、０．２５Ｍギ酸水溶液が使用される、前記方法。
10. 尿試料を少なくとも１０個のサブ試料に分ける段階、および少なくとも１０個のサブ試料を分析する段階を含む、請求項９に記載の方法。