JP2013504751A - 血管疾患を診断および評価するためのポリペプチドマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
診断用のポリペプチドマーカーを検出するために、尿を使用した。健康なドナー(対照群)および血管疾患に罹患している患者から尿を採取した。その後のCE−MS測定のために、限外ろ過によって、患者の尿に高濃度で含まれるタンパク質(アルブミンおよび免疫グロブリンなど)を分離する必要があった。そこで、700μLの尿を採取し、700μmのろ過バッファー(2M尿素、10mMアンモニア、0.02%SDS)と混合した。この体積1.4mLのサンプルを限外ろ過した(20kDa、ザルトリウス社、ドイツ、ゲッティンゲン)。1.1mLの限外ろ液が得られるまで、遠心機を用いて3000rpmで限外ろ過を行った。
CE−MS測定は、ベックマン・コールター社製のキャピラリー電気泳動システム(P/ACE MDQ System、ベックマン・コールター社、米国、カリフォルニア州、フラートン)およびブルカー社製のESI−TOF質量分析装置(マイクロ−TOF MS、ブルカー・ダルトニクス社、ドイツ、ブレーメン)を用いて行った。CEキャピラリーはベックマン・コールター社によって供給されたものであり、ID/ODが50/360μm、長さが90cmであった。CE分離用移動相は、20%アセトニトリルおよび0.25%ギ酸の水溶液からなるものであった。MS上での「シース流(sheath flow)」のために、0.5%ギ酸を加えた30%イソプロパノールを使用し、この場合、流量は2μL/分であった。CEとMSの連結は、CE−ESI−MS Sprayer Kit(アジレント・テクノロジー社、ドイツ、ワルドブロン)により行った。サンプルを注入するために、1psiから最大6psiの圧力を加え、注入時間は99秒とした。これらのパラメータを用いて、約150nLのサンプルをキャピラリー中に注入した。これはキャピラリー容積の約10%に相当する。スタッキング技術を用いてキャピラリー中でサンプルを濃縮した。そのため、サンプルを注入する前に、1MのNH3溶液を(1psiで)7秒間注入し、サンプル注入後に2Mのギ酸溶液を5秒間注入した。分離電圧(30kV)を印加すると、これらの溶液の間に、分析物が自動的に濃縮された。その後のCE分離は、圧力法(0psiで40分間、次いで0.1psiで2分間、0.2psiで2分間、0.3psiで2分間、0.4psiで2分間、最後に0.5psiで32分間)を用いて行った。したがって、分離ランの総時速時間は80分であった。
CE測定をチェックし、標準化するために、表記CE移動時間によって特徴付けられる以下のタンパク質またはポリペプチドを使用した。
Claims (12)
- 尿サンプル中の少なくとも3つのポリペプチドマーカーの有無または振幅を決定するステップを含み、前記ポリペプチドマーカーが表1中で分子量および移動時間によって特徴付けられるマーカーから選択される、血管疾患を診断するプロセス。
- 決定された前記マーカーの有無または振幅の評価が、表2に記載の基準値を用いて実施されることを特徴とする、請求項1に記載のプロセス。
- 請求項1に定義される少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも8個、少なくとも10個、少なくとも20個、または少なくとも50個のポリペプチドマーカーが使用される、請求項1〜2の少なくとも1項に記載のプロセス。
- 対象から得られる前記サンプルが、中間尿サンプルである、請求項1〜3のいずれかに記載のプロセス。
- キャピラリー電気泳動、HPLC、気相イオン分光法、および/または質量分析法が、前記ポリペプチドマーカーの有無または振幅を検出するために用いられる、請求項1〜4のいずれかに記載のプロセス。
- 前記ポリペプチドマーカーの分子量が測定される前に、キャピラリー電気泳動が実施される、請求項1〜5のいずれかに記載のプロセス。
- 質量分析法が、前記ポリペプチドマーカーの有無を検出するために使用される、請求項1〜6のいずれかに記載のプロセス。
- 血管疾患を診断するための、分子量および移動時間の値によって特徴付けられる表1に記載のマーカーから選択される少なくとも3つのペプチドマーカーの使用。
- (a)サンプルを少なくとも5個、好ましくは10個のサブサンプルに分割するステップ;
(b)前記サンプル中の少なくとも1つのポリペプチドマーカーの有無または振幅を決定するために、少なくとも5個の前記サブサンプルを分析するステップ
を含み、前記ポリペプチドマーカーが、分子量および移動時間(CE時間)によって特徴付けられる表1のマーカーから選択される、血管疾患の診断方法。 - 少なくとも10個のサブサンプルを測定する、請求項9に記載の方法。
- 前記CE時間が、20%アセトニトリル、0.25Mギ酸の水溶液が移動溶液として使用される、25kVの印加電圧で、50μmの内径(ID)を有する長さ90cmガラスキャピラリーに基づくことを特徴とする、請求項1〜10の少なくとも1項に記載の方法。
- 感度が少なくとも60%であり且つ特異度が少なくとも40%である、請求項1〜7または請求項9〜11の少なくとも1項に記載の方法。
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