EP1869473A2 - Polypeptidmarker zur diagnose von alzheimer - Google Patents

Polypeptidmarker zur diagnose von alzheimer

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EP1869473A2
EP1869473A2 EP06725566A EP06725566A EP1869473A2 EP 1869473 A2 EP1869473 A2 EP 1869473A2 EP 06725566 A EP06725566 A EP 06725566A EP 06725566 A EP06725566 A EP 06725566A EP 1869473 A2 EP1869473 A2 EP 1869473A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mass
mol
alzheimer
markers
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06725566A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP06725566A priority Critical patent/EP1869473A2/de
Publication of EP1869473A2 publication Critical patent/EP1869473A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • a worsening of the short-term memory as the first symptom is usually observed at the age of 60 to 70 years. Concentration and mental capacity diminish, speech disorders occur, fatigue increases. Often, symptoms of depression occur in the initial stages. There are also behavioral changes such as confusion, anxiety, restlessness and aggressiveness. They can no longer cope with everyday abilities like dressing, preparing food or shopping. Eventually they lose control of their body functions. In the final stage, patients often become silent, bedridden and completely dependent on the help of others.
  • Table 1 Polypeptide markers for the diagnosis of Alzheimer's and their molecular masses and migration times: No Mass Meal Time No Mass Meal Time No Mass Meal Time No Mass Meal Time
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide markers migrate is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. be the polypeptides given in the examples (see example point 3).
  • No. 1 or No. 50 but are not or only rarely present in subjects without Alzheimer's (control). Furthermore, there are polypeptide markers which are present in individuals without Alzheimer's disease, but which occur less frequently or not at all in individuals with Alzheimer's, for example polypeptide markers No. 43 or 44.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual (Alzheimer or not).
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tears, tissue, sperm, vaginal fluid, or a stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • Blood samples may be taken by methods known in the art, for example from a vein, artery or capillary.
  • a blood sample is obtained by giving venous blood to an individual by means of a blood test Syringe eg is removed from the arm.
  • the term blood sample also includes samples obtained from blood by further purification and separation techniques known in the art, such as blood plasma or blood serum.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as mass spectrometry or indirect methods such as by ligands.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • TOF time-of-flight
  • electrospray ionization (ESI) the molecules present in solution are sprayed under the influence of high voltage (eg 1-8 kV), forming charged droplets, which become smaller as the solvent evaporates.
  • high voltage eg 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • CE-MS a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • suitable solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and treated with a weak acid (eg, 0.1% formic acid) to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable surface-to-volume ratio, which results in a good removal of the Joule heat arising during the current flow allows. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.

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Abstract

Verfahren zur Diagnose von Alzheimer umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit mindestens eines Polypeptid markers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1-50 (Frequenzmarker), oder der Bestimmung der Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers, ausgewählt aus den Markern 51-279 (Amplitudenmarker), die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind:

Description

Polvpeptidmarker zur Diagnose von Alzheimer
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Alzheimer sowie ein Verfahren zur Diagnose von Alzheimer, wobei die An- oder Abwesenheit des oder der Peptidmarker(s) indikativ für das Vorliegen von Alzheimer ist.
Neuropsychiatrische Erkrankungen des höheren Lebensalters
An Demenzerkrankungen, deren häufigste Ursache die Alzheimer-Krankheit ist, leiden gut 7% der Altenbevölkerung, wobei der Anteil der Erkrankten annähernd exponentiell von weniger als 2% unter den 65-69-Jährigen auf mehr als 30% unter den über 85-Jährigen ansteigt. Insgesamt beläuft sich die Krankenzahl in Deutschland auf derzeit rund eine Mio.; bis zum Jahr 2050 würden es unter der Annahme gleicher Krankheitsraten 2,5 Mio. sein. Jährlich erkranken knapp 2% der zuvor gesunden älteren Menschen an einer Demenz; in Deutschland ent- spricht das mehr als 200.000 Neuerkrankungen pro Jahr. Schon heute muss ein Drittel der Menschen, die das 65. Lebensjahr erreichen, damit rechnen, im weiteren Altersverlauf eine Demenz zu entwickeln. Geringfügige Symptome einer möglicherweise heraufziehenden Demenz oder die frühesten, noch nicht verlässlich diagnostizierbaren Krankheitsstadien in Form des nach wie vor unscharf definierten Störungsbildes der leichten kognitiven Beeinträchtigung (minimal cognitive impairment, MCI) treten weitaus häufiger auf als eine manifeste Demenz. Aus Feldstudien werden oftmals Prä valenzraten zwischen 10 und 20%, in Einzelfällen auch von mehr als 30% berichtet. Die Vorhersage einer Demenz ist im Einzelfall indessen noch immer mit großer Ungenauigkeit behaftet. Alzheimer
Die Alzheimer-Krankheit wird auch Morbus Alzheimer oder "Demenz vom Alzheimer-Typ" genannt. Unter dem Begriff Demenz versteht man den Verfall der geistigen Leistungsfähigkeit. Die Alzheimer-Krankheit zeichnet sich vor allem durch eine anfängliche Gedächtnisschwäche aus, die im Verlauf zunimmt und zum To- talverlust der Urteilsfähigkeit und der Persönlichkeit führen kann. Direkt nach Schlaganfällen ist die Alzheimerdemenz die häufigste schwere Störung der Hirnfunktion im Alter.
Mit der steigenden Lebenserwartung wurde in den Industrieländern immer häufiger jene Krankheit diagnostiziert, die heute Alzheimers Namen trägt. Schwere Gedächtnisstörungen, Verfolgungswahn, Schlaflosigkeit und Unruhe sind die wichtigsten Anzeichen; allerdings können diese Symptome auch bei anderen Krankheiten einzeln oder in Kombination auftreten, wie zum Beispiel im Falle von Altersdemenz und Schlaganfall.
Rund eine Million Demenz-Patienten leben in Deutschland, zwei Drittel von ihnen haben Alzheimer. Das Risiko, an Alzheimer zu erkranken, wächst dabei mit zunehmendem Alter. Schätzungen zufolge sind in den westlichen Ländern etwa fünf Prozent der Bevölkerung über 65 Jahre und rund 20 Prozent der Bevölkerung über 80 Jahre betroffen. Weil Frauen im Durchschnitt länger leben als Männer, ist ihr Risiko, an Alzheimer zu erkranken, somit deutlich erhöht. Obwohl Alzheimer als Alterskrankheit gilt, können seltenere erbliche Formen des Leidens bereits ab dem dreißigsten Lebensjahr ausbrechen.
Zwar ist die Alzheimer-Krankheit derzeit noch unheilbar, die Behandlungsmöglichkeiten haben sich aber in den letzten Jahren verbessert. Je früher die Alzheimer-Krankheit erkannt und behandelt wird, desto besser ist die Chance, den Krankheitsprozess zu verlangsamen.
Die Krankheit beginnt meist schon mehrere Jahrzehnte, bevor die ersten Symptome auftreten. Dabei entstehen im Gehirn Ablagerungen aus Eiweißbruchstücken, so genannte Amyloide. Bei den Amyloiden unterscheidet man mikroskopisch kleine Fasern, die Fibrillen, und kugelförmige Ablagerungen, die Plaques. Diese Ablagerungen verhindern offenbar, dass die Nervenzellen sich untereinander verständigen können. Im Laufe der Zeit sterben dann die Nervenzellen in den Regionen des Gehirns ab, die an der Entwicklung von Gedächtnis, Sprache und Denkfähigkeit beteiligt sind.
Nur in Ausnahmefällen wird die Krankheit durch Genveränderungen ausgelöst und bricht dann schon in jüngerem Alter aus. Dies kann zum Beispiel passieren, wenn die Erbinformation des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP) geschädigt ist. Es bilden sich vermehrt schädliche Spaltprodukte von APP, die den wichtigsten Bestandteil der Plaques bilden. Ähnlich wirken sich Veränderungen anderer Gene aus, der Präseniline. Sie erhöhen die Aktivität von Enzymen, die das APP zerle- gen, und beschleunigen deshalb ebenfalls die Klumpenbildung im Gehirn.
Der wichtigste genetische Risikofaktor ist ein Molekül (ApoE), welches am Transport von Cholesterin im Blut beteiligt ist. Die Erbinformation für ApoE kommt in drei Varianten vor. Eine Variante (ApoE4) erhöht das Krankheitsrisiko im statistischen Durchschnitt um das Vier- bis Fünffache, eine andere Variante (ApoE2) senkt das Risiko.
Diagnose
Obwohl immer wieder von einfachen Tests berichtet wird, kann Alzheimer mit letzter Sicherheit erst nach dem Tod eines Patienten festgestellt werden, wenn im Gehirn die typischen Ablagerungen zu finden sind. In der Praxis kommt es darauf an, so früh wie möglich eine möglichst sichere Diagnose zu stellen.
Typische Symptome der Alzheimer Demenz sind:
• Störungen des Kurzzeitgedächtnisses
• Denkschwierigkeiten
• Sprachstörungen • Depressionen
• Eingeschränktes Urteilsvermögen
• Wahnvorstellungen
• Persönlichkeitsveränderungen
Eine Verschlechterung des Kurzzeitgedächtnisses als erstes Symptom ist meist schon im Alter von 60 bis 70 Jahren zu beobachten. Konzentrationsfähigkeit und Denkleistung lassen nach, Sprachstörungen treten auf, die Müdigkeit nimmt zu. Häufig treten in der Anfangsphase die Symptome einer Depression auf. Dazu kommen Verhaltensänderungen wie Verwirrtheit, Angst, Unruhe und Aggressivität. Alltagsfähigkeiten wie Ankleiden, Essenszubereitung oder Einkaufen können sie nicht mehr bewältigen, schließlich verlieren sie die Kontrolle über ihre Körper- funktionen. Im Endstadium verstummen die Patienten oft, sind bettlägerig und völlig auf die Hilfe anderer angewiesen.
Wie bereits beschrieben, gibt es keine funktionierende Früherkennung und keine verlässliche Diagnose bei Alzheimer. Es stellte sich also die Aufgabe, ein Verfah- ren und eine Methode zur möglichst wenig invasiven, schnellen und kostengünstigen Diagnose von Alzheimer zu finden.
Wittke et al. in Elektrophoresis 26 (2005) 1476-1487 beschreiben die Verwendung von Markern in humanem Urin durch CE-MS-Kopplung und ihre grundsätzliche Eignung zur Diagnose von Alzheimer. Es zeigt sich aus heutiger Sicht, dass die dort gefundenen Marker nur eine geringe Aussagekraft aufweisen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, zumindest einige der genannten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden, insbesondere Marker bereitzustellen, die eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Aussagekraft haben. Überraschender Weise wurde nun gefunden, das bestimmte Peptidmarker in Kombination in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Alzheimer verwendet werden können. Folglich ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der An- oder Abwesenheit von mindestens drei Polypeptidmar- kers in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Alzheimer, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Polypeptidmarkern Nr. 1 bis Nr. 279, die durch die die in Tabelle 1 angegebenen Molekularmassen und ihre Migrationszeiten charakterisiert sind.
Tabelle 1: Polypeptidmarker zur Diagnose von Alzheimer sowie ihre Molekularmassen und Migrationszeiten: Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit
[g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min]
1 1073,35 34,96 71 1130,37 35,19 142 2166,09 27,84 212 3905,8 27,72
2 1073,35 35,9 72 1130,63 27,07 143 2168,66 34,88 213 3929,73 23,07
3 1110,31 37,67 73 1135,56 27,03 144 2179,03 25,31 214 3934,76 24,02
4 1111,3 34,97 74 1150,61 26,55 145 2278,11 26,17 215 3951,07 22,77
5 1196,36 36,37 75 1158,62 27,02 146 2283,18 26,31 216 4005,54 22,57
6 1265,63 27,22 76 1183,66 27,49 147 2314,3 22,71 217 4087,12 26,92
7 1322,44 36,2 77 1186,56 27,21 148 2320,43 23,21 218 4112,78 24,46
8 1387,07 20,42 78 1217,56 21,8 149 2327,24 34,9 219 4131,68 22,54
9 1390,49 36,26 79 1229,62 27,38 150 2341,12 26,74 220 4164,86 25,11
1Q 1423,57 29,85 8Q 1250,61 27,59 151 2343,24 34,95 221 4192,99 34,95
11 1453,55 30,47 81 1276,43 35,7 152 2368,24 21,24 222 4203,13 26,14
12 1490,43 35,48 82 1283,4 35,91 153 2377,25 28,07 223 4218,31 20,6
13 1494,62 30,23 83 1300,67 29,7 154 2390,26 27,33 224 4232,32 32,35
14 1819,86 23,51 84 1306,74 22,16 155 2392,73 35,48 225 4250 27,68
15 1927,02 21 85 1333,44 35,93 156 2409,28 27,64 226 4278 25,3
16 2128,97 26,03 86 1342,44 35,43 157 2410,3 30,62 227 4301,93 21,26
17 2214,22 26,48 87 1347,71 28,94 158 2448,39 21,07 228 4307,09 31,58
18 2313,26 30,32 88 1349,67 28,25 159 2475,21 27,09 229 4349,06 28,17
19 2423,19 27,03 89 1360,67 28,06 160 2475,27 24,74 230 4384,07 19,8
2Q 2428,11 27,16 90 1386,68 28,62 161 2486,04 35,76 231 4428,79 32,86
21 2521,33 27,86 91 1388,74 27,97 162 2500,33 19,99 232 4464,64 21,54
22 2644,31 21,1 92 1399,44 36,06 163 2521 ,36 19,26 233 4468,61 23,47
23 2706,37 28,3 93 1404,73 29,49 164 2522,35 27,9 234 4510,97 28,56
24 3068,46 3Q.Q3 94 1409,63 22,11 165 2527,42 19,79 235 4548,03 25,95
25 3079,61 37,02 95 1449,7 22,04 166 2549,29 27,66 236 4562 29,31
26 3153,38 35,65 96 1451,72 28,84 167 2584,37 35,6 237 4562 29,31
27 3229,79 25,02 97 1464,7 30,57 168 2684,32 21,38 238 4564,18 26,01
28 3438,77 23,49 99 1475,77 30,05 169 2698,41 22,52 239 4583,84 24,2
29 3481,8 30,62 100 1499,74 29,89 170 2799,17 25,07 240 4637,81 27,82
3Q 3567,61 23,88 101 1519,76 31,87 171 2816,31 28,74 241 4730,71 19,63
31 3685,85 25,47 102 1535,74 30 172 2851 ,42 27,7 242 4749,41 21,81
32 3921,84 29,49 103 1542,78 23,24 173 2923,51 36,73 243 4750,06 19,53
33 4036,3 24,92 104 1550,67 27,47 174 2982,72 19,97 244 4890,59 23,27
34 4038,22 20,53 105 1552,61 30,78 175 3019,54 24,72 245 4933,64 20,57
35 4093,96 21,04 106 1590,81 32,46 176 3173,68 22,95 246 4986,98 21,35
36 4145,22 24,51 107 1596,83 30,32 177 3192,67 37,66 247 5039,63 25,68
37 4372,3 19,37 108 1614,84 31,54 178 3215,61 28,53 248 5042,1 24,31
38 4377,95 30,81 109 1623,65 31,1 179 3218,4 30,31 249 5060,4 20,09
39 4496,98 19,35 110 1628,8 20,75 180 3221 ,59 22,7 250 5110,36 25,28
4Q 4516 19,37 111 1636,79 22,71 181 3279,66 25,32 251 5122,44 20,75
41 4540,4 22 112 1659,81 27,41 182 3282,34 36,05 252 5157,79 34,26
42 4586,98 19,38 113 1692,91 31,38 183 3298,42 36,17 253 5181,63 25,36
43 4596,23 19,6 114 1703,89 33,01 184 3302,68 23,31 254 5258,56 22,09
44 4810,95 19,77 115 1727,92 32,13 185 3324,7 21,62 255 5439,46 25,41
45 5227,91 25,08 116 1732,88 31,36 186 3386,77 22,21 256 5495,33 31,72
46 5582,16 24,3 117 1738,68 32,16 187 3401,73 23,48 257 5660,6 31,55
47 6402,73 22,3 118 1741,83 30,56 188 3408,76 26,04 258 5745,2 19,72
48 7749,32 19,97 119 1756,89 19,81 189 3462,68 21,25 259 5891,27 24,16
49 776Q.Q2 28,72 120 1771,97 30,02 190 3466,75 23,9 260 6224,17 25,27
5Q 10671,25 28,92 121 1800,02 25 191 3524,8 31,72 261 6327,46 22,03
51 824,48 19,92 122 1816,98 33,53 192 3529,84 23,7 262 6498,75 20,1
52 840,49 19,92 123 1820,06 32,23 193 3595,77 23,89 263 6611,97 28,44
53 846,38 25,96 124 1841,77 36,26 194 3605,4 21,53 264 6617,76 24,03
54 897,41 25,86 125 1849,68 18,31 195 3614,82 22,01 265 6813,98 23,14
55 911,3 34,1 126 1850,96 31,97 196 3644,79 29,39 266 6881,81 21,72
56 950,57 24,13 127 1867,72 33,07 197 3645,25 26,69 267 6893,8 24,57
57 973,26 35,47 128 1869,92 31,28 198 3650,74 19,9 268 6985,31 21,87
58 984,45 26,32 129 1873 21,26 199 3672,71 21,9 269 7026,99 22,02
59 988,57 35,65 130 1900,07 24,19 200 3677,74 24,3 270 7049,04 22,79
6Q 1013,43 25,18 131 1914,07 25,67 201 3685,86 22,21 271 7106,83 23
61 1016,3 35,53 132 1915,72 34,24 202 3687,78 20,58 272 7142,49 21,32
62 1041,58 36,79 133 1917,03 24,99 203 3693,93 27,15 273 7210,86 22,94
63 1053,52 25,25 134 1955,95 27,81 204 3741 ,63 20,1 274 8176,16 19,47
64 1055,61 25,7 135 2021,11 21,85 205 3768,77 31,84 275 8186,93 20,72
65 1082,55 23,75 136 2041,99 32,56 206 3782,94 22,68 276 8289,28 19,39
66 1082,65 26,15 137 2053,18 20,54 207 3788,04 25,24 277 9724,01 25,64
67 1083,5 27,14 138 2072,15 27,04 208 3792,76 27,25 278 12529 20,64
68 1083,55 25,61 139 2077,07 25,44 209 3819,82 32,74 279 14557,83 19,21
69 1085,63 36,39 140 2085,12 33,75 210 3881 ,87 24,56
7Q 1094,61 25,99 141 2140,12 20,56 211 3903,08 25,71 Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Alzheimer sehr frühzeitig und verlässlich zu diagnostizieren. Dadurch kann die Krankheit in einem frühen Stadium therapiert werden. Die Erfindung ermöglicht weiterhin eine kostengünstige, schnelle und zuverlässige Diagnose bei nur minimal invasiven Eingriffen. Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) -wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt- bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird 30% Methanol, 0,5% Amei- sensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker migrieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen 1 bis 3 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z. B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,1%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,05%. Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptid- marker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein. Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptid marker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide (siehe Tabelle 1 bis 3) werden verwendet, um Alzheimer zu diagnostizieren. Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird von der An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auf das Vorliegen von Alzheimer geschlossen. Hierzu werden die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker in einer Pro- be eines Individuums bestimmt, wobei ihre An- oder Abwesenheit auf das Vorliegen von Alzheimer schließen lässt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt. Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass sei- ne/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für Alzheimer ist. Tabelle 2 zeigt Polypeptidmarker, die typischerweise bei Patienten mit Alzheimer (krank) vorhanden sind, wie z.B. Polypeptidmarker
Nr. 1 oder Nr. 50, jedoch bei Probanden ohne Alzheimer (Kontrolle) nicht oder nur selten vorhanden sind. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Individu- en ohne Alzheimer vorhanden sind, jedoch bei Individuen mit Alzheimer seltener oder gar nicht auftreten, z.B. die Polypeptidmarker Nr. 43 oder 44. Tabelle 2: Polypeptid marker zur Diagnose von Alzheimer, ihre Molekularmassen und Migrationszeiten sowie ihre An- und Abwesenheit in den einzelnen Gruppen als Häufigkeit je Gruppe (1=100%, 0=0%) bei der an Alzheimer erkrankten Patientengruppe sowie der Kontrollgruppe (Probenaufarbeitung und Messung wie im Beispiel beschrieben).
Nr Masse Migrationszeit FrequenzHäufigkeit je Gruppe [g/mol] [min] unterschied Alzheimer Demenz Kontrollen
1 1073,35 34,96 0,45 0,45 0
2 1073,35 35,9 -0,48 0,46 0,94
3 1110,31 37,67 -0,44 0 0,44
4 1111,3 34,97 -0,41 0,27 0,69
5 1196,36 36,37 -0,44 0,31 0,75
6 1265,63 27,22 0,41 0,66 0,25
7 1322,44 36,2 0,44 0,75 0,31
8 1387,07 20,42 -0,41 0,09 0,5
9 1390,49 36,26 0,42 0,55 0,13
10 1423,57 29,85 0,48 0,79 0,31
11 1453,55 30,47 0,44 0,63 0,19
12 1490,43 35,48 0,42 0,79 0,38
13 1494,62 30,23 0,5 0,75 0,25
14 1819,86 23,51 -0,48 0,27 0,75
15 1927,02 21 0,48 0,67 0,19
16 2128,97 26,03 0,46 0,96 0,5
17 2214,22 26,48 0,52 0,83 0,31
18 2313,26 30,32 0,48 0,67 0,19
19 2423,19 27,03 0,41 0,6 0,19
20 2428,11 27,16 -0,45 0,36 0,81
21 2521,33 27,86 -0,44 0 0,44
22 2644,31 21,1 0,45 0,89 0,44
23 2706,37 28,3 0,46 0,71 0,25
24 3068,46 30,03 0,46 0,77 0,31
25 3079,61 37,02 -0,42 0,46 0,88
26 3153,38 35,65 0,46 0,71 0,25
27 3229,79 25,02 -0,44 0 0,44
28 3438,77 23,49 0,44 0,75 0,31
29 3481,8 30,62 0,45 0,89 0,44
30 3567,61 23,88 -0,44 0,18 0,63
31 3685,85 25,47 -0,44 0,18 0,63
32 3921,84 29,49 -0,41 0,09 0,5
33 4036,3 24,92 0,5 0,69 0,19
34 4038,22 20,53 -0,63 0 0,63
35 4093,96 21,04 0,5 0,63 0,13
36 4145,22 24,51 0,42 0,42 0
37 4372,3 19,37 -0,44 0,18 0,63
38 4377,95 30,81 0,5 0,63 0,13
39 4496,98 19,35 -0,41 0,09 0,5
40 4516 19,37 -0,45 0,36 0,81
41 4540,4 22 -0,41 0,09 0,5
42 4586,98 19,38 -0,41 0,27 0,69
43 4596,23 19,6 -0,47 0,09 0,56
44 4810,95 19,77 -0,44 0 0,44
45 5227,91 25,08 0,54 0,73 0,19
46 5582,16 24,3 0,4 0,4 0
47 6402,73 22,3 0,44 0,63 0,19
48 7749,32 19,97 -0,41 0,09 0,5
49 7760,02 28,72 0,46 0,71 0,25
50 10671 ,25 28,92 0,48 0,67 0,19
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch die in Tabelle 3 angegebenen Amplitudenmarker zur Diagnose von Alzheimer verwendet werden (Nummer 51-279). Amplituden- marker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In Tabelle 3 sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben. Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 15 einzelnen Patienten- oder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose (Alzheimer oder nicht) fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der Alzheimer -Gruppe ist. Entsprechen die mittleren Amplituden eher den mittleren Amplituden der Alzheimergruppe, so ist von dem Vorliegen einer Alzheimer Erkrankung auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer Alzheimererkrankung auszugehen. Eine genauere Definition soll anhand von Marker Nr. 130 (Tabelle 3) gegeben werden. Die mittlere Amplitude des Markers ist bei einer Alzheimer Erkrankung deutlich erhöht (920 ppm gegen 373 ppm in der Kontrollgruppe). Liegt nun in einer Patientenprobe der Wert für diesen Marker bei 0 bis 373 ppm, bzw. maximal 20% darüber, also 0 bis 448 ppm, gehört diese Probe zur Kontrollgruppe. Liegt der Wert bei 920 ppm, bzw. 20% darunter, oder höher, also zwischen 736 ppm und sehr hohen Werten, ist dies als Hinweis auf eine Alzheimer Erkrankung zu werten. Je geringer der Abstand zwischen den Amplituden der Kontrollgruppe und der Alzheimer Gruppe, desto dichter muss der Wert, der zwischen den beiden Referenzwerten liegt, an einem Referenzwert liegen.
Eine Möglichkeit ist, den Bereich zwischen den mittleren Amplituden in drei Teile zu zerlegen. Liegt der Wert im unteren Drittel, ist dies indikativ für den unteren Wert, liegt der Wert im oberen Drittel, ist dies indikativ für den oberen Wert. Liegt er im mittleren Drittel, ist keine Aussage hinsichtlich dieses Markers möglich.
Tabelle 3: Amplitudenmarker Nr Masse Migrationszeit mittlere Amplitude je Gruppe Nr Masse [g/mol] Migrationszeit mittlere Amplitude je Gruppe
[g/mol] [min] Alzheimer Kontrollen [min] Alzheimer | Kontrollen
51 824,48 19,92 568,85 501,97 128 1869,92 31,28 223,93 140,79
52 840,49 19,92 810,27 593,64 129 1873 21,26 440,7 270,85
53 846,38 25,96 100,62 122,25 130 1900,07 24,19 920,26 373,01
54 897,41 25,86 81,54 48,26 131 1914,07 25,67 1519,39 1746,72
55 911,3 34,1 242,62 247,96 132 1915,72 34,24 180,37 151,24
56 950,57 24,13 78,07 67,87 133 1917,03 24,99 197,09 216,02
57 973,26 35,47 179,96 150,04 134 1955,95 27,81 129,24 99,09
58 984,45 26,32 110,69 132,44 135 2021,11 21,85 346,14 257,95
59 988,57 35,65 211,75 188,31 136 2041,99 32,56 193,08 127,84
60 1013,43 25,18 175,63 104,85 137 2053,18 20,54 501,38 674,91
61 1016,3 35,53 909,17 810,15 138 2072,15 27,04 601,86 494,89
62 1041,58 36,79 86,97 139,71 139 2077,07 25,44 261,1 214,6
63 1053,52 25,25 87,43 46,52 140 2085,12 33,75 215,62 302,81
64 1055,61 25,7 277,17 465,99 141 2140,12 20,56 256,95 290,52
65 1082,55 23,75 78,89 50,53 142 2166,09 27,84 128,57 52,54
66 1082,65 26,15 112,48 104,55 143 2168,66 34,88 257,1 291,77
67 1083,5 27,14 118,51 108,08 144 2179,03 25,31 84,93 31,65
68 1083,55 25,61 271,44 164,33 145 2278,11 26,17 438,37 314,65
69 1085,63 36,39 140,8 145,98 146 2283,18 26,31 619,59 634,52
70 1094,61 25,99 460,11 418,75 147 2314,3 22,71 1018,08 1167,69
71 1130,37 35,19 670,41 372,37 148 2320,43 23,21 212,67 166,8
72 1130,63 27,07 115,03 78,26 149 2327,24 34,9 1737,42 1517,73
73 1135,56 27,03 60,46 58,13 150 2341,12 26,74 304,17 535,15
74 1150,61 26,55 80,41 45,34 151 2343,24 34,95 270,79 236,16
75 1158,62 27,02 68,79 40,98 152 2368,24 21,24 101,48 105,72
76 1183,66 27,49 110,3 73,65 153 2377,25 28,07 2711,11 1749,4
77 1186,56 27,21 315,86 221,73 154 2390,26 27,33 617,62 500,67
78 1217,56 21,8 90,54 80,33 155 2392,73 35,48 512,31 482,03
79 1229,62 27,38 99,75 62,81 156 2409,28 27,64 275,81 159,58
80 1250,61 27,59 455,17 151,8 157 2410,3 30,62 338,59 232,89
81 1276,43 35,7 1739,68 1000,12 158 2448,39 21,07 488,24 440,74
82 1283,4 35,91 104,76 53 159 2475,21 27,09 757,06 535,45
83 1300,67 29,7 120,17 58,65 160 2475,27 24,74 478,15 297,04
84 1306,74 22,16 552,66 320,23 161 2486,04 35,76 2280,47 1824,17
85 1333,44 35,93 268,17 204,63 162 2500,33 19,99 110,01 94,92
86 1342,44 35,43 275,61 325,49 163 2521,36 19,26 516,08 635,2
87 1347,71 28,94 83,29 67,88 164 2522,35 27,9 4135,44 3306,09
88 1349,67 28,25 363,22 580,39 165 2527,42 19,79 393,22 500,27
89 1360,67 28,06 90,7 94,56 166 2549,29 27,66 99,25 108,48
90 1386,68 28,62 366,31 404,69 167 2584,37 35,6 451,18 260,07
91 1388,74 27,97 319,52 394,09 168 2684,32 21,38 1926,21 155,86
92 1399,44 36,06 179,15 82,16 169 2698,41 22,52 182,49 220,4
93 1404,73 29,49 165,77 108,43 170 2799,17 25,07 445,75 375,83
94 1409,63 22,11 288,37 317,52 171 2816,31 28,74 1366,84 1928,38
95 1449,7 22,04 77,35 102,04 172 2851,42 27,7 495,9 288,67
96 1451,72 28,84 111,94 52,91 173 2923,51 36,73 818,47 883,22
97 1464,7 30,57 1169,16 1453,9 174 2982,72 19,97 3750,78 5523,72
98 1464,7 30,57 1346,04 1453,9 175 3019,54 24,72 170,57 189,58
99 1475,77 30,05 216,71 146,11 176 3173,68 22,95 155,36 252,28
100 1499,74 29,89 104,53 57,36 177 3192,67 37,66 689,53 1089,16
101 1519,76 31,87 392,54 271,33 178 3215,61 28,53 1305,23 2016,28
102 1535,74 30 2366,44 3661,09 179 3218,4 30,31 1384,58 1875,79
103 1542,78 23,24 713,91 533,83 180 3221,59 22,7 170,45 217,24
104 1550,67 27,47 576,53 637,58 181 3279,66 25,32 141,5 83
105 1552,61 30,78 176,95 110,5 182 3282,34 36,05 1082,36 1351,09
106 1590,81 32,46 1491,15 1260,68 183 3298,42 36,17 268,81 282,69
107 1596,83 30,32 873,36 577,23 184 3302,68 23,31 316,81 508,67
108 1614,84 31,54 688,7 410,65 185 3324,7 21,62 422,39 490,7
109 1623,65 31,1 697,2 364,52 186 3386,77 22,21 670,34 395,98
110 1628,8 20,75 304,52 326,72 187 3401,73 23,48 2618,95 4622,56
111 1636,79 22,71 1006,43 814,9 188 3408,76 26,04 175,22 94,81
112 1659,81 27,41 589,62 358,41 189 3462,68 21,25 2161,32 2653,08
113 1692,91 31,38 127,4 95,57 190 3466,75 23,9 904,51 559,21
114 1703,89 33,01 287,84 258,89 191 3524,8 31,72 1130,3 410,29
115 1727,92 32,13 552,58 276,12 192 3529,84 23,7 1979,26 2916,13
116 1732,88 31,36 596,19 543,08 193 3595,77 23,89 344,53 455,24
117 1738,68 32,16 92,84 40,42 194 3605,4 21,53 321,29 479,63
118 1741,83 30,56 114,01 84,13 195 3614,82 22,01 161,46 267,85
119 1756,89 19,81 176,68 85,89 196 3644,79 29,39 1038,75 749,16
120 1771,97 30,02 328,73 214,56 197 3645,25 26,69 1161,31 741,33
121 1800,02 25 516,9 674,37 198 3650,74 19,9 1029,39 1161,19
122 1816,98 33,53 395,82 180,33 199 3672,71 21,9 1896,48 819,91
123 1820,06 32,23 107,09 76,57 200 3677,74 24,3 1717,39 1567,09
124 1841,77 36,26 847,46 1396,48 201 3685,86 22,21 9259,98 16077,47
125 1849,68 18,31 405,84 688,91 202 3687,78 20,58 832,51 1095,77
126 1850,96 31,97 116,29 133,34 203 3693,93 27,15 344,49 218,63
127 1867,72 33,07 1356,26 956,64 204 3741,63 20,1 547,74 806,46
205 3768,77 31,84 533,93 377,59
206 3782,94 22,68 360,79 364,04
207 3788,04 25,24 609,58 782,85
208 3792,76 27,25 682,32 432,09
209 3819,82 32,74 120,7 133,76
210 3881,87 24,56 3257,71 1968,09
211 3903,08 25,71 2177,14 2780,86
212 3905,8 27,72 23257,92 16304,43
213 3929,73 23,07 2742,02 3430,19
214 3934,76 24,02 653,19 487,54
215 3951,07 22,77 25509,01 32844,44
216 4005,54 22,57 566,89 387,06
217 4087,12 26,92 607,44 490,16
218 4112,78 24,46 267,94 308,15
219 4131,68 22,54 653,71 586,61
220 4164,86 25,11 781,59 466,12
221 4192,99 34,95 1761,93 1496,61
222 4203,13 26,14 613,9 1051,15
223 4218,31 20,6 939,4 1360,44
224 4232,32 32,35 318,48 349,1
225 4250 27,68 504,35 286,25
226 4278 25,3 1161,81 745,21
227 4301,93 21,26 476,37 698,84
228 4307,09 31,58 157,37 88,2
229 4349,06 28,17 15449,01 7992,31
230 4384,07 19,8 465,18 981,39
231 4428,79 32,86 827,48 433,08
232 4464,64 21,54 4084,32 2311,8
233 4468,61 23,47 3429,99 2945,88
234 4510,97 28,56 1157,68 629,08
235 4548,03 25,95 3177,96 2703,21
236 4562 29,31 509,94 403,2
237 4562 29,31 574,68 403,2
238 4564,18 26,01 497,67 438,34
239 4583,84 24,2 7608,37 7241,51
240 4637,81 27,82 337,27 294,89
241 4730,71 19,63 797,93 1759,4
242 4749,41 21,81 725,74 426,89
243 4750,06 19,53 4365,88 3189,94
244 4890,59 23,27 1965,12 1418,61
245 4933,64 20,57 878,93 735,48
246 4986,98 21,35 637,73 533,05
247 5039,63 25,68 1039,64 1389,17
248 5042,1 24,31 3686,99 3120,74
249 5060,4 20,09 3307,86 1942,65
250 5110,36 25,28 637,44 697,57
251 5122,44 20,75 1342 851,23
252 5157,79 34,26 200,52 208,01
253 5181,63 25,36 5716,39 4305,72
254 5258,56 22,09 12476,68 10602,4
255 5439,46 25,41 713,92 522,3
256 5495,33 31,72 1776,93 1297,43
257 5660,6 31,55 893,02 595,49
258 5745,2 19,72 851,4 1608,76
259 5891,27 24,16 482,2 422,63
260 6224,17 25,27 1104,36 995,62
261 6327,46 22,03 1410,46 1027,79
262 6498,75 20,1 3989,56 2972,62
263 6611,97 28,44 311,21 338,55
264 6617,76 24,03 2799,82 1943,58
265 6813,98 23,14 4217,01 3699,9
266 6881,81 21,72 450,1 868,21
267 6893,8 24,57 2537,57 1569,65
268 6985,31 21,87 2238,63 1577,04
269 7026,99 22,02 2132,66 1480,92
270 7049,04 22,79 8522,63 6229,31
271 7106,83 23 766,91 575,59
272 7142,49 21,32 1014,86 557,95
273 7210,86 22,94 915,21 568,24
274 8176,16 19,47 11495,92 7835,63
275 8186,93 20,72 1706,07 1130,11
276 8289,28 19,39 4317,47 3227,21
277 9724,01 25,64 3380,24 1957,82
278 12529 20,64 38234,95 9397,12
279 14557,83 19,21 1514,79 2225,19 Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an Alzheimer leiden kann, z.B. ein Tier oder ein Mensch. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, wie z.B. einen Hund oder ein Pferd, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nicht nur ein Polypeptidmarker, sondern eine Kombination von Markern verwendet, um Alzheimer zu diagnostizieren. Dabei wird durch ihre An- oder Abwesenheit auf das Vorliegen von Alzheimer geschlossen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmar- kern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im Kranken oder Kontrollindividuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums (Alzheimer oder nicht) zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pankreassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe, eine Blutprobe, wobei es sich bei einer Blutprobe um eine (Blut)serum- oder (Blut)plasmaprobe handeln kann oder eine Liquorprobe. Als Liquor wird die Cerebrospinalflüssigkeit bezeichnet, die mit dem Gehirn in Kontakt steht und auch das Rückenmark umspült. Aus dem Rückenmark kann sie auch mit wenig Aufwand durch Punktion entnommen werden.
Blutproben können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren beispielswei- se aus einer Vene, Arterie oder Kapillare entnommen werden. Für gewöhnlich wird eine Blutprobe erhalten, indem einem Individuum venöses Blut mittels einer Spritze z.B. aus dem Arm entnommen wird. Der Begriff Blutprobe bezieht auch Proben ein, die aus Blut durch weitere, aus dem Stand der Technik bekannte Aufreinigungs- und Trennverfahren gewonnen wurden, wie z.B. Blutplasma oder Blutserum. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptid- markern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urin- oder Blutprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscher-Chromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacry- lamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptid marker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (> 100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektro- metrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine ionenbildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser- desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden. Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladenen Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können. Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan- Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25:2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wur- de, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptid- markern für die Diagnose von Alzheimer zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt. Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer schwachen Säure (z.B. 0,1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der E- lektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus Kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafter Weise mehrere PoIy- peptidmarker zur Diagnose von Alzheimer verwendet werden. Insbesondere können mindestens drei Polypeptidmarker verwendet werden, beispielsweise die Marker 1, 2 und 3; 1, 2 und 4, usw.
Mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 4, 5, oder 6 Markern.
Noch mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 13 Markern, beispielsweise die Marker 1 bis 13.
Am meisten bevorzugt ist die Verwendung aller 279 in den Tabellen 1 bis 3 auf- geführten Marker.
In einer Ausführungsform werden die Marker 123, 144, 167, 38, 255, 257 und 72 verwendet.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen von Alzheimer bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Ver- fahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65:2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus verwendet werden.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq: Zur Detektion der Polypeptidmarker für Alzheimer wurde Liquor verwendet. Liquor wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an Alzheimer leiden, durch Lumbalpunktion abgenommen. Es wurden Kontrollproben von 6 Personen (Alter 32-64 Jahre) ohne neurologische oder psychiatrische Krankheiten verwendet. Die Liquorproben für die Alzheimer-Gruppe stammten von 23 Patienten (Alter 57-76 Jahre), für die MCI - Gruppe von 8 Patienten (Alter 60-75 Jahre).
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die im Liquor vorkommenden großen Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Liquor entnommen und mit 700 μL Filtrati- onspuffer (4 M Harnstoff, 10 mM NH4OH, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 mL Probenvolumen wurden ultrafiltriert (Amicon 30 kDa, Millipore, Bedford, USA). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,2 mL Ultra- filtrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1,2 mL Filtrat wurden dann auf eine Pharmacia C-2 Säule aufge- tragen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), um Harnstoff, Salze und andere störende Komponenten zu entfernen. Die gebundenen Polypeptide wurden dann mit 50% Acetonitril, 0,5% Ameisensäure in Wasser von der C-2 Säule eluiert und lyophillisiert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert. 2. CE-MS Messung:
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt. Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 30 % Methanol und 0,5% Ameisensäure in Wasser. Für den "Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwen- det, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit einem Druck von 1 psi wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzu konzentrieren wurde eine „Stacking" -Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten. Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700-4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 350 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert.
3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind: Protein/Polypeptid Migrationszeit Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. Al 153) 9,2 min Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; KatNr.; R4875 10,9 min Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 8,9 min "REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQIIS 15,6 min "ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,4 min "KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 20,0 min "GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 36,8 min
Die Protei ne/Poly peptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Die Molekularmassen der Peptide sowie die in der MS sichtbaren m/z Verhältnisse der einzelnen Ladungszustände sind wie folgt:
4. Vergleich der erfindunqsqemäßen Marker mit dem Stand der Technik
Wittke et al. in Elektrophoresis 26 (2005), 1476-1487 beschreiben in Tabelle 1 zehn Marker, die indikativ für das Vorliegen von Alzheimer sein sollen. Weitergehende Untersuchungen haben gezeigt, dass die gefundenen Marker nur eine geringere Spezifität aufweisen.
Figur Ia zeigt die Aussagekraft der Biomarker aus der Publikation. Dargestellt sind die Biomarker mit den ID 's 108317 (ID-paper 356), 108983 (ID Paper 362), ID 128206 (ID Paper 472), ID 131316 (ID Paper 490), ID 131401 (ID Paper 491) und ID 136537 (ID Paper 515). Figur Ib zeigt die Aussagekraft weiterer Biomarker aus der Publikation. Dargestellt sind die Biomarker mit den ID 's 49693 (ID Paper 51), 66564 (ID Paper 111), ID 75674 (ID-Paper 142), ID 89174 (ID Paper 208).
Es ist deutlich zu erkennen, dass der prädiktive Wert nahezu für jeden der zehn in der Veröffentlichung enthaltenden Marker nahe 0 liegt im Gegensatz zu den erfindungsgemäß beanspruchten Markern.
Figur 2a und b zeigen die entsprechende Analyse für zwölf erfindungsgemäße Marker. Diese führen zu einer korrekten Trennung der Gruppen (gesund ./. Alzheimer). Durch Auswahl von mindestens drei Markern erreicht die Analyse eine Genauigkeit von 84%.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose von Alzheimer umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit mindestens eines Polypeptid markers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1-50 (Frequenzmarker), oder der Bestimmung der Amplitude mindestens eines Po- lypeptidmarkers, ausgewählt aus den Markern 51-279 (Amplitudenmarker), die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind:
Nr Masse Migrationszeit Nr Masse Migrationszeit Nr Masse Migrationszeit Nr Masse Migrationszeit
[g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min]
1 1073,35 34,96 71 1130,37 35,19 142 2166,09 27,84 212 3905,8 27,72
2 1073,35 35,9 72 1130,63 27,07 143 2168,66 34,88 213 3929,73 23,07
3 1110,31 37,67 73 1135,56 27,03 144 2179,03 25,31 214 3934,76 24,02
4 1111,3 34,97 74 1150,61 26,55 145 2278,11 26,17 215 3951,07 22,77
5 1196,36 36,37 75 1158,62 27,02 146 2283,18 26,31 216 4005,54 22,57
6 1265,63 27,22 76 1183,66 27,49 147 2314,3 22,71 217 4087,12 26,92
7 1322,44 36,2 77 1186,56 27,21 148 2320,43 23,21 218 4112,78 24,46
8 1387,07 20,42 78 1217,56 21,8 149 2327,24 34,9 219 4131,68 22,54
9 1390,49 36,26 79 1229,62 27,38 150 2341,12 26,74 220 4164,86 25,11
10 1423,57 29,85 80 1250,61 27,59 151 2343,24 34,95 221 4192,99 34,95
11 1453,55 30,47 81 1276,43 35,7 152 2368,24 21,24 222 4203,13 26,14
12 1490,43 35,48 82 1283,4 35,91 153 2377,25 28,07 223 4218,31 20,6
13 1494,62 30,23 83 1300,67 29,7 154 2390,26 27,33 224 4232,32 32,35
14 1819,86 23,51 84 1306,74 22,16 155 2392,73 35,48 225 4250 27,68
15 1927,02 21 85 1333,44 35,93 156 2409,28 27,64 226 4278 25,3
16 2128,97 26,03 86 1342,44 35,43 157 2410,3 30,62 227 4301,93 21,26
17 2214,22 26,48 87 1347,71 28,94 158 2448,39 21,07 228 4307,09 31,58
18 2313,26 30,32 88 1349,67 28,25 159 2475,21 27,09 229 4349,06 28,17
19 2423,19 27,03 89 1360,67 28,06 160 2475,27 24,74 230 4384,07 19,8
20 2428,11 27,16 90 1386,68 28,62 161 2486,04 35,76 231 4428,79 32,86
21 2521,33 27,86 91 1388,74 27,97 162 2500,33 19,99 232 4464,64 21,54
22 2644,31 21,1 92 1399,44 36,06 163 2521,36 19,26 233 4468,61 23,47
23 2706,37 28,3 93 1404,73 29,49 164 2522,35 27,9 234 4510,97 28,56
24 3068,46 30,03 94 1409,63 22,11 165 2527,42 19,79 235 4548,03 25,95
25 3079,61 37,02 95 1449,7 22,04 166 2549,29 27,66 236 4562 29,31
26 3153,38 35,65 96 1451,72 28,84 167 2584,37 35,6 237 4562 29,31
27 3229,79 25,02 97 1464,7 30,57 168 2684,32 21,38 238 4564,18 26,01
28 3438,77 23,49 99 1475,77 30,05 169 2698,41 22,52 239 4583,84 24,2
29 3481,8 30,62 100 1499,74 29,89 170 2799,17 25,07 240 4637,81 27,82
30 3567,61 23,88 101 1519,76 31,87 171 2816,31 28,74 241 4730,71 19,63
31 3685,85 25,47 102 1535,74 30 172 2851,42 27,7 242 4749,41 21,81
32 3921,84 29,49 103 1542,78 23,24 173 2923,51 36,73 243 4750,06 19,53
33 4036,3 24,92 104 1550,67 27,47 174 2982,72 19,97 244 4890,59 23,27
34 4038,22 20,53 105 1552,61 30,78 175 3019,54 24,72 245 4933,64 20,57
35 4093,96 21,04 106 1590,81 32,46 176 3173,68 22,95 246 4986,98 21,35
36 4145,22 24,51 107 1596,83 30,32 177 3192,67 37,66 247 5039,63 25,68
37 4372,3 19,37 108 1614,84 31,54 178 3215,61 28,53 248 5042,1 24,31
38 4377,95 30,81 109 1623,65 31,1 179 3218,4 30,31 249 5060,4 20,09
39 4496,98 19,35 110 1628,8 20,75 180 3221,59 22,7 250 5110,36 25,28
40 4516 19,37 111 1636,79 22,71 181 3279,66 25,32 251 5122,44 20,75
41 4540,4 22 112 1659,81 27,41 182 3282,34 36,05 252 5157,79 34,26
42 4586,98 19,38 113 1692,91 31,38 183 3298,42 36,17 253 5181,63 25,36
43 4596,23 19,6 114 1703,89 33,01 184 3302,68 23,31 254 5258,56 22,09
44 4810,95 19,77 115 1727,92 32,13 185 3324,7 21,62 255 5439,46 25,41
45 5227,91 25,08 116 1732,88 31,36 186 3386,77 22,21 256 5495,33 31,72
46 5582,16 24,3 117 1738,68 32,16 187 3401,73 23,48 257 5660,6 31,55
47 6402,73 22,3 118 1741,83 30,56 188 3408,76 26,04 258 5745,2 19,72
48 7749,32 19,97 119 1756,89 19,81 189 3462,68 21,25 259 5891,27 24,16
49 7760,02 28,72 120 1771,97 30,02 190 3466,75 23,9 260 6224,17 25,27
50 10671,25 28,92 121 1800,02 25 191 3524,8 31,72 261 6327,46 22,03
51 824,48 19,92 122 1816,98 33,53 192 3529,84 23,7 262 6498,75 20,1
52 840,49 19,92 123 1820,06 32,23 193 3595,77 23,89 263 6611,97 28,44
53 846,38 25,96 124 1841,77 36,26 194 3605,4 21,53 264 6617,76 24,03
54 897,41 25,86 125 1849,68 18,31 195 3614,82 22,01 265 6813,98 23,14
55 911,3 34,1 126 1850,96 31,97 196 3644,79 29,39 266 6881,81 21,72
56 950,57 24,13 127 1867,72 33,07 197 3645,25 26,69 267 6893,8 24,57
57 973,26 35,47 128 1869,92 31,28 198 3650,74 19,9 268 6985,31 21,87
58 984,45 26,32 129 1873 21,26 199 3672,71 21,9 269 7026,99 22,02
59 988,57 35,65 130 1900,07 24,19 200 3677,74 24,3 270 7049,04 22,79
60 1013,43 25,18 131 1914,07 25,67 201 3685,86 22,21 271 7106,83 23
61 1016,3 35,53 132 1915,72 34,24 202 3687,78 20,58 272 7142,49 21,32
62 1041,58 36,79 133 1917,03 24,99 203 3693,93 27,15 273 7210,86 22,94
63 1053,52 25,25 134 1955,95 27,81 204 3741,63 20,1 274 8176,16 19,47
64 1055,61 25,7 135 2021,11 21,85 205 3768,77 31,84 275 8186,93 20,72
65 1082,55 23,75 136 2041,99 32,56 206 3782,94 22,68 276 8289,28 19,39
66 1082,65 26,15 137 2053,18 20,54 207 3788,04 25,24 277 9724,01 25,64
67 1083,5 27,14 138 2072,15 27,04 208 3792,76 27,25 278 12529 20,64
68 1083,55 25,61 139 2077,07 25,44 209 3819,82 32,74 279 14557,83 19,21
69 1085,63 36,39 140 2085,12 33,75 210 3881,87 24,56
70 1094,61 25,99 141 2140,12 20,56 211 3903,08 25,71 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
Nr Masse Migrationszeit FrequenzHäufigkeit je Gruppe
[g/mol] [min] unterschied Alzheimer Demenz Kontrollen
1 1073,35 34,96 0,45 0,45 0
2 1073,35 35,9 -0,48 0,46 0,94
3 1110,31 37,67 -0,44 0 0,44
4 1111,3 34,97 -0,41 0,27 0,69
5 1196,36 36,37 -0,44 0,31 0,75
6 1265,63 27,22 0,41 0,66 0,25
7 1322,44 36,2 0,44 0,75 0,31
8 1387,07 20,42 -0,41 0,09 0,5
9 1390,49 36,26 0,42 0,55 0,13
10 1423,57 29,85 0,48 0,79 0,31
11 1453,55 30,47 0,44 0,63 0,19
12 1490,43 35,48 0,42 0,79 0,38
13 1494,62 30,23 0,5 0,75 0,25
14 1819,86 23,51 -0,48 0,27 0,75
15 1927,02 21 0,48 0,67 0,19
16 2128,97 26,03 0,46 0,96 0,5
17 2214,22 26,48 0,52 0,83 0,31
18 2313,26 30,32 0,48 0,67 0,19
19 2423,19 27,03 0,41 0,6 0,19
20 2428,11 27,16 -0,45 0,36 0,81
21 2521,33 27,86 -0,44 0 0,44
22 2644,31 21,1 0,45 0,89 0,44
23 2706,37 28,3 0,46 0,71 0,25
24 3068,46 30,03 0,46 0,77 0,31
25 3079,61 37,02 -0,42 0,46 0,88
26 3153,38 35,65 0,46 0,71 0,25
27 3229,79 25,02 -0,44 0 0,44
28 3438,77 23,49 0,44 0,75 0,31
29 3481,8 30,62 0,45 0,89 0,44
30 3567,61 23,88 -0,44 0,18 0,63
31 3685,85 25,47 -0,44 0,18 0,63
32 3921,84 29,49 -0,41 0,09 0,5
33 4036,3 24,92 0,5 0,69 0,19
34 4038,22 20,53 -0,63 0 0,63
35 4093,96 21,04 0,5 0,63 0,13
36 4145,22 24,51 0,42 0,42 0
37 4372,3 19,37 -0,44 0,18 0,63
38 4377,95 30,81 0,5 0,63 0,13
39 4496,98 19,35 -0,41 0,09 0,5
40 4516 19,37 -0,45 0,36 0,81
41 4540,4 22 -0,41 0,09 0,5
42 4586,98 19,38 -0,41 0,27 0,69
43 4596,23 19,6 -0,47 0,09 0,56
44 4810,95 19,77 -0,44 0 0,44
45 5227,91 25,08 0,54 0,73 0,19
46 5582,16 24,3 0,4 0,4 0
47 6402,73 22,3 0,44 0,63 0,19
48 7749,32 19,97 -0,41 0,09 0,5
49 7760,02 28,72 0,46 0,71 0,25
50 10671 ,25 28,92 0,48 0,67 0,19
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der Amplitude der Marker 51-279 anhand folgender Referenzwerte erfolgt: Nr Masse Migrationszeit mittlere Amplitude je Gruppe Nr Masse [g/mol] Migrationszeit mittlere Amplitude je Gruppe
[g/mol] [min] Alzheimer | Kontrollen [min] Alzheimer | Kontrollen
51 824,48 19,92 568,85 501 ,97 128 1869,92 31 ,28 223,93 140,79
52 840,49 19,92 810,27 593,64 129 1873 21 ,26 440,7 270,85
53 846,38 25,96 100,62 122,25 130 1900,07 24,19 920,26 373,01
54 897,41 25,86 81 ,54 48,26 131 1914,07 25,67 1519,39 1746,72
55 911,3 34,1 242,62 247,96 132 1915,72 34,24 180,37 151 ,24
56 950,57 24,13 78,07 67,87 133 1917,03 24,99 197,09 216,02
57 973,26 35,47 179,96 150,04 134 1955,95 27,81 129,24 99,09
58 984,45 26,32 110,69 132,44 135 2021,11 21 ,85 346,14 257,95
59 988,57 35,65 211 ,75 188,31 136 2041,99 32,56 193,08 127,84
60 1013,43 25,18 175,63 104,85 137 2053,18 20,54 501 ,38 674,91
61 1016,3 35,53 909,17 810,15 138 2072,15 27,04 601 ,86 494,89
62 1041,58 36,79 86,97 139,71 139 2077,07 25,44 261 ,1 214,6
63 1053,52 25,25 87,43 46,52 140 2085,12 33,75 215,62 302,81
64 1055,61 25,7 277,17 465,99 141 2140,12 20,56 256,95 290,52
65 1082,55 23,75 78,89 50,53 142 2166,09 27,84 128,57 52,54
66 1082,65 26,15 112,48 104,55 143 2168,66 34,88 257,1 291 ,77
67 1083,5 27,14 118,51 108,08 144 2179,03 25,31 84,93 31 ,65
68 1083,55 25,61 271 ,44 164,33 145 2278,11 26,17 438,37 314,65
69 1085,63 36,39 140,8 145,98 146 2283,18 26,31 619,59 634,52
70 1094,61 25,99 460,11 418,75 147 2314,3 22,71 1018,08 1167,69
71 1130,37 35,19 670,41 372,37 148 2320,43 23,21 212,67 166,8
72 1130,63 27,07 115,03 78,26 149 2327,24 34,9 1737,42 1517,73
73 1135,56 27,03 60,46 58,13 150 2341,12 26,74 304,17 535,15
74 1150,61 26,55 80,41 45,34 151 2343,24 34,95 270,79 236,16
75 1158,62 27,02 68,79 40,98 152 2368,24 21 ,24 101 ,48 105,72
76 1183,66 27,49 110,3 73,65 153 2377,25 28,07 2711,11 1749,4
77 1186,56 27,21 315,86 221 ,73 154 2390,26 27,33 617,62 500,67
78 1217,56 21 ,8 90,54 80,33 155 2392,73 35,48 512,31 482,03
79 1229,62 27,38 99,75 62,81 156 2409,28 27,64 275,81 159,58
80 1250,61 27,59 455,17 151 ,8 157 2410,3 30,62 338,59 232,89
81 1276,43 35,7 1739,68 1000,12 158 2448,39 21 ,07 488,24 440,74
82 1283,4 35,91 104,76 53 159 2475,21 27,09 757,06 535,45
83 1300,67 29,7 120,17 58,65 160 2475,27 24,74 478,15 297,04
84 1306,74 22,16 552,66 320,23 161 2486,04 35,76 2280,47 1824,17
85 1333,44 35,93 268,17 204,63 162 2500,33 19,99 110,01 94,92
86 1342,44 35,43 275,61 325,49 163 2521,36 19,26 516,08 635,2
87 1347,71 28,94 83,29 67,88 164 2522,35 27,9 4135,44 3306,09
88 1349,67 28,25 363,22 580,39 165 2527,42 19,79 393,22 500,27
89 1360,67 28,06 90,7 94,56 166 2549,29 27,66 99,25 108,48
90 1386,68 28,62 366,31 404,69 167 2584,37 35,6 451 ,18 260,07
91 1388,74 27,97 319,52 394,09 168 2684,32 21 ,38 1926,21 155,86
92 1399,44 36,06 179,15 82,16 169 2698,41 22,52 182,49 220,4
93 1404,73 29,49 165,77 108,43 170 2799,17 25,07 445,75 375,83
94 1409,63 22,11 288,37 317,52 171 2816,31 28,74 1366,84 1928,38
95 1449,7 22,04 77,35 102,04 172 2851,42 27,7 495,9 288,67
96 1451,72 28,84 111 ,94 52,91 173 2923,51 36,73 818,47 883,22
97 1464,7 30,57 1169,16 1453,9 174 2982,72 19,97 3750,78 5523,72
98 1464,7 30,57 1346,04 1453,9 175 3019,54 24,72 170,57 189,58
99 1475,77 30,05 216,71 146,11 176 3173,68 22,95 155,36 252,28
100 1499,74 29,89 104,53 57,36 177 3192,67 37,66 689,53 1089,16
101 1519,76 31 ,87 392,54 271 ,33 178 3215,61 28,53 1305,23 2016,28
102 1535,74 30 2366,44 3661,09 179 3218,4 30,31 1384,58 1875,79
103 1542,78 23,24 713,91 533,83 180 3221,59 22,7 170,45 217,24
104 1550,67 27,47 576,53 637,58 181 3279,66 25,32 141 ,5 83
105 1552,61 30,78 176,95 110,5 182 3282,34 36,05 1082,36 1351,09
106 1590,81 32,46 1491,15 1260,68 183 3298,42 36,17 268,81 282,69
107 1596,83 30,32 873,36 577,23 184 3302,68 23,31 316,81 508,67
108 1614,84 31 ,54 688,7 410,65 185 3324,7 21 ,62 422,39 490,7
109 1623,65 31 ,1 697,2 364,52 186 3386,77 22,21 670,34 395,98
110 1628,8 20,75 304,52 326,72 187 3401,73 23,48 2618,95 4622,56
111 1636,79 22,71 1006,43 814,9 188 3408,76 26,04 175,22 94,81
112 1659,81 27,41 589,62 358,41 189 3462,68 21 ,25 2161,32 2653,08
113 1692,91 31 ,38 127,4 95,57 190 3466,75 23,9 904,51 559,21
114 1703,89 33,01 287,84 258,89 191 3524,8 31 ,72 1130,3 410,29
115 1727,92 32,13 552,58 276,12 192 3529,84 23,7 1979,26 2916,13
116 1732,88 31 ,36 596,19 543,08 193 3595,77 23,89 344,53 455,24
117 1738,68 32,16 92,84 40,42 194 3605,4 21 ,53 321 ,29 479,63
118 1741,83 30,56 114,01 84,13 195 3614,82 22,01 161 ,46 267,85
119 1756,89 19,81 176,68 85,89 196 3644,79 29,39 1038,75 749,16
120 1771,97 30,02 328,73 214,56 197 3645,25 26,69 1161,31 741 ,33
121 1800,02 25 516,9 674,37 198 3650,74 19,9 1029,39 1161,19
122 1816,98 33,53 395,82 180,33 199 3672,71 21,9 1896,48 819,91
123 1820,06 32,23 107,09 76,57 200 3677,74 24,3 1717,39 1567,09
124 1841,77 36,26 847,46 1396,48 201 3685,86 22,21 9259,98 16077,47
125 1849,68 18,31 405,84 688,91 202 3687,78 20,58 832,51 1095,77
126 1850,96 31 ,97 116,29 133,34 203 3693,93 27,15 344,49 218,63
127 1867,72 33,07 1356,26 956,64 204 3741,63 20,1 547,74 806,46
205 3768,77 31,84 533,93 377,59
206 3782,94 22,68 360,79 364,04
207 3788,04 25,24 609,58 782,85
208 3792,76 27,25 682,32 432,09
209 3819,82 32,74 120,7 133,76
210 3881,87 24,56 3257,71 1968,09
211 3903,08 25,71 2177,14 2780,86
212 3905,8 27,72 23257,92 16304,43
213 3929,73 23,07 2742,02 3430,19
214 3934,76 24,02 653,19 487,54
215 3951,07 22,77 25509,01 32844,44
216 4005,54 22,57 566,89 387,06
217 4087,12 26,92 607,44 490,16
218 4112,78 24,46 267,94 308,15
219 4131,68 22,54 653,71 586,61
220 4164,86 25,11 781,59 466,12
221 4192,99 34,95 1761,93 1496,61
222 4203,13 26,14 613,9 1051,15
223 4218,31 20,6 939,4 1360,44
224 4232,32 32,35 318,48 349,1
225 4250 27,68 504,35 286,25
226 4278 25,3 1161,81 745,21
227 4301,93 21,26 476,37 698,84
228 4307,09 31,58 157,37 88,2
229 4349,06 28,17 15449,01 7992,31
230 4384,07 19,8 465,18 981,39
231 4428,79 32,86 827,48 433,08
232 4464,64 21,54 4084,32 2311,8
233 4468,61 23,47 3429,99 2945,88
234 4510,97 28,56 1157,68 629,08
235 4548,03 25,95 3177,96 2703,21
236 4562 29,31 509,94 403,2
237 4562 29,31 574,68 403,2
238 4564,18 26,01 497,67 438,34
239 4583,84 24,2 7608,37 7241,51
240 4637,81 27,82 337,27 294,89
241 4730,71 19,63 797,93 1759,4
242 4749,41 21,81 725,74 426,89
243 4750,06 19,53 4365,88 3189,94
244 4890,59 23,27 1965,12 1418,61
245 4933,64 20,57 878,93 735,48
246 4986,98 21,35 637,73 533,05
247 5039,63 25,68 1039,64 1389,17
248 5042,1 24,31 3686,99 3120,74
249 5060,4 20,09 3307,86 1942,65
250 5110,36 25,28 637,44 697,57
251 5122,44 20,75 1342 851,23
252 5157,79 34,26 200,52 208,01
253 5181,63 25,36 5716,39 4305,72
254 5258,56 22,09 12476,68 10602,4
255 5439,46 25,41 713,92 522,3
256 5495,33 31,72 1776,93 1297,43
257 5660,6 31,55 893,02 595,49
258 5745,2 19,72 851,4 1608,76
259 5891,27 24,16 482,2 422,63
260 6224,17 25,27 1104,36 995,62
261 6327,46 22,03 1410,46 1027,79
262 6498,75 20,1 3989,56 2972,62
263 6611,97 28,44 311,21 338,55
264 6617,76 24,03 2799,82 1943,58
265 6813,98 23,14 4217,01 3699,9
266 6881,81 21,72 450,1 868,21
267 6893,8 24,57 2537,57 1569,65
268 6985,31 21,87 2238,63 1577,04
269 7026,99 22,02 2132,66 1480,92
270 7049,04 22,79 8522,63 6229,31
271 7106,83 23 766,91 575,59
272 7142,49 21,32 1014,86 557,95
273 7210,86 22,94 915,21 568,24
274 8176,16 19,47 11495,92 7835,63
275 8186,93 20,72 1706,07 1130,11
276 8289,28 19,39 4317,47 3227,21
277 9724,01 25,64 3380,24 1957,82
278 12529 20,64 38234,95 9397,12
279 14557,83 19,21 1514,79 2225,19 4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens drei oder mindestens vier oder mindestens fünf oder mindestens zehn oder alle Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Probe eines Indivi- duums eine Blutprobe (Serum- oder Plasmaprobe), oder eine Liquorprobe
(Cerebrospinalflüssigkeit) ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei vor der Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
9. Verwendung mindestens eines Polypeptidmarkers ausgewählt aus den Markern Nr. 1 bis 279, der durch die folgenden Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert ist
Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit
[g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min]
1 1073,35 34,96 71 1130,37 35,19 142 2166,09 27,84 212 3905,8 27,72
2 1073,35 35,9 72 1130,63 27,07 143 2168,66 34,88 213 3929,73 23,07
3 1110,31 37,67 73 1135,56 27,03 144 2179,03 25,31 214 3934,76 24,02
4 1111,3 34,97 74 1150,61 26,55 145 2278,11 26,17 215 3951,07 22,77
5 1196,36 36,37 75 1158,62 27,02 146 2283,18 26,31 216 4005,54 22,57
6 1265,63 27,22 76 1183,66 27,49 147 2314,3 22,71 217 4087,12 26,92
7 1322,44 36,2 77 1186,56 27,21 148 2320,43 23,21 218 4112,78 24,46
8 1387.Q7 20,42 78 1217,56 21,8 149 2327,24 34,9 219 4131,68 22,54
9 1390,49 36,26 79 1229,62 27,38 150 2341,12 26,74 220 4164,86 25,11
1Q 1423,57 29,85 80 1250,61 27,59 151 2343,24 34,95 221 4192,99 34,95
11 1453,55 30,47 81 1276,43 35,7 152 2368,24 21,24 222 4203,13 26,14
12 1490,43 35,48 82 1283,4 35,91 153 2377,25 28,07 223 4218,31 20,6
13 1494,62 30,23 83 1300,67 29,7 154 2390,26 27,33 224 4232,32 32,35
14 1819,86 23,51 84 1306,74 22,16 155 2392,73 35,48 225 4250 27,68
15 1927,02 21 85 1333,44 35,93 156 2409,28 27,64 226 4278 25,3
16 2128,97 26,03 86 1342,44 35,43 157 2410,3 30,62 227 4301,93 21,26
17 2214,22 26,48 87 1347,71 28,94 158 2448,39 21,07 228 4307,09 31,58
18 2313,26 30,32 88 1349,67 28,25 159 2475,21 27,09 229 4349,06 28,17
19 2423,19 27,03 89 1360,67 28,06 160 2475,27 24,74 230 4384,07 19,8
2Q 2428,11 27,16 90 1386,68 28,62 161 2486,04 35,76 231 4428,79 32,86
21 2521,33 27,86 91 1388,74 27,97 162 2500,33 19,99 232 4464,64 21,54
22 2644,31 21,1 92 1399,44 36,06 163 2521 ,36 19,26 233 4468,61 23,47
23 2706,37 28,3 93 1404,73 29,49 164 2522,35 27,9 234 4510,97 28,56
24 3068,46 30,03 94 1409,63 22,11 165 2527,42 19,79 235 4548,03 25,95
25 3079,61 37,02 95 1449,7 22,04 166 2549,29 27,66 236 4562 29,31
26 3153,38 35,65 96 1451,72 28,84 167 2584,37 35,6 237 4562 29,31
27 3229,79 25,02 97 1464,7 30,57 168 2684,32 21,38 238 4564,18 26,01
28 3438,77 23,49 99 1475,77 30,05 169 2698,41 22,52 239 4583,84 24,2
29 3481,8 30,62 100 1499,74 29,89 170 2799,17 25,07 240 4637,81 27,82
3Q 3567,61 23,88 101 1519,76 31,87 171 2816,31 28,74 241 4730,71 19,63
31 3685,85 25,47 102 1535,74 30 172 2851 ,42 27,7 242 4749,41 21,81
32 3921,84 29,49 103 1542,78 23,24 173 2923,51 36,73 243 4750,06 19,53
33 4036,3 24,92 104 1550,67 27,47 174 2982,72 19,97 244 4890,59 23,27
34 4038,22 20,53 105 1552,61 30,78 175 3019,54 24,72 245 4933,64 20,57
35 4093,96 21,04 106 1590,81 32,46 176 3173,68 22,95 246 4986,98 21,35
36 4145,22 24,51 107 1596,83 30,32 177 3192,67 37,66 247 5039,63 25,68
37 4372,3 19,37 108 1614,84 31,54 178 3215,61 28,53 248 5042,1 24,31
38 4377,95 30,81 109 1623,65 31,1 179 3218,4 30,31 249 5060,4 20,09
39 4496,98 19,35 110 1628,8 20,75 180 3221 ,59 22,7 250 5110,36 25,28
4Q 4516 19,37 111 1636,79 22,71 181 3279,66 25,32 251 5122,44 20,75
41 4540,4 22 112 1659,81 27,41 182 3282,34 36,05 252 5157,79 34,26
42 4586,98 19,38 113 1692,91 31,38 183 3298,42 36,17 253 5181,63 25,36
43 4596,23 19,6 114 1703,89 33,01 184 3302,68 23,31 254 5258,56 22,09
44 4810,95 19,77 115 1727,92 32,13 185 3324,7 21,62 255 5439,46 25,41
45 5227,91 25,08 116 1732,88 31,36 186 3386,77 22,21 256 5495,33 31,72
46 5582,16 24,3 117 1738,68 32,16 187 3401 ,73 23,48 257 5660,6 31,55
47 6402,73 22,3 118 1741,83 30,56 188 3408,76 26,04 258 5745,2 19,72
48 7749,32 19,97 119 1756,89 19,81 189 3462,68 21,25 259 5891,27 24,16
49 7760,02 28,72 120 1771,97 30,02 190 3466,75 23,9 260 6224,17 25,27
5Q 10671,25 28,92 121 1800,02 25 191 3524,8 31,72 261 6327,46 22,03
51 824,48 19,92 122 1816,98 33,53 192 3529,84 23,7 262 6498,75 20,1
52 840,49 19,92 123 1820,06 32,23 193 3595,77 23,89 263 6611,97 28,44
53 846,38 25,96 124 1841,77 36,26 194 3605,4 21,53 264 6617,76 24,03
54 897,41 25,86 125 1849,68 18,31 195 3614,82 22,01 265 6813,98 23,14
55 911,3 34,1 126 1850,96 31,97 196 3644,79 29,39 266 6881,81 21,72
56 950,57 24,13 127 1867,72 33,07 197 3645,25 26,69 267 6893,8 24,57
57 973,26 35,47 128 1869,92 31,28 198 3650,74 19,9 268 6985,31 21,87
58 984,45 26,32 129 1873 21,26 199 3672,71 21,9 269 7026,99 22,02
59 988,57 35,65 130 1900,07 24,19 200 3677,74 24,3 270 7049,04 22,79
6Q 1013,43 25,18 131 1914,07 25,67 201 3685,86 22,21 271 7106,83 23
61 1016,3 35,53 132 1915,72 34,24 202 3687,78 20,58 272 7142,49 21,32
62 1041,58 36,79 133 1917,03 24,99 203 3693,93 27,15 273 7210,86 22,94
63 1053,52 25,25 134 1955,95 27,81 204 3741 ,63 20,1 274 8176,16 19,47
64 1055,61 25,7 135 2021,11 21,85 205 3768,77 31,84 275 8186,93 20,72
65 1082,55 23,75 136 2041,99 32,56 206 3782,94 22,68 276 8289,28 19,39
66 1082,65 26,15 137 2053,18 20,54 207 3788,04 25,24 277 9724,01 25,64
67 1083,5 27,14 138 2072,15 27,04 208 3792,76 27,25 278 12529 20,64
68 1083,55 25,61 139 2077,07 25,44 209 3819,82 32,74 279 14557,83 19,21
69 1085,63 36,39 140 2085,12 33,75 210 3881 ,87 24,56
7Q 1094,61 25,99 141 2140,12 20,56 211 3903,08 25,71 zur Diagnose von Alzheimer. Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit Nr Masse Migarationszeit
[g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min] [g/mol] [min]
1 1073,35 34,96 71 1130,37 35,19 142 2166,09 27,84 212 3905,8 27,72
2 1073,35 35,9 72 1130,63 27,07 143 2168,66 34,88 213 3929,73 23,07
3 1110,31 37,67 73 1135,56 27,03 144 2179,03 25,31 214 3934,76 24,02
4 1111,3 34,97 74 1150,61 26,55 145 2278,11 26,17 215 3951,07 22,77
5 1196,36 36,37 75 1158,62 27,02 146 2283,18 26,31 216 4005,54 22,57
6 1265,63 27,22 76 1183,66 27,49 147 2314,3 22,71 217 4087,12 26,92
7 1322,44 36,2 77 1186,56 27,21 148 2320,43 23,21 218 4112,78 24,46
8 1387,07 20,42 78 1217,56 21,8 149 2327,24 34,9 219 4131,68 22,54
9 1390,49 36,26 79 1229,62 27,38 150 2341,12 26,74 220 4164,86 25,11
1Q 1423,57 29,85 80 1250,61 27,59 151 2343,24 34,95 221 4192,99 34,95
11 1453,55 30,47 81 1276,43 35,7 152 2368,24 21,24 222 4203,13 26,14
12 1490,43 35,48 82 1283,4 35,91 153 2377,25 28,07 223 4218,31 20,6
13 1494,62 30,23 83 1300,67 29,7 154 2390,26 27,33 224 4232,32 32,35
14 1819,86 23,51 84 1306,74 22,16 155 2392,73 35,48 225 4250 27,68
15 1927,02 21 85 1333,44 35,93 156 2409,28 27,64 226 4278 25,3
16 2128,97 26,03 86 1342,44 35,43 157 2410,3 30,62 227 4301,93 21,26
17 2214,22 26,48 87 1347,71 28,94 158 2448,39 21,07 228 4307,09 31,58
18 2313,26 30,32 88 1349,67 28,25 159 2475,21 27,09 229 4349,06 28,17
19 2423,19 27,03 89 1360,67 28,06 160 2475,27 24,74 230 4384,07 19,8
2Q 2428,11 27,16 90 1386,68 28,62 161 2486,04 35,76 231 4428,79 32,86
21 2521,33 27,86 91 1388,74 27,97 162 2500,33 19,99 232 4464,64 21,54
22 2644,31 21,1 92 1399,44 36,06 163 2521 ,36 19,26 233 4468,61 23,47
23 2706,37 28,3 93 1404,73 29,49 164 2522,35 27,9 234 4510,97 28,56
24 3068,46 30,03 94 1409,63 22,11 165 2527,42 19,79 235 4548,03 25,95
25 3079,61 37,02 95 1449,7 22,04 166 2549,29 27,66 236 4562 29,31
26 3153,38 35,65 96 1451,72 28,84 167 2584,37 35,6 237 4562 29,31
27 3229,79 25,02 97 1464,7 30,57 168 2684,32 21,38 238 4564,18 26,01
28 3438,77 23,49 99 1475,77 30,05 169 2698,41 22,52 239 4583,84 24,2
29 3481,8 30,62 100 1499,74 29,89 170 2799,17 25,07 240 4637,81 27,82
3Q 3567,61 23,88 101 1519,76 31,87 171 2816,31 28,74 241 4730,71 19,63
31 3685,85 25,47 102 1535,74 30 172 2851,42 27,7 242 4749,41 21,81
32 3921,84 29,49 103 1542,78 23,24 173 2923,51 36,73 243 4750,06 19,53
33 4036,3 24,92 104 1550,67 27,47 174 2982,72 19,97 244 4890,59 23,27
34 4038,22 20,53 105 1552,61 30,78 175 3019,54 24,72 245 4933,64 20,57
35 4093,96 21,04 106 1590,81 32,46 176 3173,68 22,95 246 4986,98 21,35
36 4145,22 24,51 107 1596,83 30,32 177 3192,67 37,66 247 5039,63 25,68
37 4372,3 19,37 108 1614,84 31,54 178 3215,61 28,53 248 5042,1 24,31
38 4377,95 30,81 109 1623,65 31,1 179 3218,4 30,31 249 5060,4 20,09
39 4496,98 19,35 110 1628,8 20,75 180 3221 ,59 22,7 250 5110,36 25,28
4Q 4516 19,37 111 1636,79 22,71 181 3279,66 25,32 251 5122,44 20,75
41 4540,4 22 112 1659,81 27,41 182 3282,34 36,05 252 5157,79 34,26
42 4586,98 19,38 113 1692,91 31,38 183 3298,42 36,17 253 5181,63 25,36
43 4596,23 19,6 114 1703,89 33,01 184 3302,68 23,31 254 5258,56 22,09
44 4810,95 19,77 115 1727,92 32,13 185 3324,7 21,62 255 5439,46 25,41
45 5227,91 25,08 116 1732,88 31,36 186 3386,77 22,21 256 5495,33 31,72
46 5582,16 24,3 117 1738,68 32,16 187 3401 ,73 23,48 257 5660,6 31,55
47 6402,73 22,3 118 1741,83 30,56 188 3408,76 26,04 258 5745,2 19,72
48 7749,32 19,97 119 1756,89 19,81 189 3462,68 21,25 259 5891,27 24,16
49 7760,02 28,72 120 1771,97 30,02 190 3466,75 23,9 260 6224,17 25,27
5Q 10671,25 28,92 121 1800,02 25 191 3524,8 31,72 261 6327,46 22,03
51 824,48 19,92 122 1816,98 33,53 192 3529,84 23,7 262 6498,75 20,1
52 840,49 19,92 123 1820,06 32,23 193 3595,77 23,89 263 6611,97 28,44
53 846,38 25,96 124 1841,77 36,26 194 3605,4 21,53 264 6617,76 24,03
54 897,41 25,86 125 1849,68 18,31 195 3614,82 22,01 265 6813,98 23,14
55 911,3 34,1 126 1850,96 31,97 196 3644,79 29,39 266 6881,81 21,72
56 950,57 24,13 127 1867,72 33,07 197 3645,25 26,69 267 6893,8 24,57
57 973,26 35,47 128 1869,92 31,28 198 3650,74 19,9 268 6985,31 21,87
58 984,45 26,32 129 1873 21,26 199 3672,71 21,9 269 7026,99 22,02
59 988,57 35,65 130 1900,07 24,19 200 3677,74 24,3 270 7049,04 22,79
6Q 1013,43 25,18 131 1914,07 25,67 201 3685,86 22,21 271 7106,83 23
61 1016,3 35,53 132 1915,72 34,24 202 3687,78 20,58 272 7142,49 21,32
62 1041,58 36,79 133 1917,03 24,99 203 3693,93 27,15 273 7210,86 22,94
63 1053,52 25,25 134 1955,95 27,81 204 3741,63 20,1 274 8176,16 19,47
64 1055,61 25,7 135 2021,11 21,85 205 3768,77 31,84 275 8186,93 20,72
65 1082,55 23,75 136 2041,99 32,56 206 3782,94 22,68 276 8289,28 19,39
66 1082,65 26,15 137 2053,18 20,54 207 3788,04 25,24 277 9724,01 25,64
67 1083,5 27,14 138 2072,15 27,04 208 3792,76 27,25 278 12529 20,64
68 1083,55 25,61 139 2077,07 25,44 209 3819,82 32,74 279 14557,83 19,21
69 1085,63 36,39 140 2085,12 33,75 210 3881,87 24,56
70 1094,61 25,99 141 2140,12 20,56 211 3903,08 25,71
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