EP1866648A2 - Polypeptidmarker zur diagnose von prostatakrebs - Google Patents

Polypeptidmarker zur diagnose von prostatakrebs

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Publication number
EP1866648A2
EP1866648A2 EP06725599A EP06725599A EP1866648A2 EP 1866648 A2 EP1866648 A2 EP 1866648A2 EP 06725599 A EP06725599 A EP 06725599A EP 06725599 A EP06725599 A EP 06725599A EP 1866648 A2 EP1866648 A2 EP 1866648A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
markers
polypeptide
sample
prostate cancer
absence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP06725599A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald Mischak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG filed Critical Mosaiques Diagnostics and Therapeutics AG
Priority to EP10183096A priority Critical patent/EP2317320A3/de
Priority to EP06725599A priority patent/EP1866648A2/de
Publication of EP1866648A2 publication Critical patent/EP1866648A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate

Definitions

  • the present invention relates to the use of the presence or absence of one or more peptide markers in a sample of an individual for the diagnosis of prostate cancer (PCA) and a method for the diagnosis of prostate cancer, wherein the presence or absence of the peptide marker (s) is indicative of the presence of prostate cancer.
  • PCA prostate cancer
  • carcinoma of the prostate is one of the most common cancers in men. Since it comes to complaints only in the stage of advanced disease, the cancer can only be diagnosed by early screening tests (palpation findings and PSA (prostate specific antigen) in the blood) in the early stages. To confirm the suspected diagnosis, a tissue sample is taken by means of fine needle biopsy.
  • carcinoma Much more common than carcinoma is a benign tumor (adenoma) of the prostate, benign prostatic hyperplasia (BPH). According to the prior art, it can be distinguished only very unreliable about the PSA value of a malignant carcinoma. Again, a biopsy must be done in order to make a clear diagnosis.
  • WO 03/027710 describes protein biomarkers for the differentiation of prostate cancer cells and BPH.
  • the application describes markers that have large blurs (in the range of more than ⁇ 0.5%). From the large number of molecules in this area, assignment to individual markers is virtually impossible due to inaccurate information.
  • the sample material used is preferably a cell lysate from prostatic epithelial cells, which requires expensive sampling. Due to the large number of proteins included in the definition and the difficulty of sampling, the method is not very suitable.
  • WO 01/25791 describes methods for the diagnosis of prostate carcinomas using markers.
  • the above-mentioned markers are derived from the protein semenogelin I.
  • the stated masses are only determined with an accuracy of ⁇ 0.5%. Studies show that the mentioned markers are unsuitable.
  • certain peptide markers can be used in a sample of an individual for the diagnosis of prostate cancer and for the differential diagnosis to distinguish between prostate cancer and benign prostatic hyperplasia (BPH).
  • the samples may be urine or seminal fluid samples taken non-invasively.
  • an object of the present invention is the use of the presence or absence of at least three polypeptide markers in a sample of an individual for the diagnosis of prostate cancer, wherein the polypeptide marker is selected from the polypeptide markers Nos. 1 to 115, by the in Table 1 molecular weights and their migration times are characterized.
  • PCA prostate cancer
  • the present invention it is possible to diagnose prostate cancer very early.
  • the disease can be treated at an early stage by known methods.
  • the invention further enables a cost-effective, fast and reliable diagnosis in some cases not or only minimally invasive procedures.
  • Another object of the invention is the differential diagnosis to distinguish between prostate cancer and a BPH.
  • the differential diagnosis Nose can occur by the use of the presence or absence of at least three polypeptide markers in a sample of an individual, the polypeptide marker being selected from polypeptide markers 52-78 characterized by the molecular masses and migration times shown in Table 2. Preferably, more markers are used.
  • Table 2 Polypeptide markers for the differential diagnosis of prostate cancer or BPH, their molecular masses and migration times.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. determined in example under point 2).
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • the eluent used is 30% methanol, 0.5% formic acid in water.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may be, for example, the polypeptides given in the examples (see Example 3).
  • the characterization of the polypeptides shown in Tables 1 to 2 was determined by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS), a procedure described in detail, for example, by Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • the variation of molecular masses between individual measurements or between different mass spectrometers is relatively small with exact calibration, typically in the range of ⁇ 0.03%, preferably in the range of ⁇ 0.01%.
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, e.g. by post-translational modifications such as glycation, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or by other reactions, e.g. in the context of mining, to be changed. In addition, the polypeptide markers may also be chemically altered as part of the purification of the samples, e.g. oxidized, be. Based on the parameters that determine the polypeptide markers (molecular mass and migration time), it is possible to identify the sequence of the corresponding polypeptides by methods known in the art.
  • polypeptides of the invention are used to diagnose prostate cancer. Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury. In the present case, the presence or absence of certain polypeptide markers is inferred for the presence of prostate cancer.
  • the polypeptide markers of the invention are determined in a sample of an individual, wherein, in the case of frequency markers, their presence or absence suggests the presence of prostate cancer. The presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold may be determined either by the sensitivity of the measurement driving (detection limit) can be determined or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a particular molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of prostate cancer (frequency marker).
  • polypeptide markers that are typically present in patients with prostate cancer (ill), such as polypeptide markers Nos. 1 to 11, but are absent in subjects without prostate cancer (control).
  • the amplitude markers indicated in Table 4 can also be used for the diagnosis of prostate cancer (Numbers 45-51, 79-115). Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups. Table 5 shows the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. In order to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • All groups used consist of at least 20 individual patient or control samples to obtain a reliable mean amplitude.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of each polypeptide marker in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the PCA group. If the amplitude corresponds more closely to the mean amplitudes of the PCA group, it can be assumed that a PCA corresponds to the average amplitudes of the control group and is not to be assumed to be a PCA. A more precise definition should be given using marker no. 48 (Table 4). The mean amplitude of the marker is markedly increased in PCA (2600 ppm vs. 1600 ppm in the control group).
  • the value for this marker is 0 to 1600 ppm, or a maximum of 20% moreover, ie 0 to 1920 ppm, this sample belongs to the control group. If the value is 2600 ppm, or 20% lower, or higher, ie between 2080 and very high values, PCA can be assumed.
  • Table 5 shows polypeptide markers that are typically present in patients with prostate cancer, such as markers Nos. 52 through 58, but are absent or rare in subjects with BPH. Furthermore, there are polypeptide markers that are present in individuals with BPH, but more rarely or not at all in individuals with PCA, eg, polypeptide markers Nos. 59-78.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence or amplitude of one or more polypeptide markers is determined may be any individual who may be suffering from prostate cancer, eg an animal or a human.
  • the subject is a mammal such as a dog or a horse, most preferably a human.
  • a polypeptide marker for the application of the invention, not only a polypeptide marker but a combination of markers is used to diagnose prostate cancer. It is concluded by their presence or absence and / or the magnitude of the amplitude on the presence of prostate cancer. By comparing a plurality of polypeptide markers, the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the patient or control individual.
  • the sample measuring the presence or absence or amplitude of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition capable of making statements about the condition of the individual (prostate cancer or not).
  • it may be urine, sperm, seminal fluid (semen without sperm).
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample may be detected by any method known in the art useful for measuring polypeptide levels. markers is determined. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as mass spectrometry or indirect methods such as by ligands. If necessary or desirable, the sample of the subject, eg, the urine sample, may be pretreated and, for example, purified or separated, prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) by any suitable means. The treatment may include, for example, purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by ion exchange chromatography, or electrophoretic separation.
  • specific examples thereof are gel electrophoresis, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE), capillary electrophoresis, metal affinity chromatography, immobilized metal affinity chromatography (IMAC), lectin affinity chromatography, liquid chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), normal and reverse phases -H PLC, cation exchange chromatography and selective bonding to surfaces. All of these methods are well known to those skilled in the art and one skilled in the art will be able to select the method depending on the sample used and the method for determining the presence or absence of the polypeptide marker (s).
  • the sample is separated before its measurement by capillary electrophoresis, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing Polypeptidmarker certain molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, ie 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. In mass spectrometers, an ion-forming unit is coupled to a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used to analyze the resulting ions.
  • electrospray ionization the molecules present in solution i.a. is sprayed under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets, which become smaller due to evaporation of the solvent.
  • high voltage e.g. 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • a particularly preferred method is CE-MS, in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr.
  • CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of prostate cancer and the differential diagnosis between prostate cancer and BPH. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • solvents for CE-MS, the use of volatile solvents is preferred, and it is best to work under essentially salt-free conditions.
  • suitable solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and treated with a weak acid (eg 0.1% to 1% formic acid) to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • the advantage of capillaries in electrophoresis is the favorable surface-to-volume ratio, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries exist in the Usually made of plastic coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, ie show their hydrophilic groups on the inside, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can be used for the diagnosis of prostate cancer in the method according to the invention.
  • at least three polypeptide markers may be used, for example, markers 1, 2 and 3; 1, 2 and 4; etc.
  • markers can also be used for the differential diagnosis between PCA and BPH.
  • at least three polypeptide markers may be used, for example, markers 45, 46 and 47; 45, 46 and 48; etc. More preferred is the use of at least 4, 5, or 6 markers.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for prostate cancer. Urine was withdrawn from healthy donors (peer group) as well as patients suffering from prostate cancer or BPH.
  • proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration.
  • 500 ⁇ l of urine were removed and mixed with 2 ml of filtration buffer (4M urea, 0.1M NaCl, 0.01% ammonia). These 2.5 ml sample volumes were ultrafiltered (Amicon 30 kDa, Millipore, Bedford USA). The UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 2 ml ultrafiltrate was obtained.
  • CE-MS Measurement The CE-MS measurements were performed using a Beckman Coulter capillary electrophoresis system (Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and a Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik , Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE The solution consisted of 30% methanol and 0.5% formic acid in water.
  • 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used, here with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was realized by a CE-ESI-MS sprayer kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE).
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "stacking" technique was used. An IM NH 3 solution is injected for 7 seconds (at 1 psi) prior to sample injection, and after injection of the sample for 5 seconds, a 2M formic acid solution is injected. After applying the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • CE separation was performed with a pressure method: 40 minutes at 0 psi, then 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 minutes for 2 minutes psi, finally 32 min at 0.5 psi.
  • the total duration of a separation run was thus 80 minutes.
  • the "Nebulizer gas" was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection.
  • the spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds. 3.
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV "REV”, "ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • WO 01/25791 discloses markers which are against the presence of a prostate carcinoma.
  • the number of possible fragments is shown in the following table:
  • FIG. 1 shows, by way of example for a mass, the multiplicity of sequences that are possible in this weight range.
  • FIG. 2 shows a determination of the amplitudes of the six markers found in this way. It turns out that there are no significant differences between prostate cancer patients and the control group. Subsequently, the discriminatory value of the biomarkers was examined by means of an ROC analysis (receiver operator characteristic curves).
  • FIG. 3a shows corresponding analyzes for six markers which are described in WO 01/25791 and could be found in urine samples.
  • FIG. 3b shows a corresponding ROC examination of the biomarkers according to the invention with Nos. 1 to 78 of the patent application.
  • FIG. 3c shows the ROC analysis of a subgroup of the markers according to the invention (16 markers).
  • FIG. 3d shows that even when only three biomarkers according to the invention are used, the significance is significantly higher than in WO 01/25791, the markers 24, 41 were used and 46.

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Abstract

Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit mindestens dreier Polypeptidmarkers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1 bis 44 und 52 bis 78 (Frequenzmarker), oder der Bestimmung der Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers, ausgewählt aus den Markern 45 bis 51 und 79-115 (Amplitudenmarker), die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind: Nummer Masse [Da] CE-Zeit Nummer Masse [Da] CE-Zeit 1 1579,7 26,4 27 1180,5 33,9 2 1991,9 17,1 28 2421,1 32,5 3 1955,9 24,8 29 4345,9 30,6 4 1140,5 21,4 30 2077,1 16,9 5 1677,3 7,4 31 1134,6 19,4 6 10753,1 13,6 32 1444,8 13,5 7 1412,6 22,1 33 1046,5 21,9 8 1636,8 27,2 34 1992,2 16,8 9 1946,9 28,4 35 4069,6 21,3 10 5887,6 25,1 36 1191,5 34,5 11 12407,9 22,2 37 1239,5 32,5 12 1186,6 17,4 38 2191,9 17,2 13 1240,6 23,3 39 1865,8 30,0 14 1326,6 24,8 40 1265,6 23,4 15 3802,1 30,1 41 1936,1 10,5 16 1749,9 19,4 42 911,3 31,9 17 2216,1 31,0 43 1494,7 26,4 18 1069,5 22,7 44 1209,6 22,5 19 1341,6 26,6 45 1193,3 34,2 20 1353,7 21,8 46 1235,4 34,3 21 1716,8 24,6 47 1390,5 35,0 22 2939,1 31,1 48 2292,1 23,7 23 3002,0 19,2 49 2736,3 17,1 24 1110,4 31,5 50 3385,5 21,0 25 1496,7 26,5 51 3945,2 21,4 26 1825,8 28,4 - 34 - Num me r Ma sse n (Da) CE-Ze it [min] Num m e r Masse n (Da) CE-Ze it [min] 52 1636,8 27,2 66 1878, 9 15, 3 53 1412,6 22,1 67 3593, 4 14, 5 54 1579,7 26,4 68 1236, 7 13, 3 55 1390,5 35,0 69 2736, 3 17, 1 56 1196,6 15,8 70 2973, 4 20, 0 57 11041,4 16,6 71 1134, 6 19, 4 58 2971,4 17,9 72 2191, 9 17, 2 59 3136,6 20,0 73 2205, 1 25, 1 60 4409,9 14,2 74 3959, 7 14, 0 61 1494,7 26,4 75 1749, 9 19, 4 62 1833,9 24,2 76 4069, 6 21, 3 63 2752,4 14,0 77 2816, 3 24, 7 64 3515,8 15,3 78 3435, 8 15, 0 65 1082,5 17,7 - 35 - Numme r Ma sse [Da ] CE-Ze i t [min] 79 973,26 35,44 80 1128,54 25,66 81 1173,58 37,47 82 1184,6 26,43 83 1290,39 30,85 84 1338,66 23,96 85 1428,45 36,73 86 1450,6 37,47 87 1460,71 19,83 88 1498,46 35,31 89 1526,76 23,54 90 1588,77 30,24 91 1675,77 29,23 92 1703,91 33,67 93 1808,87 23,72 94 1863,96 44,01 95 1867,79 33,29 96 1925,9 23,2 97 2036,97 31,53 98 2114,05 31,59 99 2196,11 33,16 100 2212,06 33,36 101 2257,95 36,02 102 2544,06 26,14 103 2599,21 28,05 104 2761,38 21,47 105 3334,17 31,01 106 3361,41 24,32 107 3426,43 27,73 108 3765,51 20,18 109 3864,56 33,82 110 3870,8 33,47 111 4252,03 28,77 112 6211,93 20,27 113 6650,86 25,55 114 6820,37 21,03 115 16918,24 19,8 , wobei es sich bei der Probe um eine Urinprobe oder Samenflüssigkeitspro- be handelt.

Description

Polvpeptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Prostata krebs (PCA) sowie ein Verfahren zur Diagnose von Prostata krebs, wobei die An- oder Abwesenheit des oder der Peptidmarker(s) indikativ für das Vorliegen von Prostatakrebs ist.
Das Karzinom der Prostata (Vorsteherdrüse) ist eine der häufigsten Krebserkrankungen beim Mann. Da es erst im Stadium der fortgeschrittenen Erkrankung zu Beschwerden kommt, kann der Krebs nur durch regelmäßige Früherkennungsun- tersuchungen (Tastbefund und PSA-Wert (Prostate specific antigen) im Blut) im Frühstadium diagnostiziert werden. Zur Sicherung der Verdachtsdiagnose wird mittels Feinnadelbiopsie eine Gewebsprobe entnommen.
Für die Therapie stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung, die sich nach der Art und dem Stadium des Tumors sowie nach den individuellen Bedürfnissen des Patienten richten: Im frühen Stadium stehen die Seed-Implantation (minimal- invasive Einbringung von radioaktiven Jod 125- Strahlern in die Prostata) oder die operative Entfernung des Tumors und Bestrahlung von außen zur Verfügung.
Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung hat bei einem Drittel der Patienten bereits eine Metastasierung in andere Organe stattgefunden; die Erkrankung ist zu die- sem Zeitpunkt bereits kaum noch heilbar. Durch Strahlen-, Chemo- oder Hormontherapie (Kombinationen sind möglich) kann jedoch die weitere Ausbreitung des Krebses verzögert werden. Bei isoliertem Befall der Prostata, also wenn noch keine Absiedlung stattgefunden hat, ist die Prognose jedoch günstig.
Viel häufiger als das Karzinom tritt ein gutartiger Tumor (Adenom) der Prostata auf, die benigne Prostatahyperplasie (BPH). Nach dem Stand der Technik kann sie nur sehr unzuverlässig über den PSA-Wert von einem bösartigen Karzinom unterschieden werden. Auch hier muss eine Biopsie erfolgen, um eine klare Diagnose treffen zu können.
Wie bereits beschrieben, gibt es keine nichtinvasive und verlässliche Früherken- nung des Prostatakrebses. Eine klare Diagnose ist bisher mit invasiven Eingriffen wie der Biopsie verbunden. Es stellte sich also die Aufgabe, ein Verfahren und eine Methode zur möglichst wenig invasiven, schnellen und kostengünstigen Diagnose des Prostata krebses zu finden.
WO 03/027710 beschreibt Proteinbiomarker zur Unterscheidung von Prostatakar- zinomzellen und BPH. In der Anmeldung werden Marker beschrieben, die große Unscharfen aufweisen (im Bereich von mehr als ± 0,5%). Aus der Vielzahl von Molekülen in diesem Bereich ist aufgrund der ungenauen Angaben eine Zuordnung zu einzelnen Markern praktisch nicht möglich. Als Probenmaterial wird bevorzugt ein Zelllysat aus Prostataepithelzellen eingesetzt, was eine aufwendige Probenentnahme erfordert. Aufgrund der Vielzahl der von der Definition umfass- ten Proteine und der Schwierigkeit der Probenentnahme ist das Verfahren wenig geeignet.
WO 01/25791 beschreibt Verfahren zur Diagnose von Prostatakarzinomen unter Verwendung von Markern. Die genannten Marker entstammen dem Protein Se- menogelin I. Die angegebenen Massen sind nur mit einer Genauigkeit von ± 0,5% bestimmt. Untersuchungen zeigen, dass die genannten Marker ungeeignet sind.
Überraschender Weise wurde nun gefunden, das bestimmte Peptidmarker in einer Probe eines Individuums zur Diagnose von Prostatakrebs und zur Differen- tialdiagnose zur Unterscheidung von Prostatakrebs und benigner Prostatahyperplasie (BPH) verwendet werden können. Insbesondere können die Proben Urin- oder Samenflüssigkeitsproben sein, die nicht-invasiv entnommen werden.
Folglich ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der An- oder Abwesenheit mindestens drei Polypeptidmarker in einer Probe eines Indivi- duums zur Diagnose von Prostata krebs, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Polypeptidmarkern Nr. 1 bis 115, die durch die die in Tabelle 1 angegebenen Molekularmassen und ihre Migrationszeiten charakterisiert sind.
Tabelle 1: Polypeptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs (PCA) sowie ihre Molekularmassen und Migrationszeiten (CE-Zeit in Minuten):
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Prostatakrebs sehr frühzeitig zu diagnostizieren. Dadurch kann die Krankheit in einem frühen Stadium durch bekannte Verfahren therapiert werden. Die Erfindung ermöglicht weiterhin eine kostengünstige, schnelle und zuverlässige Diagnose bei zum Teil nicht oder nur minimal invasiven Eingriffen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Differentialdiagnose zur Unterscheidung zwischen dem Prostatakarzinom und einer BPH. Die Differentialdiag- nose kann durch die Verwendung der An- oder Abwesenheit von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Probe eines Individuums geschehen, wobei der PoIy- peptidmarker ausgewählt ist aus den Polypeptidmarkern 52-78, die durch die in Tabelle 2 angegebenen Molekularmassen und Migrationszeiten charakterisiert sind. Bevorzugt werden mehr Marker eingesetzt.
Tabelle 2: Polypeptidmarker zur Differentialdiagnose von Prostatakrebs oder BPH, ihre Molekularmassen und Migrationszeiten.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt- bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben. Als Laufmittel wird 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiel Punkt 3). Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen 1 bis 2 gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry, 2004, Bd. 20, Seite 149-156) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,03%, vorzugsweise im Bereich von ± 0,01%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein. Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide (siehe Tabelle 1 bis 5) werden verwendet, um Prostatakrebs zu diagnostizieren. Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird von der An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auf das Vorliegen von Prostatakrebs geschlossen. Hierzu werden die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker in einer Probe eines Individuums bestimmt, wobei, im Falle von Frequenzmarkern, ihre An- oder Abwesenheit auf das Vorliegen von Prostatakrebs schließen lässt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messver- fahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte MoIe- kularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für Prostatakrebs ist (Frequenzmarker). So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Patienten mit Prostatakrebs (krank) vorhanden sind, wie z.B. Polypeptidmarker Nr. 1 bis 11, jedoch bei Probanden ohne Prostatakrebs (Kontrolle) nicht vorhanden sind. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Individuen ohne Prostatakrebs vorhanden sind, jedoch bei Individuen mit Prostatakrebs seltener oder gar nicht auftreten, z.B. 12 bis 44 (Tabelle 3) Tabelle 3: Polypeptidmarker (Frequenzmarker) zur Diagnose von Prostatakrebs (PCA), ihre Molekularmassen und Migrationszeiten sowie ihre An- und Abwesenheit bei an Prostatakrebs erkrankten Patientengruppen sowie Kontrollgruppen als Faktor (1 = 100%, 0=0%; Probenaufarbeitung und Messung wie im Beispiel beschrieben).
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch die in Tabelle 4 angegebenen Amplitudenmarker zur Diagnose von Prostatakrebs verwendet werden (Nummer 45-51, 79-115). Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In Tabelle 5 sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben. Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patienten- oder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose (PCA oder nicht) fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptid marker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der PCA-Gruppe ist. Entspricht die Amplitude eher den mittleren Amplituden der PCA-Gruppe, ist von einem PCA auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einem PCA auszugehen. Eine genauere Definition soll anhand von Marker Nr. 48 (Tabelle 4) gegeben werden. Die mittlere Amplitude des Markers ist bei PCA deutlich erhöht (2600 ppm gegen 1600 ppm in der Kontrollgruppe). Liegt nun in einer Patienten probe der Wert für diesen Marker bei 0 bis 1600 ppm, bzw. maximal 20% darüber, also 0 bis 1920 ppm, gehört diese Probe zur Kontrollgruppe. Liegt der Wert bei 2600 ppm, bzw. 20% darunter, oder höher, also zwischen 2080 und sehr hohen Werten, ist von PCA auszugehen.
Je geringer der Abstand zwischen den Amplituden der Kontrollgruppe und der Alzheimer Gruppe, desto dichter muss der Wert, der zwischen den beiden Referenzwerten liegt, an einem Referenzwert liegen.
Eine Möglichkeit ist, den Bereich zwischen den mittleren Amplituden in drei Teile zu zerlegen. Liegt der Wert im unteren Drittel, ist dies indikativ für den unteren Wert, liegt der Wert im oberen Drittel, ist dies indikativ für den oberen Wert. Liegt er im mittleren Drittel, ist keine Aussage hinsichtlich dieses Markers möglich. Tabelle 4: Amplitudenmarker
Zur Differentialdiagnose zwischen PCA und BPH zeigt Tabelle 5 Polypeptid marker, die typischerweise bei Patienten mit Prostatakarzinom vorhanden sind, wie z.B. die Marker Nr. 52 bis 58, jedoch bei Probanden mit BPH nicht oder nur selten vorhanden sind. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Individuen mit BPH vorhanden sind, jedoch bei Individuen mit PCA seltener oder gar nicht auftreten, z.B. die Polypeptidmarker Nr. 59 bis 78.
Tabelle 5: Polypeptidmarker (Frequenzmarker) zur Differentialdiagnose zwischen Prostatakrebs (PCA) und BPH, ihre Molekularmassen und Migrationszeiten sowie ihre An- und Abwesenheit bei an Prostatakrebs erkrankten Patientengruppen sowie der BPH-Gruppe als Faktor (1=100%, 0=0%; Probenaufarbeitung und Messung wie im Beispiel beschrieben).
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit oder die Amplitude eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an Prostatakrebs leiden kann, z.B. ein Tier oder ein Mensch. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, wie z.B. einen Hund oder ein Pferd, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
Für die Anwendung der Erfindung wird nicht nur ein Polypeptidmarker, sondern eine Kombination von Markern verwendet, um Prostatakrebs zu diagnostizieren. Dabei wird durch ihre An- oder Abwesenheit und/oder die Höhe der Amplitude auf das Vorliegen von Prostatakrebs geschlossen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptid markern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im Kranken oder Kontrollindividuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit oder die Amplitude des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums (Prostatakrebs oder nicht) zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Urin, Sperma, Sa- menflüssigkeit (Sperma ohne Spermien) handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vor- zugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch je- des im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptid- markern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden. Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptid- marker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscher-Chromatographie, oder eine elektrophoretische Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffini- tätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrphasen -H PLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (>100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektro- metrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionenbildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser- desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladenen Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan- Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A, 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25:2044-2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A, 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptid marker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptid- markern für die Diagnose von Prostatakrebs und die Differentialdiagnose zwischen Prostatakrebs und BPH zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt. Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer schwachen Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren.
Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der E- lektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafter Weise mehrere PoIy- peptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs verwendet werden. Insbesondere können mindestens drei Polypeptidmarker verwendet werden, beispielsweise die Marker 1, 2 und 3; 1, 2 und 4; usw.
Mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 4, 5, oder 6 Markern.
Noch mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 11 Markern, beispielsweise die Marker 1 bis 11.
Am meisten bevorzugt ist die Verwendung aller in den Tabellen 1 bzw. 3 aufge- führten Marker.
Auch zur Differentialdiagnose zwischen PCA und BPH können mehrere Marker verwendet werden. Insbesondere können mindestens drei Polypeptidmarker verwendet werden, beispielsweise die Marker 45, 46 und 47; 45, 46 und 48; usw. Mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 4, 5, oder 6 Markern.
Noch mehr bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 7 Markern, beispielsweise die Marker 1 bis 7.
Am meisten bevorzugt ist die Verwendung aller 27 in den Tabellen 2 bzw. 4 aufgeführten Marker. Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen von Prostatakrebs bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte statistische Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65:2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus verwendet werden.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq:
Zur Detektion der Polypeptidmarker für Prostatakrebs wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe) sowie Patienten, die an Prostatakrebs oder BPH leiden, abgenommen.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 500 μl Urin entnommen und mit 2 ml Filtrationspuffer (4M Harnstoff, 0,1M NaCI, 0,01% Ammoniak) ver- setzt. Diese 2,5 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (Amicon 30 kDa, Millipo- re, Bedford USA). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 2 ml Ultrafiltrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 2 ml Filtrat wurden dann auf eine Pharmacia C-2 Säule aufgetragen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), um Harnstoff, Salze und andere störende Komponenten zu entfernen. Die gebundenen Polypeptide wurden dann mit 50% Acetonitril, 0,5% Ameisensäure in Wasser von der C-2 Säule eluiert und lyophilli- siert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC- Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung: Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Tren- nung bestand aus 30% Methanol und 0,5% Ameisensäure in Wasser. Für den "Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) reali- siert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine "Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Mi- nuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 32 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 80 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert. 3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind: Protei n/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. Al 153) 9,2 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 10,9 min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 8,9 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYGRQI IS 15,6 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQI IFMVGR 23,4 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 20,0 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 36,8 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Die Molekularmassen der Peptide sowie die in der MS sichtbaren m/z Verhältnisse der einzelnen Ladungszustände sind in der folgenden Tabelle angegeben:
Beispiel 4. Leistungsfähigkeit der in WO 01/25791 beschriebenen Marker.
In der WO 01/25791 sind elf Marker erwähnt (siehe dort Anspruch 2), die Genauigkeit der Massenbestimmung wird mit 0,5% angegeben. Geht man davon aus, dass es sich nur um Fragmente von Semenogelin I handelt, ergeben sich folgende Anzahlen an möglichen Fragmenten aus Semenogelin:
Weiterhin offenbart WO 01/25791 Marker, die gegen das Vorliegen eines Prostatakarzinoms sprechend. Die Anzahl möglicher Fragmente ist in der folgenden Tabelle enthalten:
Figur 1 zeigt beispielhaft für eine Masse die Vielzahl an Sequenzen, die in diesem Gewichtsbereich möglich sind.
Im nächsten Schritt wurde versucht, entsprechende Proteine in Urinproben von Patienten mit Prostatakarzinom oder BPH zu analysieren. Dabei konnten nur sechs Marker gefunden werden. Figur 2 zeigt eine Bestimmung der Amplituden der sechs auf diesem Wege gefundenen Marker. Es zeigt sich, dass zwischen Prostatakarzinompatienten und der Kontrollgruppe keine signifikanten Unterschiede auftreten. Anschließend wurde der diskriminatorische Wert der Biomarker mittels einer ROC-Analyse (Receiver Operator characteristic Curves) untersucht.
Figur 3a zeigt entsprechende Analysen für sechs Marker, die in der WO 01/25791 beschrieben sind und in Urinproben gefunden werden konnten.
Figur 3b zeigt eine entsprechende ROC-Untersuchung der erfindungsgemäßen Biomarker mit den Nr. 1 bis 78 der Patentanmeldung. Figur 3c zeigt die ROC-Analyse einer Untergruppe der erfindungsgemäßen Markern (16 Marker) Figur 3d zeigt, dass selbst bei Verwendung von lediglich drei erfindungsgemäßen Biomarkern die Aussagekraft deutlich höher ist als bei der WO 01/25791 liegt, verwendet wurden die Marker 24, 41 und 46.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit mindestens dreier Polypeptidmar- kers in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 1 bis 44 und 52 bis 78 (Frequenzmarker), oder der Bestimmung der Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers, ausgewählt aus den Markern 45 bis 51 und 79-115 (Amplitudenmarker), die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind:
wobei es sich bei der Probe um eine Urinprobe oder Samenflüssigkeitspro- be handelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit der Marker 1 bis 44 und 52-78 anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der Amplitude der Marker 45 bis 51 und 79 bis 115 anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens vier oder mindestens fünf Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens zehn oder alle Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
6. Verfahren zur Differenzialdiagnose zwischen Prostatakrebs (PCA) und benigner Prostatahyperplasie (BPH) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern 52 bis 78, die durch folgende Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind:
wobei es sich bei der Probe um eine Urinprobe oder Samenflüssigkeitsprobe handelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit anhand folgender Referenzwerte erfolgt:
8. Verfahren nach Anspruch 6 wobei mindestens drei oder mindestens vier oder mindestens fünf oder mindestens zehn oder alle Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 6 definiert sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Kapillarelektrophore- se, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird. lO.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei vor der Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durch- geführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker verwendet wird.
12. Verwendung mindestens eines Polypeptidmarkers ausgewählt aus den Markern Nr. 1 bis 115, der durch die folgenden Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert ist
zur Diagnose von Prostata krebs.
13. Verwendung mindestens eines Polypeptidmarkers ausgewählt aus den Markern Nr. 52 bis 78, der durch die folgenden Werte für die Molekular- massen und die Migrationszeit charakterisiert ist zur Differentialdiagnose zwischen Prostata krebs und benigner Prostatahyperplasie (BPH).
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei zur Diagnose mindestens drei Marker verwendet werden.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060286602A1 (en) * 2004-05-10 2006-12-21 Harald Mischak Method and markers for the diagnosis of renal diseases
BRPI0808703A2 (pt) 2007-03-07 2014-09-02 Mosaiques Diagnostics & Therap Processo para padronização da concentração de componentes para análise em uma amostram de urina
EP1972940A1 (de) * 2007-03-14 2008-09-24 mosaiques diagnostics and therapeutics AG Verfahren und Marker zur Diagnose von Nierenerkrankungen
WO2009047280A2 (de) * 2007-10-09 2009-04-16 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Polypeptidmarker zur diagnose von prostatakrebs
EP2051078A1 (de) * 2007-10-19 2009-04-22 mosaiques diagnostics and therapeutics AG Verfahren und Marker zur Diagnose von Diabetes Mellitus
WO2009115570A2 (de) * 2008-03-19 2009-09-24 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Verfahren und marker zur diagnose von tubulären nierenschäden und -erkrankungen
US20110214990A1 (en) * 2008-09-17 2011-09-08 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Kidney cell carcinoma
EP2487251A1 (de) * 2011-02-13 2012-08-15 Protagen AG Markersequenzen für die Diagnose von Prostatakarzinom und deren Verwendung

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2386669A1 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 Ciphergen Biosystems, Inc. Prostate cancer marker proteins
WO2001071360A2 (en) * 2000-03-20 2001-09-27 Eastern Virginia Medical School Prostate cancer markers
WO2001074275A1 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Orde Levinson Urination apparatus
DE10021737C2 (de) 2000-05-04 2002-10-17 Hermann Haller Verfahren und Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines Protein- und/oder Peptidmusters einer Flüssigkeitsprobe, die dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wird
WO2003014724A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-20 Biotron Limited A novel cancer marker and uses therefor in the diagnosis of cancer
DE10142785C2 (de) 2001-08-31 2003-07-03 Henning Trappe Verfahren zur Bestimmung lokaler Ähnlichkeit aus seismischen 3D-Meßdaten
US20060088830A1 (en) * 2002-02-21 2006-04-27 Eastern Virginia Medical School Protein biomarkers that distinguish prostate cancer from non-malignant cells
EP1549938A4 (de) * 2002-04-26 2010-05-12 Univ Johns Hopkins Identifizierung von biomarkern zum nachweis von prostatakrebs
JP2005080524A (ja) * 2003-09-05 2005-03-31 Japan Science & Technology Agency 前立腺癌マーカポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及び該ポリペプチドを利用した前立腺癌の診断方法
DE10341193A1 (de) * 2003-09-06 2005-03-31 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Vorrichtung und Verfahren zur quantitativen Auswertung der in einer Körperflüssigkeitsprobe enthaltenden Polypeptide sowie Marker zur Erkennung von pathologischen Zuständen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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AU2006231611B2 (en) 2012-12-06

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