DE4415480C2 - Vorrichtung und Verfahren zur massenspektrometrischen Untersuchung von Substanzgemischen durch Kopplung kapillarelektrophoretischer Separation (CE) mit Elektrospray-Ionisierung (ESI) - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur massenspektro­ metrischen Analyse von kapillarelektrophoretisch separierten Substanzproben, ins­ besondere Proteinen, Proteoglykanen oder anderen Proteinkonjugaten, mit einer Ionisierung der Substanzproben durch Elektrosprühen. Eine solche Methode ist bei­ spielsweise aus der Arbeit von M. A. Moseley et al. in J. Am. Soc. Mass Spectrom. 3, 289 (1992) bekannt.

Allgemeiner Stand der Technik a) Kapillar-Elektrophorese

Es gibt verschiedene Arten von Kapillarelektrophorese wie Kapillar-Zonen-Elektro­ phorese (CZE), Kapillar-Gel-Elektrophorese (CGE), Kapillar-Isotachophorese (ITP) und andere mehr, deren methodische Unterschiede aber hier nicht relevant sind. Auch die verschiedenen Beladungsmethoden der Kapillaren mit und ohne Substanz­ fokussierung sind hier nicht entscheidend. Einen guten Überblick über diese Metho­ den gewinnt man aus den Überblicksartikeln von Ring-Ling Chien und Dean S. Burgi, Anal. Chem 64, 489A (1992) und von M. Albin, P. D. Grossman und S. E. Mo­ ring, Anal. Chem. 65, 489A (1993). Die neuere Literatur ist in der Übersicht von C. Schöneich et al., Anal. Chem 65, 67R (1993) gegeben.

Entscheidend ist hier lediglich, daß die gemeinsam in einem Flüssigkeitspropf in die Kapillare eingebrachten Substanzen eines gelösten Gemisches aus schweren Mole­ külen, vorzugsweise Biomolekülen, unter der Einwirkung eines relativ starken elek­ trischen Feldes in der elektrolytischen Flüssigkeit, mit der die Kapillare gefüllt ist, zu wandern beginnen. Dabei ist die Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Gemischkomponenten verschieden. Wie in der Chromatographie tritt eine Separa­ tion der Substanzen ein. Grund für diese Wanderung ist eine pH-Wert-abhängige Ladung der Biomoleküle.

Kapillarelektrophorese, insbesondere die Kapillarzonenelektrophorese, hat gegen­ über anderen Trennmethoden, beispielsweise der Flüssigkeitschromatographie, den großen Vorteil, in kurzer Trennzeit extrem gute Separationen zu erzielen. So lassen sich in weniger als 20 Minuten Separationen mit mehr als einer Million theoretischer Böden erreichen, in weniger als einer Minute Bödenzahlen größer als 100000.

Normalerweise befinden sich beide Enden der Kapillare in je einem Flüssigkeits­ reservoir, in dem sich auch die beiden spannungsgebenden Elektroden befinden. Kurz vor dem zweiten Flüssigkeitsreservoir befindet sich für gewöhnlich eine De­ tektionseinrichtung, die die getrennten Substanzen während des Flusses durch die Kapillare durch Absorption von sichtbarem oder UV-Licht in der Kapillare mißt.

In der elektrophoretischen Kapillare fließen drei elektrische Teilströme: (1) der elek­ trolytische Strom durch die wandernden Substanzionen, deren Ladung vom pH- Wert der Lösung abhängt, (2) ein elektroosmotischer Strom durch die Einwirkung von ortsfesten Wandladungen auf die Lösung, und (3) ein meist überwiegend großer elektrolytischer Strom durch pH-Wert-bestimmende Säuren, Basen oder Salze der Lösung. Alle Arten von Kapillarelektrophorese haben dabei den Vorteil, daß die Wärme, die durch diese Ströme entsteht, sehr gut von den Kapillarwänden abgelei­ tet wird, und daher relativ große Stromdichten möglich werden.

Der elektroosmotische Effekt besteht darin, daß durch ortsfeste Wandladungen, die durch den Elektrolyten entstehen, in der Flüssigkeit bewegliche Ladungen induziert werden, die unter der Potentialdifferenz zu einem elektrischen Strom, aber auch zu einem elektroosmotischen Flüssigkeitsstrom führen. Durch den elektroosmotischen Flüssigkeitsstrom wird Flüssigkeit in geringen Mengen durch die Kapillare ge­ pumpt. Richtung und Größe des Flüssigkeitsstromes hängen dabei von der Art der Wandladungen, vom Kapillardurchmesser, von der Feldstärke und der Polarität des elektrischen Feldes ab.

Die Wandladungen lassen sich durch Belegungen der Kapillarwand mit Polymeren beeinflussen. Beispielsweise werden in einer unbelegten Quarzkapillare negative Wandladungen erzeugt. Durch Bindung bestimmter organischen Verbindungen an die Wand, beispielsweise durch Aminopropylsilylierung, können dagegen positive Wandladungen erzeugt werden. Zur Vermeidung von Wandadsorptionen der zu trennenden Substanzen und für eine gute elektrophoretische Separation ist es wich­ tig, gleiche Ladungspolarität von Wandladungen und Substanzionen herzustellen. Für die gute Trennung von Proteinen in einem angesäuertem Elektrolyten, der durch Anlagerung von H⁺-Ionen eine positive Ladung der Proteinmoleküle bewirkt, müs­ sen auch positive Wandladungen erzeugt werden, da nur dann die Substanzionen durch die Coulombkräfte von den Wänden entfernt gehalten werden.

Die elektroosmotische Strömung ist im allgemeinen recht klein, kann aber einen kräftigen Druck aufbauen, der sich jedoch durch einen hydrostatischen Gegendruck kompensieren läßt, wenn man einen bestimmten Flüssigkeitsstrom zwangsweise erzeugen möchte. Die elektroosmotische Strömung ist aber im allgemeinen weit un­ ter 0,3 Mikroliter pro Minute in einer Kapillare mit 75 Mikrometern innerem Durch­ messer, die Strömungsgeschwindigkeit reicht nur selten an die Wanderungs­ geschwindigkeit der langsamsten Substanzmoleküle heran.

b) Elektrosprühionisieren

Ein guter Überblick über Elektrosprühionisieren und den heutigen Stand der Tech­ nik ist in folgendem Review-Artikel gegeben: J. B. Fenn, M. Mann, C. K. Meng, S. F. Wong und C. M. Whitehouse; Spectr. Rev. 9, 37 (1990).

In der Elektrosprüh-Methode liegt zwischen einer Metallkapillare und einer ebenen Fläche, die einen Abstand von etwa 20 bis 50 Millimeter voneinander haben, eine Spannung von mehreren Kilovolt an. Eine Flüssigkeit in der Kapillare wird dabei unter der Wirkung des elektrischen Feldes am Ende der Kapillare dielektrisch pola­ risiert und zu einem Konus ausgezogen, dem sogenannten Taylor-Konus. An der Spitze dieses Konus kann die Oberflächenspannung der Flüssigkeit der ziehenden Kraft des elektrischen Feldes nicht mehr standhalten, daher reißt hier ein kleines Tröpfchen ab, das wegen der dielektrischen Polarisierung elektrisch aufgeladen ist. Das geladene Tröpfchen fliegt unter der Wirkung des inhomogenen elektrischen Feldes zunächst stark beschleunigt auf die ebene Gegenelektrode zu, wird aber in der umgebenden Luft abgebremst. Während des Fluges tritt von der Oberfläche des Tröpfchens eine starke Verdunstung ein. Befinden sich in der Flüssigkeit einige grö­ ßere Moleküle, die sich durch Elektronenentzug, durch Elektronenanlagerung, durch Protonierung oder sonst leichter laden (ionisieren) lassen als die Moleküle der Flüssigkeit, so können im günstigen Falle nach vollständiger Verdampfung der Flüssigkeit die größeren Moleküle in ionisierter Form zurückbleiben. Die ionisierten Moleküle fliegen dabei unter der Wirkung des elektrischen Feldes durch den be­ kannten Prozess der "Ionenmobilität" weiter auf die Gegenelektrode zu, und können durch eine feine Öffnung oder durch eine Kapillare in das Vakuumsystem eines Massenspektrometers überführt werden.

Das Abreißen der Tröpfchen findet, abhängig vom Nachschub der Flüssigkeit in der Kapillare, außerordentlich häufig statt, so daß gewöhnlich ein kontinuierlicher Io­ nenstrom entsteht. Der Nachschub wird durch eine sehr gleichmäßig arbeitende Pumpe, meist eine Spritzenpumpe, aufrechterhalten.

Die größeren Moleküle werden bei diesem Vorgang meist nicht nur einfach geladen, sondern vielfach. Als grobe Regel gilt, daß die mittlere Ladungszahl umso größer ist, je größer das Molekül ist. Große Biomolekül-Ionen können durchaus 10- bis 50-mal geladen sein. Die Ladung ist in der Regel nicht eine einfache Ionisierung, sondern eine Protonierung, also eine Bindung mit geladenen Wasserstoffatomen H⁺. Daher hängt die Ionisierung auch stark von der Wasserstoff-Ionen-Konzentration (also vom pH-Wert) der Lösung ab. Um die Ionen einer mittleren Ladungszahl herum gibt es eine breite Verteilung von Ionen mit verschiedenen Anzahlen von Ladungen.

Die vielfache Ladung eines größeren Molekülions und die breite Ladungsverteilung sind einesteils besonders günstig für den Nachweis. Da die meisten Massenspektro­ meter einen beschränkten Massenbereich haben (genauer ausgedrückt: einen be­ schränkten Bereich der Massen-zu-Ladungs-Verhältnisse), kann man trotz dieser Beschränkung noch sehr große Moleküle weit jenseits des Massenbereichs, der für einfach geladene Ionen definiert ist, nachweisen, da die Elektro-Sprüh-Ionen vielfach geladen sind. Durch die breite und regelmäßige Verteilung der Anzahl der Ladun­ gen auf die Molekülionen gleicher Masse ist es außerdem leicht möglich, die Mole­ kularmasse rechnerisch zu bestimmen (M. Mann, C. K. Meng und J. B. Fenn, Anal. Chem. 61, 1702 (1989)).

Die Tröpfchen haben bei dieser normalerweise verwendeten Methode mit Metall­ kapillaren einen sich selbst einstellenden Durchmesser von ein bis zwei Mikro­ metern, gegeben durch Dielektrizitätskonstante, Viskosität, Flußrate und Ober­ flächenspannung der Flüssigkeit. Eine stabile Betriebsweise des Elektrosprühens läßt sich nur aufrechterhalten, wenn der Flüssigkeitsstrom größer als etwa ein Mikroliter pro Minute ist. Die stabile Betriebsweise wird darüberhinaus durch die Eigenschaf­ ten der Sprühflüssigkeit bestimmt, darunter von pH-Wert, Viskosität, Oberflächen­ spannung und Leitfähigkeit. Nur in schmalen Toleranzbereichen dieser Parameter ist ein stabiles Sprühen möglich.

In der nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung nach DE 44 08 032 A1, auf die hier voll­ inhaltlich bezug genommen wird, wird eine verbesserte Methode der Elektrosprüh- Ionisierung angegeben, die zu wesentlich kleineren Tröpfchengrößen, zu stabilerem Betrieb und zu geringerem Flüssigkeitsstrom führt. Es werden für dieses Verfahren, das im Folgenden "Mikrosprühen" genannt wird, Kapillaren aus Glas benutzt, die zu sehr feinen Spitzen mit Öffnungsdurchmessern von nur etwa 2,5 Mikrometer ausge­ zogen worden sind. Die Glaskapillaren liefern, bei völlig stabilem Betrieb, Tröpfchen von etwa 100 bis 200 Nanometern Durchmesser, die wegen ihres hohen Dampf­ drucks, ihrer geringeren Abkühlung durch die Verdunstung und ihrer kleinen Mas­ se bereits bei Zimmertemperatur auf einer Flugstrecke von nur 1,5 Millimetern voll­ ständig verdunsten.

Es ist ein besonderes Merkmal dieses neuen Verfahrens, ohne Flüssigkeitspumpe zu arbeiten, wie sie bei allen sonst verwendeten Verfahren benutzt wird. Es ergibt sich eine Selbstregulierung des Nachflusses mit der Folge eines sehr konstanten Ionen­ stroms, wobei der Nachschub an Lösung bei niederviskosen Flüssigkeiten allein durch die elektrischen Ziehkräfte bewerkstelligt wird. Bei höherviskosen Flüssig­ keiten genügte ein leichter Gas-Überdruck am Ende der Kapillare, um zu einem selbstregulierenden Nachfluss zu kommen. Der Gasdruck braucht und darf dabei nicht so hoch sein, daß bei Abschalten des Sprühvorgangs ein Ausfluß der Flüssig­ keit aus der Kapillare bewirkt wird. Der selbstregulierende Nachschub an Flüssig­ keit ist wesentlich für einen stabilen Betrieb des Sprühens mit so geringen Flußraten. Es sind weitere Vorteile dieses Verfahrens, daß die Sprühspannung nur etwa 600 bis 800 Volt beträgt, und daß sich das Sprühen durch eine Absenkung dieser Spannung um einige hundert Volt leicht vollständig unterbrechen läßt. Damit lassen sich insbe­ sondere bei speichernden Massenspektrometern, wie Hochfrequenz-Quadrupol- Ionenfalle und Ionen-Cyclotron-Resonanz-Spektrometern, substanzsparende Verfah­ ren entwickeln, bei denen der Sprühionenstrahl nur in der Füllungszeit der Ionenfal­ len eingeschaltet wird, in der Analysenzeit dagegen ausgeschaltet bleibt.

Der größte Vorteil des Mikrosprühens ist aber die Toleranz des Verfahrens gegen­ über starken Änderungen der elektrolytischen oder viskosen Eigenschaften der Flüssigkeit. Es können sowohl sauberstes Wasser, wie auch Säuren und Basen im pH-Wertbereich von 0,2 bis 10 gesprüht werden. Auch stärkere Zusätze von organi­ schen Lösemitteln, wie beispielsweise Methanol oder Acetonitril, verhindern ein stabiles Sprühen nicht, während das klassische Elektrosprühverfahren nur in sehr schmalen Toleranzbereichen für alle diese Parameter stabil arbeitet.

Der Sprühstrahl zeigt auf dem kurzen Wege zur Gegenelektrode eine nur sehr ge­ ringe Verbreiterung von etwa 200 Mikrometern, so daß die Ionen praktisch voll­ ständig durch eine feine Kapillare ins Vakuum des Massenspektrometers überführt werden können.

Verglichen mit einer konventionellen Elektro-Spray-Einrichtung, die mit einer Lö­ sung gleicher Konzentration arbeitete, ist der Ionenstrom im Massenspektrometer etwa zwei- bis dreimal höher. Der Lösungsmittelfluß, und damit der Substanz­ verbrauch, liegt aber um den Faktor 40 niedriger als der niedrigste Fluß, der sich in konventionellen Verfahren noch stabil einstellen läßt. Die Flußrate beträgt nur 25 Nanolitern pro Minute. Die Ausbeute an Ionen, gemessen an der eingesetzten Sub­ stanzmenge, ist damit um einen Faktor 100 erhöht.

c) Massenspektrometrische Untersuchung

Für die Untersuchung der Sprühionen läßt sich im Prinzip jede Art von Massen­ spektrometer einsetzen, da die kontinuierliche Ionenerzeugung hier keinerlei Be­ schränkungen auferlegt. Es kommen sowohl die klassischen Sektorfeld-Spektro­ meter, wie auch Quadrupolspektrometer in Frage, beide Arten auch in Tandem- Anordnung, um MS/MS-Untersuchungen vornehmen zu können.

Flugzeit-Massenspektrometer brauchen eine Auspulsung des quer eingeschossenen Ionenstrahls, können dann aber auch vorteilhaft genutzt werden. Die Ausbeute der zur Messung gelangenden Ionen ist hier höher als bei den als Filter für jeweils eine einzige gemessene Masse wirkenden Sektorfeld- oder Quadrupol-Spektrometern.

Besonders günstig sind hier speichernde Massenspektrometer, wie Quadrupol- Ionenfallen oder Ionen-Cyclotron-Resonanz-Geräte. Durch die Abschaltbarkeit des Mikrosprühverfahrens braucht der Ionenstrahl nur dann eingeschaltet sein, wenn die Speicherzelle mit Ionen zu füllen ist.

Die Ziele der massenspektrometrischen Analysen können sehr verschieden sein. Die einfachsten sind genaue Molekulargewichtsbestimmungen von Proteinen in Gemi­ schen, oder Identifizierung von Proteinen oder Proteoglykanen durch Molekular­ gewichtsbestimmung der enzymatisch erzeugten Abbauprodukte wie Peptide oder Oligosaccharide. Zu den schwierigeren Analysen gehören Bestimmungen der Ami­ nosäurensequenzen über MS/MS-Methoden oder Analysen der Tertiärstrukturen großer Biomoleküle.

d) Kopplung Elektrophorese mit Elektrosprühen

Die klassische Elektrosprüh-Ionisierung wie auch das neue Mikrosprühen haben für Analysen von Substanzgemischen einen entscheidenden Nachteil: Durch die breite Verteilung der Ladungszustände ergeben sich sehr linienreiche Spektren. Bei Vorlie­ gen einer reinen Substanz ist dies vorteilhaft, wie oben beschrieben, da man aus dem regelmäßigen Rythmus der Linien leicht das Molekulargewicht bestimmen kann.

Selbst bei drei gleichzeitig ionisierten Substanzen läßt sich das Schema aus den über­ lagerten Spektren noch entschlüsseln. Bei der Überlagerung von mehr als drei Sub­ stanzen wird das Spektrum aber schnell völlig unübersichtlich. Es muß also einer Gemischanalyse, wie sie gerade bei Biomolekülen oft vorkommt, immer eine mehr oder weniger vollständige Separation der Substanzen vorhergehen. Eine Kopplung mit einem separierenden Verfahren liegt daher nahe.

Eine Kopplung der Kapillarzonenelektrophorese mit Elektrosprühionisierung und massenspektrometrischem Nachweis wurde in der schon eingangs erwähnten Arbeit von M. A. Moseley et al. in J. Am. Soc. Mass Spectrom. 3, 289 (1992) beschrieben. Dort wird auch frühere Literatur angegeben. Es war ein besonderes Ziel dieser Ar­ beit, den Einfluß verschiedener Flüssigkeitsparameter auf das Elektrosprühen zu untersuchen.

Der nächstkommende Stand der Kopplungstechnik zwischen Kapillarzonen-Elektro­ phorese und Elektrospray-Ionisierung wird durch T. J. Thompson, F. Foret, P. Vou­ ros and B. L. Karger in Anal. Chem, 1993, 65, Seite 900 angegeben.

Die Kapillarelektrophorese wurde bisher, wie auch in den zitierten Arbeiten, nur mit dem klassischen Elektrosprühverfahren gekoppelt, nicht mit dem Mikrosprühen. Es wurde dabei stets die Kapillarzonenelektrophorese benutzt, in einem Fall auch Ka­ pillar-Isotachophorese (CITP). Um die verschieden großen und verschieden gerichte­ ten elektroosmotischen Flüssigkeitsströme zu kompensieren, wurde meist ein Flüs­ sigkeitsstrom durch eine Druckdifferenz über die Kapillare zwangsweise eingestellt. Dieser ist jedoch viel zu klein für ein stabiles Elektrosprühen, daher wurde dem Elektrosprühen in allen bisherigen Arbeiten koaxial ein Überschuß an zusätzlichem Flüssigkeitsstrom zugeführt. Die Elektrophoresekapillare wurde dabei direkt in die Metallkapillare für die Zusatzflüssigkeit eingeschoben. In der zitierten Arbeit von Moseley et al. wurde die Elektrophoresekapillare an der Sprühstelle um etwa 0,2 Millimeter herausragen lassen. Der überschüssige Strom an zugegebener Flüssigkeit wurde dazu benutzt, um die Sprühparameter richtig einzustellen.

Nachteile bisheriger Verfahren

Wie die Untersuchungen von Moseley et al. ergeben haben, wird durch die Einstel­ lung optimaler Sprühparameter durch die Zusatzflüssigkeit keine Entkopplung von den Eigenschaften der elektrophoretischen Flüssigkeit erzeugt. Auch diese müssen optimal für die Ionisierung im Elektrosprühen eingestellt werden. Eine Unabhän­ gigkeit zwischen Elektrophorese und Elektrosprühen ist daher nicht zu erreichen. Entgegen den Erwartungen liegt also hier kein Vorteil der Methode.

Andererseits wird die Konzentration der zu analysierenden Substanzen durch die Zusatzflüssigkeit stark herabgesetzt. Die Überführungsausbeute der Elektrosprüh­ ionen des klassischen Sprühverfahrens in das Vakuum des Massenspektrometers ist außerordentlich klein, nur etwa 1/1000 der Ionen gelangen in das Massenspektro­ meter. Die Substanzausbeute dieses Verfahrens ist daher sehr klein.

Außerdem ist dieses Verfahren durch die Zuführung einer zweiten Flüssigkeit, durch den Zwang zu einer genauen Einstellung aller elektrolytischen Parameter für diese Flüssigkeit und durch die erforderliche Pumpe und deren Einstellung sehr kompliziert und nicht leicht zu einem stabilen Arbeiten zu bringen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zu finden, mit dem separierte Proteine und andere Biomoleküle aus der Kapillarelektrophorese kontinuierlich und mit ho­ her Ausbeute an massenspektrometrisch detektierbaren Ionen einer Ionisation durch das besonders günstige Mikrosprühen zugeführt werden können, ohne durch zu­ sätzlich zugeführte Flüssigkeit eine Verdünnung zu erleiden.

Erfindungsgedanke

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, die beiden Kapillaren in der Flüssigkeit des zweiten Flüssigkeitsreservoirs koaxial lose miteinander zu koppeln, wobei ein schmaler Spalt zwischen den Stirnflächen der Kapillaren die elektrische und hydro­ dynamische Verbindung zur Flüssigkeit des Reservoirs übernimmt. Durch diese lose Kopplung wird sichergestellt, daß sich kein Zwangsfluß in der Mikrosprühkapillare einstellt, sondern daß sich der Fluß selbstregulierend einstellen kann, wie es für den Erfolg des Mikrosprühens notwendig ist. Es wird weiterhin sichergestellt, daß der elektrische Strom durch die Elektrophoresekapillare und der Strom durch die Mi­ krosprühkapillare, der für das Sprühen notwendig ist, voneinander entkoppelt sind. Insbesondere braucht der Elektrophoresestrom nicht durch die sehr feine Spitze der Mikrosprüheinrichtung geführt werden, da dort eine so hohe Stromdichte herrschen würde, daß ein Sieden der Elektrophoreseflüssigkeit nicht auszuschließen wäre. Die Spannung für das Mikrosprühen ist von der Spannung für die Elektrophorese unab­ hängig, beide können unabhängig voneinander optimal eingestellt werden.

Der Spalt sollte dabei etwa ¼ des inneren Durchmessers der Elektrophorese­ kapillare betragen, da dann keine Erhöhung der elektrischen Stromdichte und auch keine Erhöhung der substanzführenden Feldstärke auftritt. Es tritt dann auch keine übermäßige Erwärmung des Elektrolyten an dieser Stelle auf.

Die Polarität der wandernden Substanzionen in der Elektrophoresekapillare und die der Sprühionen muß dabei gleich sein, da sich nur dann in der Mikrosprühkapillare durch den elektrischen Sprühstrom ein Potentialgefälle ausbildet, das die Substanz­ ionen zur Spitze der Sprühkapillare führt, wenn sie einmal in die Mikrosprüh­ kapillare eingetreten sind.

Der Innendurchmesser der Mikrosprühkapillare sollte klein sein, damit sich eine relativ große Strömungsgeschwindigkeit einstellt, die viele der separierten Substanz­ ionen, die aus der Elektrosprühkapillare austreten, durch Flüssigkeitsreibung in die Mikrosprühkapillare mitnimmt, auch wenn die höhere Feldstärke im Spalt die Ionen nach außen abzuleiten sucht.

Die Präparation der Innenwände der beiden Kapillaren muß gleich oder zumindest ähnlich sein, um eine gleiche Polarität der Wandladungen zu erzeugen. Die Polarität der Wandladungen sollte der Polarität der wandernden Substanzionen entsprechen, um ein optimalen Trennergebnis zu erhalten. Auch die Stirnflächen der Kapillaren, die den Spalt bilden, sollen vorzugsweise in dieser Weise präpariert sein.

Es lassen sich auf diese Weise mehr als 20 Prozent der interessierenden Substanz­ ionen in die Mikrosprühkapillare überführen, der Rest wandert in das zweite Flüs­ sigkeitsreservoir und ist verloren. Diese Ausbeute erscheint zunächst gering, da sich ja bei den bisherigen Kopplungsverfahren alle Substanzionen dem Elektrosprühver­ fahren zugeführt werden. Da aber die Ausbeute an massenspektrometrisch nutzba­ ren Ionen beim Mikrosprühverfahren um einen Faktor hundert höher liegt als bei der klassischen Elektrosprühmethode, wird mit der losen Kopplung ein mehr als zwanzigfacher Gewinn an Substanzionen erzielt.

Es ist ein besonderer Vorteil dieser Kopplung, daß sich sowohl das Mikrosprühen wie auch die Kapillarelektrophorese leicht elektrisch abschalten lassen, ohne die Se­ paration wesentlich zu stören. Insbesondere zeigt die Kapillar-Gel-Elektrophorese keine Beeinträchtigung der Separationsleistung durch zwischenzeitliches Abschal­ ten. Das Mikrosprühen kann man innerhalb einer Millisekunde abschalten und in derselben Zeitspanne auch einschalten. Damit läßt sich eine sehr genaue Dosierung der Ionen erreichen.

Durch die Möglichkeit, nur dann Ionen zu erzeugen, wenn sie gebraucht werden, kann man den Substanzverbrauch der massenspektrometrischen Untersuchung un­ ter Benutzung von speichernden Massenspektrometern nochmals herabsetzen. So­ wohl bei Quadrupol-Ionenfallen wie auch bei Ionen-Cyclotron-Spektrometern braucht man nur etwa 20 Millisekunden, um die Speicherzelle mit genügend Ionen zu füllen. Für die massenspektrometrische Analyse der gespeicherten Ionen werden dann, je nach erforderlichem Auflösungsvermögen und nach Analysenart, 100 Milli­ sekunden bis eine Sekunde gebraucht. Durch entsprechendes Schalten kann man also zu weiteren Substanzeinsparungen um Faktoren fünf bis fünfzig kommen, al­ lerdings unter Verlängerung der gesamten Analysendauer. Durch getrenntes Schal­ ten von Elektrophorese und Sprühen läßt sich auch jeder Zwischenwert erreichen.

Beschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt ein Prinzipbild der gesamten Kopplung ausschließlich des Massen­ spektrometers.

Die Elektrophoresekapillare (1) verbindet die beiden Flüssigkeitsreservoire (2) und (3), in denen sich (wie auch in der Elektrophoresekapillare) die Elektrophorese­ flüssigkeit (4), (5) befindet. Die Elektroden (6) und (7) können eine Spannung zwi­ schen den beiden Flüssigkeitsreservoiren aufrechterhalten. Über die beiden Gaszu­ führungen (8) und (9) läßt sich erwünschter Gasdruck in den Gasräumen (10) und (11) über den beiden Spiegeln der Flüssigkeit einstellen. Die Mikrosprühkapillare (12) ist in der Elektrophoreseflüssigkeit (5) des Flüssigkeitsreservoirs (3) mit gerin­ gem Abstand koaxial zur Elektrophoresekapillare (1) angeordnet. Der Sprühstrahl wird durch eine Spannung zwischen der Elektrode (7) im zweiten Flüssigkeitsreser­ voir (3) und der Sprüh-Gegenelektrode (13) erzeugt, und die Sprühionen können in üblicher Weise durch eine feine Eintrittskapillare (14) in das Vakuum des Massen­ spektrometers eintreten.

Fig. 2 zeigt eine Vergrößerung der losen Kopplung der Elektrophoresekapillare (1) mit der Mikrosprühkapillare (12) im Flüssigkeitsreservoir (3). Der Abstand zwischen den Kapillaren beträgt nur etwa 1/4 des inneren Durchmessers der Elektrophorese­ kapillare (1).

Fig. 3 zeigt die lose Kopplung, ummantelt mit einem Halteelement (15) aus einem geeigneten Kunststoff, das einerseits die Kapillaren (1) und (12) zueinander fixiert, und andererseits den Flüssigkeits- und den elektrischen Strom in günstiger Weise führt.

Besonders günstige Ausführungsformen

Die Grundausführung der Erfindung ist bereits in Fig. 1 ausführlich beschrieben. Einer Kapillarelektrophoresekapillare mit einem Innendurchmesser von 50 Mikro­ metern steht mit einer Spaltweite von etwa 15 Mikrometern eine Mikrosprühkapil­ lare mit 20 Mikrometer Innendurchmesser gegenüber. Für massenspektrometrische Untersuchungen braucht das Separationsvermögen nicht extrem hoch zu sein, daher genügt meist eine relativ kurze Elektrophoresekapillare von etwa 20 Zentimetern Länge, betrieben mit einer Spannung von etwa 6 Kilovolt. Die Mikrosprühkapillare ist nur etwa 2 Zentimeter lang, und zu einer Spitze mit 2,5 Mikrometer Innendurch­ messer ausgezogen. Die Flußgeschwindigkeit in der Mikrosprühkapillare beträgt dann etwa ein Millimeter pro Sekunde, die Substanz erscheint also etwa 20 Sekun­ den nach Eintritt in diese Kapillare. Ein Überdruck von etwa 100000 Pascal im Gas­ raum des zweiten Flüssigkeitsreservoirs hilft, das Mikrosprühen mit wässerigen Lö­ sungen aufrechtzuerhalten.

Der Abstand zwischen der Spitze der Mikrosprühkapillare und der Gegenelektrode beträgt im optimalen Fall nur etwa 1,5 Millimeter. Die Gegenelektrode enthält dabei die metallisierte Stirnfläche einer Eintrittskapillare in das Massenspektrometer, mit einem Innendurchmesser von etwa 500 Mikrometern. Die Sprühspannung beträgt etwa 600 bis 800 Volt.

Besonders günstig für die normalerweise analysierten positiven Sprühionen ist dabei eine Ausführungsform der Elektrophoresekapillare aus Quarzglas, die innen mit einer Aminopropylsilylierung behandelt sind, die bei angesäuerten Elektrolyten positive Wandladungen erzeugen. Eine Rezeptur ist bei Moseley et al. angegeben.

Eine weitere günstige Ausführungsform des Verfahrens sieht vor, durch entspre­ chende Einstellung der Drücke in den beiden Flüssigkeitsreservoiren eine gegen­ läufige Flußrichtung der Flüssigkeit in den beiden Kapillaren zu erzeugen. Dadurch entsteht ein relativ starker, saugender Flüssigkeitsstrom im Spalt, der den Übertritt der untersuchten Substanzionen in die Mikrosprühkapillare begünstigt. Die Elektro­ phorese findet dann gegen den Flüssigkeitsstrom in der Elektrophoresekapillare statt. Es ist günstig, die Halterung für die gegenseitige Fixierung der Kapillaren mit einem Kanal zu vesehen, dessen Ausformung für eine hohe Überführungsrate der Substan­ zen in die Mikrosprühapillare günstig ist. Es hat sich gezeigt, daß eine Umlenkung des Flüssigkeitsstromes, wie in Fig. 3 gezeigt, eine günstige Wirkung hat.

Claims (17)

1. Vorrichtung für die Erzeugung von Elektrosprühionen kapillarelektrophore­ tisch getrennter Substanzen, mit einer Einrichtung zur Kapillarelektrophorese (CE), bestehend aus zwei elektrodenbewehrten Flüssigkeitsreservoiren, zwischen denen sich eine Elektrophoresekapillare befindet, und einer Spannungsversorgung für die Elektrophoresespannung zwischen den beiden Elektroden, und mit einer Einrich­ tung zur Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI), bestehend aus einer Sprühkapilla­ re, einer Gegenelektrode und einer Spannungversorgung, die das elektrische Sprüh­ feld erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß Sprühkapillare und Elektrophoresekapillare im zweiten Flüssigkeitsreservoir koaxial zueinander fixiert sind, mit einem Spalt zwischen den Stirnflächen der Kapil­ laren, so dimensioniert, daß sich einerseits der Fluß in der Sprühkapillare selbstre­ gulierend einstellt und andererseits aus der Elektrophoresekapillare migrierende Substanzen mindestens teilweise in den Lösungsfluß der Sprühkapillare eintreten.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Weite des Spaltes etwa ¼ des Innendurchmessers der Elektrophoresekapillare beträgt.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sprühkapillare aus nichtleitendem Material besteht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Spannung für das Elektrosprühen zwischen der Elektrode im zweiten Flüssigkeitsreservoir und der Gegenelektrode der Elektrosprüheinrichtung angeschlossen ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sprühkapil­ lare am sprühseitigen Ende mit einer leitenden Schicht überzogen ist und daß die Spannung für das Elektrosprühen zwischen dieser Schicht und der Gegenelektrode angeschlossen ist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Elektrophoresekapillare einen inneren Durchmesser von 25 bis 100 Mikrometer und die Elektrosprühkapillare einen inneren Durchmesser von 10 bis 50 Mikrometer hat.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Sprühkapillare sprühseitig zu einer feinen Spitze ausgezogen ist, mit einer Kapillaröffnung von etwa 2,5 Mikrometer Durchmesser in der Spitze.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung der Sprühkapillarenspitze von der Gegenelektrode etwa 0,5 bis 3 Millimeter mißt, und die Spannung der Elektrosprüheinrichtung etwa 500 bis 1200 Volt beträgt.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das zweite Flüssigkeitsreservoir geschlossen und mit einer Gaszufuhr versehen ist, mit der das Gas oberhalb der Flüssigkeit mit einem Druck beaufschlagt werden kann, um das Sprühen aus der Sprühkapillare zu unterstützen.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Spalt zwischen Elektrophoresekapillare und Sprühkapillare von einem Verbindungsstück umgeben ist, der die beiden Kapillaren zueinander fixiert, ohne den Lösungsfluß und elektrischen Strom durch den Spalt zu behindern.

11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Gegenelektrode der Elektrosprüheinrichtung ein Loch besitzt, durch das Sprühionen in ein Massenspektrometer eintreten können.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Gegenelektrode perforiert ist, und daß durch die Perforation Ionen in ein Massenspektrometer eintreten.

13. Verfahren zur Erzeugung von Elektrosprühionen kapillarelektrophoretisch getrennter Substanzen, mit koaxialer Fixierung der Elektrophorese- und Sprühkapil­ lare, und mit einem elektrischen Sprühfeld zwischen dem Sprühende der Sprühka­ pillare und einer Gegenelektrode, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsflüsse in den beiden Kapillaren durch einen Spalt zwischen den Stirnflächen der Kapillaren und einer den Spalt umgebenden Flüssigkeit entkoppelt sind, und daß der Lösungsfluß in der Sprühkapillare durch den Sog des elektrischen Sprühfeldes auf die Flüssigkeitsoberfläche am Sprühende der Sprühkapillare be­ wirkt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösungsfluß in der Sprühkapillare durch einen stationären Druck auf die den Spalt umgebende Flüssigkeit unterstützt wird, wobei der Druck jedoch nicht so groß ist, ein selbstän­ diges Ausfließen der Lösung aus der Sprühkapillare ohne elektrisches Sprühfeld zu bewirken.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrosprühen durch Veränderung des Sprühfeldes abgeschaltet wird, wenn die massenspektrometrische Analyse keinen Ionenstrom braucht.

16. Verfahren nach Anspruche 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektro­ sprühen abgeschaltet wird, indem die Intensität des Sprühfeldes vermindert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß Elektrosprühen und Elektrophorese gleichzeitig abgeschaltet werden.