CN104345107B

CN104345107B - 一种乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN104345107B
Application number: CN201310315153.0A
Authority: CN
Inventors: 任平; 任一平; 赖世云; 张京顺
Original assignee: SHANGHAI CO-BEST BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI IMPACT SCIENTIFIC INSTRUMENT CO., LTD.
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-07-24
Also published as: CN104345107A

Abstract

本发明提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，包括牛乳血清白蛋白特异肽、同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标，以及蛋白酶解试剂和质控样品。牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为：LVNELTEFAK；同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为：LV^*NEL^*TEFAK；同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为：QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。本发明试剂盒用经研究设计合成的同位素标记内标物，能够准确对各类含乳样品中的牛乳血清白蛋白进行定量检测，保证了结果的可靠性，且所使用的试剂用量少，检测成本低。

Description

一种乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种可测定乳或乳制品中热变性和非变性的常量或微量的牛乳血清白蛋白定量的检测试剂盒。

背景技术

牛血清白蛋白（Bovine serum albuminn，BSA)是牛血清中的一种主要的球蛋白之一，也是乳清蛋白的成分之一，又称第五组分(Fraction V)，简称为BSA，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，25℃下水中等电点为4.7，主要存在于牛血清中，约占牛血清中总蛋白的52-62%；此外，在牛奶中也含有少量的血清白蛋白，约为牛奶中总蛋白的1.4%。

据报道，牛血清白蛋白最主要的生理作用为维持人体血液中的渗透压和pH值平衡，而Karjalainen（1992）等人则发现婴幼儿从牛奶中摄入的牛血清白蛋白与胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）的引发有直接的关系，其研究表明，在母乳哺喂六个月后再喂含一定量牛血清白蛋白的乳制品可大大减少婴儿引发胰岛素依赖性糖尿病的可能性。因此，研究乳及乳制品中牛血清白蛋白的量对婴幼儿的健康成长有着重要的作用。

目前国内外用于牛乳血清白蛋白检测最主要的方法为ELISA法，该法灵敏度高、特异性强，但对操作人员要求高，重现性较差，定量结果不准确，可满足样品的初筛，而准确定量尚有缺陷。经查询，至今为止还未发现应用同位素内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳血清白蛋白的方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS可定量测定不同乳及乳制品中牛乳血清白蛋白含量的试剂盒。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS定量检测牛乳血清白蛋白的方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK（SEQID NO.1）；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK（SEQ IDNO.2，其中同位素标记*符号未显示），其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC（SEQ IDNO.3，其中同位素标记符号*未显示出），其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

作为一个优选方案，所述试剂盒还包括氯化钙（CaCl₂），碳酸氢铵（NH₄HCO₃），二硫苏糖醇（DTT），碘代乙酰胺（IAA），胰蛋白酶和甲酸。

作为一个优选方案，所述氯化钙的使用浓度是100mmol/L，碳酸氢铵的使用溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇的使用浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用浓度是500mmol/L，胰蛋白酶的使用浓度是200μg/mL。

为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理以释放特异肽：将待测样品用温水溶解，加入同位素标记牛乳血清白蛋白内标和碳酸氢铵溶液混匀，加入二硫苏糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化钙溶液和胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析，所述同位素标记牛乳铁蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；

（2）步骤（1）所得样品进行液相色谱分离；

（3）样品经步骤（2）色谱分离后进行质谱检测，所用牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所用同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

作为一个优选方案，步骤（1）中加入的胰蛋白酶的量与样品中蛋白质的量比例为1:50-1:100。

作为一个优选方案，步骤（1）中碳酸氢铵溶液的溶度是50mmol/L，二硫苏糖醇溶液的浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺溶液的浓度是500mmol/L，氯化钙溶液的浓度是100mmol/L，胰蛋白酶溶液的浓度是200μg/mL。

作为一个优选方案，步骤（2）液相色谱分离条件如下：C18（孔径300）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

作为一个优选方案，步骤（3）质谱检测条件如下：毛细管电压3.5kv，锥孔电压35kv，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气流量900L/min，锥孔反吹气流量30L/hr，碰撞室压力3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度150℃，提取器电压3.0V，入口透镜电压0.5V，出口电压0.5V，碰撞梯度1.0；所述牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，其质荷比为582.9m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.4m/z和213.2m/z，对应的碰撞能量分别为21eV和17eV；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，其质荷比为589.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.3m/z和219.1m/z，对应的碰撞能量分别为22eV和16eV。

本发明的优点在于，（1）本发明所开发的试剂盒使用经研究设计合成的同位素标记内标物，能够准确的对牛乳、配方粉以及天然原料等各类样品中的牛乳血清白蛋白进行定量检测，保证了结果的可靠性；（2）先进可靠的质量检测和控制方法，保证了试剂盒的质量和检测结果的重现性，可满足大批量样品检测的需求；（3）本发明试剂盒配制齐全，可简便地完成试剂配制，且易在一般实验室推广应用；（4）本发明可用于同时检测样品中非变性和热变性的牛乳血清白蛋白；（5）本发明所使用的试剂用量少，检测成本低。

附图说明

图1为本发明试剂盒所涉及的核心试剂整体外观照片。

图2为本发明中所选牛乳血清白蛋白特异肽在牛乳血清白蛋白一级结构中的位置。

图3为本发明中的牛乳血清白蛋白特异肽色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）。

图4为本发明中的同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）。

图5为本发明中的同位素标记牛乳血清白蛋白内标的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）。

图6为本发明中的同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽与牛乳血清白蛋白特异肽的线性比较图。

图7为本发明中同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽与牛乳血清白蛋白特异肽在不同基质中的基质效应比较图。

图8为本发明中的同位素标记牛乳血清白蛋白内标与牛乳血清白蛋白的酶解效率比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒的制备及验证

一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳血清白蛋白特异肽、同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标标准品（附图1），所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为：LVNELTEFAK；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为：LV^*NEL^*TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为：QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。本发明试剂盒的关键在于对特异肽和内标物进行同位素标记，试剂盒中的其他组分，可根据现有技术进行确定，例如参照中国发明专利CN102590413A中所用的试剂。

牛乳血清白蛋白特异肽（以下简称：特异肽）是从牛乳血清白蛋白经酶解后所产生的肽段中筛选所得，将牛乳血清白蛋白一级结构通过相关软件以胰蛋白酶为参数进行预测酶解，分析比较产生的理论酶解肽谱，发现LVNELTEFAK是牛乳血清白蛋白的特异肽段之一。经高液相色谱串联高分辨质谱鉴定表明：存在牛乳及其制品中的酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白等其他蛋白质中不存在或经牛胰蛋白酶酶解不产生与该氨基酸序列一致的肽段。该氨基酸序列是牛乳血清白蛋白经牛胰蛋白酶酶解后所特有的肽段（附图2），经化学合成、提纯后纯度可达99.0%以上，在本试剂盒中作为定量标准物质使用（附图3）。

同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽是一条依据牛乳血清白蛋白特异肽序列，经化学合成后的带有同位素标记氨基酸的特异肽段（以下简称：同位素特异肽）。其氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸，经合成、提纯后纯度可达95.0%以上，而且其中不存在特异肽。在本试剂盒中作为内标酶解后质谱标记物质使用（附图4）；

牛乳血清白蛋白同位素标记内标物是专门为定量测定而设计与合成的内标物（以下简称：同位素内标）。其氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。该肽段具有与牛乳血清白蛋白同样的酶解效率，酶解后可获得等量的同位素特异肽，可以对样品中的牛乳血清白蛋白做准确定量。经合成、提纯后纯度可达95.0%以上，而且在测定过程中不产生牛乳血清白蛋白特异肽。在本试剂盒中作为内标物质使用（附图5）。

各种合成肽的质量控制方法：

建立高效液相色谱（HPLC）和高效液相四级杆时间飞行串联质谱联用（HPLC-Q-TOF）检测方法对牛乳血清白蛋白特异肽，同位素特异肽，和同位素内标进行纯度与杂质鉴定。

应用HPLC检测合成肽的纯度

称取肽段1mg，加入1mL水溶解，再用水将溶解液定容到5mL，用HPLC-UV法在220nm波长下进行检测，面积归一法计算纯度。

应用HPLC-Q-TOF检测合成肽的杂质

称取肽段1mg，加入1mL水溶解，再用水将溶解液稀释20倍，用HPLC-Q-TOF法进行检测，通过全扫描视质量数的丰度来鉴别杂质。

其中液相色谱分离条件如下：C18（孔径300）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.08%（v/v）的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.08%（v/v）的三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

其中质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0，全扫描质量数区间200-2000m/z，停留时间100ms。

此外，所述试剂盒中还可包括：NH₄HCO₃（溶液使用浓度为50mmol/L），DTT（溶液使用浓度为500mmol/L），IAA（溶液使用浓度为500mmol/L），CaCl₂（溶液使用浓度为100mmol/L），胰蛋白酶（溶液使用浓度为200μg/mL），以及甲酸。

本发明同位素特异肽的设计与确定：

根据实验确定的牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列，充分考虑其相关理化性质以及在质谱检测过程中的干扰与离子化效率问题，并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的缬氨酸（V^*）和亮氨酸（L^*）设计合成了牛乳血清白蛋白同位素特异肽，其氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK。

保留时间、线性和基质效应等要素在一定程度上可反映被测物质的色谱分离和质谱离子化效率，为了验证本发明所设计的同位素特异肽与牛乳血清白蛋白特异肽，在色谱分离和质谱离子化过程中的行为是否最大程度上相近，实验设计比较了本发明中的同位素特异肽和牛乳血清白蛋白特异肽，在相同色质谱条件下的保留时间、线性及其在不同基质中的基质效应。分别配制相同浓度的本发明中的同位素特异肽和牛乳血清白蛋白特异肽，以及这两者的标准系列工作溶液，在相同的色谱质谱条件下进样分析，得两者的保留时间与线性回归方程（附图6）。结果表明本发明中同位素特异肽和牛乳血清白蛋白特异肽具有相同的保留时间，均为3.24min，由此可见本发明中同位素特异肽和牛乳血清白蛋白特异肽具有相同的色谱行为。两者的线性回归方程分别为y=23.32x-49.9和y=23.68x+0.96，由图6可见本发明中同位素特异肽和牛乳血清白蛋白的线性非常相近，说明两者在相同浓度时的信号响应相近，从而也表明两者在质谱中的离子化、碰撞碎裂等过程中具有相近的质谱行为表现。为了进一步验证两者的质谱行为差异，比较了两者在方法空白、鲜牛奶、乳酸奶、配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、浓缩乳清粉等不同基质中的基质效应（附图7），结果表明在不同基质中本发明的同位素特异肽在最大程度上保持了与牛乳血清白蛋白特异肽一致的质谱行为。

本发明同位素内标的设计与确定：

在配方食品等复杂基质样品中，蛋白的酶解过程存在众多的影响因素，可能影响蛋白的酶解效率，为消除这些不确定因素对定量结果带来的影响，在已设计选择并验证确定的同位素特异肽的基础上，充分考虑保留酶解位点的完整性并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的缬氨酸（V^*）和亮氨酸（L^*）设计合成了同位素内标，其氨基酸序列为QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，该同位素内标经碱性胰蛋白酶酶解后可产生同位素特异肽LV^*NEL^*TEFAK。

为了验证本发明中的同位素内标与牛乳血清白蛋白是否具有相近的酶解效率，设计进行了如下实验：

取空白溶剂、鲜牛奶、乳酸奶、配方奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉、浓缩乳清粉等不同基质按要求配制成蛋白质总含量不大于1mg/ml的溶液；将牛乳血清白蛋白和本发明的同位素内标配制成均含5μmol/L的混合标准溶液，准确吸取各基质溶液500μL两份，一份加入20μL混合标准溶液和480μL NH₄CO₃溶液；另一份加入500μL NH₄CO₃溶液，作为对照组。然后均加入10μL 500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL 500mmol/LIAA溶液，暗处静置30min，加入10μL 100mmol/L CaCl₂溶液和30μL 200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至2mL，然后过0.22μm微孔滤膜得到理论浓度为50nmol/L的同位素特异肽和带有本底值的特异肽；另外取牛乳血清白蛋白特异肽和本发明的同位素特异肽用流动相配制成浓度为50nmol/L的标准溶液，在相同的色谱质谱条件下进行检测分析，将各物质酶解后测得的对应特异肽浓度与理论浓度进行比较，计算得到不同基质中对应物质的酶解效率（附图8）。由图8可知，在不同样品基质中，本发明的同位素内标与牛乳血清白蛋白具有相近的酶解效率，因此保证了检测结果的准确性。

实施例2：本发明试剂盒中试剂的配制及其使用说明

一、试剂配制：

1、牛乳血清白蛋白特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质1管中（该管内装有已预先准确称量的牛乳血清白蛋白特异肽），超声溶解（30s），所得溶液即为100μmol/L的牛乳血清白蛋白特异肽标准储备液；

2、同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质2管中（该管内装有已预先准确称量的同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽），超声溶解（30s），所得溶液即为100μmol/L的同位素特异肽标准储备液；

3、同位素标记牛乳血清白蛋白内标标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质3管中（该管内装有已预先准确称量的同位素标记牛乳血清白蛋白内标物），超声溶解（30s），所得溶液即为100μmol/L的同位素内标标准储备液；

4、牛胰蛋白酶溶液的配制：准确移取10mL 1.0%乙酸水溶液，加入试剂1管中（（该管内装有已预先准确称量的牛胰蛋白酶，来源于牛胰腺，活力>10000BAEE units），经超声溶解（30s），所得溶液即为200μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；

5、碳酸氢铵溶液（NH₄HCO₃）的配制：准确称取3.95g NH₄HCO₃（试剂2）于100mL容量瓶中，加入超纯水超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的碳酸氢铵溶液；

6、碘代乙酰胺（IAA）溶液的配制：准确称取0.925g IAA（试剂3）于10mL容量瓶中，加入500mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的碘代乙酰胺溶液；

7、二硫苏糖醇（DTT）溶液的配制：准确称取0.7712g DTT（试剂4）于10mL容量瓶中，加入500mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液；

8、氯化钙（CaCl₂）溶液的配制：准确称取0.111g CaCl₂（试剂5）于10mL容量瓶中，加入超纯水约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为100mmol/L的氯化钙溶液。

二、样品前处理及分析：

称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为1mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入20μL 5μmol/L同位素内标和480μL 500mmol/L NH₄HCO₃溶液混匀，加入10μL 500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL500mmol/L IAA溶液，暗处静置30min，加入10μL 100mmol/L CaCl2溶液和30μL 200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1h，最后将酶解液定容至2mL，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析。

液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径300）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。

所述质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK，其双电荷质荷比为582.9m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.4m/z和213.2m/z，对应的碰撞能量分别为21eV和17eV；同位素特异肽的氨基酸序列为LV^*NEL^*TEFAK（其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸），其双电荷质荷比为589.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.3m/z和219.1m/z，对应的碰撞能量分别为22eV和16eV。

所述内标法计算过程如下：用牛乳血清白蛋白特异肽和同位素特异肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与酶解后的样品溶液在相同的液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中牛乳血清白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为牛乳血清白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛乳血清白蛋白特异肽的浓度，单位为nmol/L；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的牛乳血清白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛乳血清白蛋白特异肽的浓度，将此浓度代入含量计算公式C_x=n_a×M×N×10^-10,即可得到被测样品中牛乳血清白蛋白的含量C_x。公式中C_x为被测样品中牛乳血清白蛋白的含量，单位为g/100g；n_a为被测样液中牛乳血清白蛋白特异肽的浓度的值；M为牛乳血清白蛋白的分子量的值，为66433；N为样品稀释倍数。

实施例3.市售婴幼儿配方奶粉

称样品0.5g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入20μL 5μmol/L同位素内标和480μL 50mmol/L NH₄HCO₃溶液，加入10μL500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL 500mmol/L IAA溶液，暗处静置30分钟，加入10μL 100mmol/L CaCl₂溶液和30μL 200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至2mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳血清白蛋白的含量为0.18g/100g。

实施例4.浓缩乳清粉

称样品1.0g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，然后取样液2.5ml用水稀释至10ml，再准确吸取稀释液500μL，加入20μL 5μmol/L同位素内标和480μL 50mmol/L NH₄HCO₃溶液，加入10μL 500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL 500mmol/L IAA溶液，暗处静置30分钟，加入10μL 100mmol/L CaCl₂溶液和50μL 1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至2mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳血清白蛋白的含量为5.6g/100g。

实施例5.生鲜牛乳

称样品3.0g于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入20μL 10μmol/L同位素内标和480μL 50mmol/L NH₄HCO₃溶液，加入10μL 500mmol/L DTT溶液，50℃恒温反应30分钟，取出冷却至室温，加入30μL 500mmol/L IAA溶液，暗室静置30分钟，加入10μL 100mmol/L CaCl₂溶液和30μL 200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置1小时，最后将酶解液定容至2mL，取所得样液按照实施例2方法进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳血清白蛋白的含量为0.05g/100g。

本发明试剂盒的牛乳血清白蛋白定量检测方法的特点：定量限：0.003g/100g，重现性：RSD<5.0%（n=11），精密度：回收率：92.1～98.7%（n=6），试样预处理简单、快速、低成本，以及适用范围广阔。可对各类试样中常量和微量的非变性和热变性的牛乳血清白蛋白进行同时准确定量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括牛乳血清白蛋白特异肽，同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽和同位素标记牛乳血清白蛋白内标；所述牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LV*NEL*TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV*NEL*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸，所述试剂盒还包括氯化钙，碳酸氢铵，二硫苏糖醇，碘代乙酰胺，胰蛋白酶和甲酸，所述氯化钙的使用浓度是100mmol/L，碳酸氢铵的使用浓度是500mmol/L，二硫苏糖醇的使用浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用浓度是500mmol/L，胰蛋白酶的使用浓度是200μg/mL。

2.一种牛乳血清白蛋白定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理以释放特异肽：将待测样品用温水溶解，加入同位素标记牛乳血清白蛋白内标和碳酸氢铵溶液混匀，加入二硫苏糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化钙溶液和胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析，所述同位素标记牛乳血清白蛋白内标的氨基酸序列为QCPFDEHVKLV*NEL*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；

(2)步骤(1)所得样品进行液相色谱分离；

(3)样品经步骤(2)色谱分离后进行质谱检测，所用牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为LVNELTEFAK；所用同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的氨基酸序列为L(V*)NE(L*)TEFAK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；

步骤(1)中加入的胰蛋白酶的量与样品中蛋白质的量比例为1:50—1:100；

步骤(1)中碳酸氢铵溶液的浓度是500mmol/L，二硫苏糖醇溶液的浓度是500mmol/L，碘代乙酰胺溶液的浓度是500mmol/L，氯化钙溶液的浓度是100mmol/L，胰蛋白酶溶液的浓度是200μg/mL；

步骤(2)液相色谱分离条件如下：色谱柱为BEH300C18色谱柱，孔径柱温为40℃，流动相A为0.1％v/v的甲酸水溶液，流动相B为含0.1％v/v甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min；

步骤(3)质谱检测条件如下：毛细管电压3.5kv，锥孔电压35kv，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气流量900L/min，锥孔反吹气流量30L/hr，碰撞室压力3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度150℃，提取器电压3.0V，入口透镜电压0.5V，出口电压0.5V，碰撞梯度1.0；所述牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，其质荷比为582.9m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.4m/z和213.2m/z，对应的碰撞能量分别为21eV和17eV；所述同位素标记牛乳血清白蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，其质荷比为589.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为365.3m/z和219.1m/z，对应的碰撞能量分别为22eV和16eV。