CN111551657A - 一种用于生鲜奶品质评价的标记物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于生鲜奶品质评价的标记物，所述标记物为天青杀素1。本发明公开了上述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。本发明公开了上述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，取待测牛奶样品，提取乳清蛋白，对所得乳清蛋白进行酶解，然后采用液相色谱串联质谱法检测其中所述标记物以判断生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况。本发明通过建立天青杀素1与生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况之间的相关性，为科学、准确、简便评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况提供新依据。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种用于生鲜奶品质评价的标记物及其应用和评价方法。
背景技术
牛奶中主要营养物质包括蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和糖类等，也含有丰富的生物活性物质，但其组成受诸多因素的影响，其中奶牛乳腺感染病原菌是最为常见的引起生鲜奶品质变化的因素。奶牛患上乳房炎后，可直接造成牛奶废弃、产奶量减少、生鲜奶品质下降、治疗费用增加等经济损失。
监测奶牛健康状况，以确保提供优质牛奶是国内奶牛养殖场的重要工作之一。目前，奶中体细胞数是评价奶牛乳腺健康和生鲜奶品质最为常用的指标。一般认为，体细胞数低于20万/mL时为优质奶，该牛奶来源的奶牛健康；体细胞数在20万/mL和50万/mL之间时为合格奶，该牛奶来源的奶牛较为健康；体细胞数超过50万/mL时，该牛奶来源的奶牛呈临床型乳房炎。然而，日龄较大、胎次较高的奶牛所产牛奶中体细胞数时有变动，特别是奶牛受应激时所产牛奶体细胞数会增加，从而影响用体细胞数评价生鲜奶品质的准确性。
此外，目前奶中体细胞数的检测方法有显微镜镜检法、荧光显微镜计数法、加利福尼亚乳房炎试验(CMT)和高速体细胞计数法(如丹麦的fossmat-ic系列计数仪)等。显微镜镜检法是测定牛奶体细胞数的标准方法，但制备样品计数、镜检费时费力，不适于现场快速、大批量样品使用；荧光显微镜计数法的制片、镜检要花费许多时间，不适合于大量、快速的检测应用；加利福尼亚乳房炎试验(CMT)虽然快速，但不能得到具体的体细胞数，只能划分出1个大致的数量范围，并且操作者要有丰富的经验，否则容易引起误判；高速体细胞计数仪售价昂贵，不能普及使用。
基于以上背景乳品行业内亟需一种准确度更高、检测方法更为便捷的新标记物来评价奶牛乳腺感染状况和生鲜奶品质情况。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于生鲜奶品质评价的标记物及其应用和评价方法，通过建立天青杀素1与生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况之间的相关性，为科学、准确、简便评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况提供新依据。
一种用于评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物，所述标记物为天青杀素1。
一种上述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。
一种上述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，取待测牛奶样品，提取乳清蛋白，对所得乳清蛋白进行酶解，然后采用液相色谱串联质谱法检测其中所述标记物的含量以判断生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况。
优选地，当天青杀素1的相对含量小于等于106，则奶牛健康，生鲜奶品质优；当天青杀素1的相对含量大于106小于等于107，则奶牛可能患有隐性乳房炎，生鲜奶品质合格；当天青杀素1的相对含量大于107，则奶牛患有乳房炎，生鲜奶品质不合格。
优选地，液相色谱串联质谱法检测的具体操作如下：采用质量分数为0.1％的甲酸溶液溶解酶解肽段，然后注入液相色谱仪进行测定，色谱流出液注入质谱仪进行质谱检测。
优选地，液相色谱条件如下：以质量分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以质量分数为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为5：95混合液为流动相B，流速为300nL/min，梯度洗脱，进样量为5-10μL。
优选地，梯度洗脱具体如下：
| 时间(min) | 流动相B浓度(％) |
| 0 | 3 |
| 2 | 5 |
| 37 | 25 |
| 45 | 45 |
| 48 | 90 |
| 60 | 90 |
优选地，质谱检测条件如下：喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55％；全扫描范围为300-2000m/z，全扫描分辨率为30000@m/z400，离子最大注入时间为200ms，AGC为1E6，碰撞能量为30％；二级扫描分辨率为15000@m/z400，离子最大注入时间为100ms，AGC为1E4。
优选地，将所得质谱原始RAW文件使用软件Skyline 4.1数据提取分析。根据目标肽段的峰面积定量分析，进一步计算得到目标蛋白在不同样品比较组中的相对表达量差异。
优选地，待测牛奶样品乳清蛋白提取的具体步骤如下：取待测牛奶样品，在2500-4000×g，4-6℃条件下离心15-40min，收集中间乳清层，调节乳清的pH值至4.6，然后在10000-15000×g，4-6℃条件下离心10-30min，收集上层清液，得到乳清蛋白。
优选地，对所得乳清蛋白进行酶解的具体操作如下：向所得乳清蛋白中加入浓度为50-100mmol/L的二硫苏糖醇，再加入浓度为50-100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光，接着加入胰蛋白酶溶液，乳清蛋白与胰蛋白酶质量比为25-80：1，37℃孵育过夜，再加入甲酸溶液，接着12000-14000×g，离心20-40min，取上层液进行干燥得到酶解肽段。
现有技术中体细胞数受影响因素较多，奶牛受应激时体细胞数会增加，导致评价不准确。本领域技术人员也发现奶中急性期蛋白包括结合珠蛋白、血清淀粉样蛋白A和α酸性糖蛋白以及抗菌肽含量与乳腺感染存在显著的正相关，可作为监测奶牛乳腺感染的标记分子；但是牛奶中也存在一定量的急性期蛋白和抗菌肽，阻碍了判定结果的准确性。
而牛奶中天青杀素1主要来源于多形核白细胞，由白细胞裂解释放，参与宿主防御，用于杀灭侵入的病原微生物，能够准确反映奶牛炎症情况，因此作为标记物更准确，但缺少更多的研究。
本发明提供一种评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物——天青杀素1，能够用于评判生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况，结果更加准确可靠，弥补了依据体细胞数评判时的不准确性，同时检测步骤简便、准确，可为牧场防控奶牛乳腺感染，生产优质牛奶提供科学的评判依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
安徽某规模化奶牛场，存栏奶牛400头，其中成年母牛320头。牛场建有标准化牛舍，集约化饲养方式。采集奶样前，先擦干净乳头，然后用碘酊消毒，再次擦洗，弃去头两把奶，无菌采集牛奶样品至塑料试管中，标记样品编号等信息，冷藏保存。
(1)挑选2-4胎无肢蹄疾病、无应激状态的奶牛根据体细胞判断标准，选取临床健康的奶牛和患有乳房炎的奶牛各15头；
以15头健康的奶牛为A组，从每头奶牛上采集5mL牛奶作为待测样品，依次编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15；
以15头患有乳房炎的奶牛为B组，从每头奶牛上采集5mL牛奶作为待测样品，依次编号为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B15。
(2)将上述待测牛奶样品A1-A15和B1-B15，在3000×g，5℃条件下离心30min，收集中间乳清层，调节乳清的pH值至4.6，然后在13000×g，5℃条件下离心20min，收集上层清液，得到乳清蛋白；
(3)分别向80μL上述所得乳清蛋白中加入浓度为40mmol/L的二硫苏糖醇，再加入浓度为100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光，接着加入20μL胰蛋白酶溶液，然后采用碳酸氢铵溶液洗涤2次，37℃过夜后再加入适量甲酸溶液，接着在13000×g，5℃条件下离心30min，取上层液进行干燥得到酶解肽段；
(4)将2μg酶解肽段用质量分数为0.1％的甲酸水溶液溶解，采用LTQ-OrbitrapElite质谱仪联合Easy-n LC 1000高效液相组成的串联LC-MSn(配备Easy-spray分析柱，C18，2μm，
75μL×50cm)进行分析：
液相色谱条件如下：进样量为8μL，以质量分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以质量分数为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为5：95混合液为流动相B，流速为300nL/min，梯度洗脱具体如下：
| 时间(min) | 流动相B浓度(％) |
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| 2 | 5 |
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| 45 | 45 |
| 48 | 90 |
| 60 | 90 |
质谱检测条件如下：喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55％；全扫描范围为300-2000m/z，全扫描分辨率为30000@m/z400，离子最大注入时间为200ms，AGC为1E6，母离子选取前20个，碰撞能量为30％；二级扫描分辨率为15000@m/z400，离子最大注入时间为100ms，AGC为1E4；
将所得质谱原始RAW文件使用软件Skyline 4.1对进行PRM数据分析。根据每个目标蛋白的对应候选肽段的PRM定量分析结果，分析得出每条肽段在样品组间的相对表达量比例，进一步计算得到目标蛋白在不同样品比较组中的相对表达量差异。
其结果如下所示：
由上表可知：健康组奶牛所产牛奶中天青杀素1相对含量小于等于106，而患乳房炎组奶牛所产牛奶中天青杀素1相对含量高于107，经T test分析，两组之间天青杀素1相对含量差异极显著(P<0.01)。因此证实：天青杀素1相对含量可以作为检验生鲜奶品质和/或奶牛乳房炎的标志物。
实施例2
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为1652268(107＞1652268＞106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为22万/mL(20万/mL＜22万/mL＜50万/mL)，证实本发明灵敏度高。
实施例3
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为10298609(＞107)，因此认为该待检奶牛患有乳房炎，所产生鲜奶品质不合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为68万/mL(＞50万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例4
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为3046842(107＞3046842＞106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为20万/mL，处于临界值，侧面证实本发明结论正确。
实施例5
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为631914(≤106)，因此认为该待检奶牛为健康奶牛，所产生鲜奶品质优秀。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为9万/mL(＜20万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例6
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为4572839(107＞4572839＞106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为41万/mL(20万/mL＜41万/mL＜50万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例7
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为6945970(107＞6945970＞106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为36万/mL(20万/mL＜36万/mL＜50万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例8
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为6230023(107＞6230023＞106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为43万/mL(20万/mL＜43万/mL＜50万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例9
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为44039(＜106)，因此认为该待检奶牛为健康奶牛，所产生鲜奶品质优。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为8万/mL(＜20万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例10
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为6765733(107＞6765733＞106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为41万/mL(20万/mL＜41万/mL＜50万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例11
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为8467559(107＞8467559≥106)，因此认为该待检奶牛患有隐性乳房炎，所产生鲜奶品质合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为48万/mL(20万/mL＜48万/mL＜50万/mL)，证实本发明结论正确。
实施例12
随机选取待检奶牛，采集5mL牛奶作为待测样品，采用与实施例1相同的处理和检测方法，测得该牛奶样品中天青杀素1的相对含量为19431880(＞107)，因此认为该待检奶牛患有乳房炎，所产生鲜奶品质不合格。再采用体细胞检测技术进行检测，其体细胞数量为245万/mL(＞50万/mL)，证实本发明结论正确。
由上述实施例证实：本发明提供一种评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况的标记物——天青杀素1，能够用于评判生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况，结果准确可靠，灵敏度高，可为牧场防控奶牛乳腺感染生产优质牛奶提供科学的评判依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于生鲜奶品质评价的标记物，其特征在于，所述标记物为天青杀素1。
2.一种如权利要求1所述标记物在评价生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况中的应用。
3.一种如权利要求1所述标记物用于生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况评价的方法，其特征在于，取待测牛奶样品，提取样品乳清蛋白，对所得乳清蛋白进行酶解，然后采用液相色谱串联质谱法检测其中所述标记物的含量以判断生鲜奶品质和/或奶牛乳腺感染状况。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，当天青杀素1的相对含量小于等于106，则奶牛健康，生鲜奶品质优；当天青杀素1的相对含量大于106小于等于107，则奶牛可能患有隐性乳房炎，生鲜奶品质合格；当天青杀素1的相对含量大于107，则奶牛患有乳房炎，生鲜奶品质不合格。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，液相色谱串联质谱法检测的具体操作如下：采用质量分数为0.1％的甲酸溶液溶解酶解的肽段，然后注入液相色谱仪进行测定，色谱流出液注入质谱仪进行质谱检测。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，液相色谱条件如下：以质量分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以质量分数为0.1％的甲酸水溶液与乙腈按体积比为5：95混合液为流动相B，流速为300nL/min，梯度洗脱。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，质谱检测条件如下：喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55％；全扫描范围为300-2000m/z，全扫描分辨率为30000@m/z400，离子最大注入时间为200ms，AGC为1E6，碰撞能量为30％；二级扫描分辨率为15000@m/z400，离子最大注入时间为100ms，AGC为1E4。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，牛奶样品提取乳清蛋白的具体步骤如下：取待测牛奶样品，在2500-4000×g，4-6℃条件下离心15-40min，收集中间乳清层，调节乳清的pH值至4.6，然后在10000-15000×g 4-6℃条件下离心10-30min，收集上层清液，得到乳清蛋白。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，对所得乳清蛋白进行酶解的具体操作如下：向所得乳清蛋白中加入浓度为50-100mmol/L的二硫苏糖醇，再加入浓度为50-100mmol/L碘乙酰胺溶液，室温避光，接着加入胰蛋白酶溶液，乳清蛋白与胰蛋白酶质量比为25-80：1在37℃过夜，再加入甲酸溶液，接着12000-14000×g，离心20-40min，取上层液进行干燥得到酶解肽段。
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