CN103642895B - 一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学领域，公开了一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒。本发明利用人α-乳白蛋白酶解后所获得的特异多肽序列CELSQLLK，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法提供了一种全新的准确定量检测方法对人α-乳白蛋白进行定量检测，具有较高的准确度、精密度和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，更具体的说是涉及一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒。
背景技术
早在上世纪80年代，母乳喂养的优点已被世界上很多学术机构发现，并且有很多论文证实了其优越性。母乳给婴儿提供了均衡的蛋白质，脂肪，碳水化合物，矿物质和维生素，使婴儿能够健康成长。
现代社会中，婴儿由于种种原因无法完全使用母乳喂养，只能部分或者完全用牛乳来替代母乳喂养。牛乳中的营养物质组成与母乳有很大区别。例如每100mL牛乳中含3.4g蛋白质，其中约80%蛋白质为酪蛋白，剩下的20%为乳清蛋白；而母乳中的这三个数值分别为1.1g、40%以及60%。酪蛋白进入婴儿胃中会凝结成块，不利于吸收；而乳清蛋白则不会出现此类现象，其在婴儿体内的吸收利用效率远远大于酪蛋白。牛乳中的乳清蛋白不仅含量低于母乳，而且其组成部分也有所区别：牛乳清蛋白主要由α-乳白蛋白与β-乳球蛋白构成，而母乳中主要含有α-乳白蛋白，不含有β-乳球蛋白。为了研制更接近母乳的配方奶粉，一般都会向牛乳中添加符合母乳比例的α-乳白蛋白。
母乳中的营养物质含量在个体之间变化很大，主要受母亲身体状况、饮食、哺乳阶段、气候、哺乳方式等因素影响。为了更精确地向配方奶粉中添加α-乳白蛋白，以适合各个成长阶段婴儿的营养需求，需要对各种阶段、条件下的母乳中的α-乳白蛋白进行准确定量检测，其中的关键即是建立准确定量检测人α-乳白蛋白的检测方法。
国内外蛋白质的定量检测方法主要有液相色谱法、毛细管电泳法、凝胶分子体积排阻色谱以及酶联免疫法等方法。前三类方法均采用了紫外检测器，但是和人α-乳白蛋白吸收光波长相接近的干扰蛋白很多，导致其检测灵敏度低，选择性低，不适宜用于定量检测母乳这样基质复杂，蛋白质种类多的样品。酶联免疫利用抗原抗体特异性结合能力对蛋白质进行检测。由于缺乏标准品，以及抗体对其他母乳蛋白质的交叉反应，使得酶联免疫法也无法应用于母乳蛋白质的准确定量检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒，使得所述方法能够准确定量检测母乳中α-乳白蛋白含量，使得所述方法的灵敏度、精密度和基质效应符合现有标准。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法，包括如下步骤：
步骤1、将待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，取10μL稀释母乳样品，然后加入20μmol/L同位素内标物溶液10μL、50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液945μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL酶解，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，以内标法获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；
步骤2、取梯度浓度的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液各10μL，分别加入20μmol/L同位素特异肽标准品溶液10μL，50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液955μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液浓度的标准曲线，将步骤1得到的人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入标准曲线获得母乳样品中人α-乳白蛋白特异肽的浓度，然后按下式计算获得人α-乳白蛋白含量；
人α-乳白蛋白含量=母乳样品中α-乳白蛋白特异肽摩尔浓度×人α-乳白蛋白摩尔质量×母乳样品稀释倍数；
其中，所述同位素内标物为如SEQIDNO:1所示序列的多肽且从N段起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素标记，如下：
AKQFTKCELSQL*L*KDIDGYGGIA，其中*表示为碳氮全同位素标记；
所述人α-乳白蛋白特异肽标准品和同位素特异肽标准品蛋白质序列均为如SEQIDNO:2所示序列的多肽，且同位素特异肽标准品序列从N段起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素标记。如下：
CELSQLLK；
CELSQL*L*K，其中*表示为碳氮全同位素标记。
本发明所述方法并不局限于上述所记载的数值，本领域技术人员也可以在本发明定量检测原理基础上更换其他数值。本发明计算公式中的母乳样品稀释倍数包括待测母乳样品所有的稀释操作，即一开始的用碳酸氢铵稀释以及后续的和所有反应溶液混合后所产生的稀释。
其中，本发明作为优选，所述待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液按体积比1:9稀释。以此为例对计算公式中的稀释倍数加以说明，即待测母乳样品一开始稀释10倍，而在后续的检测中取10μL稀释的待测母乳样品反应，总反应体积为1000μL，即稀释了100倍，总稀释倍数为1000倍，则本发明计算公式中的稀释倍数应为1000。
此外，本发明方法所做标准曲线为方便代入计算，可进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为人α-乳白蛋白特异肽的摩尔浓度；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。
本发明以牛胰蛋白酶酶解人α-乳白蛋白，在产生的众多人α-乳白蛋白所独有的酶切产物肽段中选择适宜的特异肽，这些酶切产物肽段只能由人α-乳白蛋白酶解产生，不存在于其他人乳蛋白质以及其他物种乳蛋白质中，本发明从中选择适宜的肽段，并根据该肽段的氨基酸序列设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法提供了一种全新的准确的定量检测方法，解决了现有定量检测方法的缺陷。
本发明定量检测方法和试剂盒中，人α-乳白蛋白特异肽标准品是指人α-乳白蛋白经筛选酶解后所产生的肽段，即SEQIDNO:2所示序列的多肽，CELSQLLK；其是人α-乳白蛋白的特异肽段之一，利用BLAST功能搜索对比网上数据库以及使用高分辨液相色谱串联质谱法检测鉴定结果表明：存在于母乳或其他乳品中的其他蛋白质不存在与该氨基酸序列一致的氨基酸序列和胰蛋白酶酶解肽段。该氨基酸序列是人α-乳白蛋白经胰蛋白酶酶解后所特有的肽段。经化学合成、提纯后纯度可达99.0%以上，在本发明定量检测方法中作为建立标准曲线使用；
同位素标记的人α-乳白蛋白特异肽标准品是一条依据人α-乳白蛋白特异肽序列，经化学合成后的带有同位素标记氨基酸的特异肽段，在本发明中称为同位素特异肽。其氨基酸序列为CELSQL*L*K，其中L*为碳氮全同位素标记的亮氨酸，经合成、提纯后纯度可达97.0%以上，而且其中不存在人α-乳白蛋白特异肽。在本发明定量检测方法中作为建立标准曲线使用；
同位素标记的人α-乳白蛋白内标是专门为定量测定而设计与合成的内标物，在本发明中称为同位素内标物。同位素内标物的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示且亮氨酸被碳氮全同位素标记，具体为AKQFTKCELSQL*L*KDIDGYGGIA，其中L*为碳氮全同位素标记的氨基酸。该肽段具有与人α-乳白蛋白同样的酶解效率，可获得等摩尔量的同位素特异肽，可以对样品中的人α-乳白蛋白做准确定量。经合成、提纯后纯度可达97.0%以上，而且在测定过程中不产生特异肽。在本发明定量检测方法中作为内标物质使用。
作为优选，所述牛胰蛋白酶溶液由盐酸和牛胰蛋白酶配制而成，所述牛胰蛋白酶比活>3000unit/mgprotein。
作为优选，所述酶解为在37℃恒温酶解2h。
作为优选，所述梯度浓度的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液按照以下方法配制：
分别取1mmol/Lα-乳白蛋白特异肽溶液1μL、10μL、20μL、30μL、40μL和50μL，加碳酸氢铵溶液至1mL。
作为优选，步骤1和步骤2所述反应均为在60℃恒温反应30min。
作为优选，所述高效液相色谱分离条件：
色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为体积百分比为0.1%的甲酸的乙腈溶液，流动相B为体积百分比为0.1%的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
其中，所述梯度洗脱优选为：
洗脱时，流动相A的体积百分比由3%耗时10min上升至40%，对应地流动相B的体积百分比由97%耗时10min下降至60%，然后改为100%流动相A冲洗2min，最后改为流动相A体积百分比3%和流动相B体积百分比97%保留3min。
作为优选，所述三重四级杆质谱检测条件为：
毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。
此外，本发明还提供一种定量检测人α-乳白蛋白含量的试剂盒，包括同位素内标物、人α-乳白蛋白特异肽标准品、同位素特异肽标准品；
所述同位素内标物为如SEQIDNO:1所示序列的多肽且从N段起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素标记，所述人α-乳白蛋白特异肽标准品和同位素特异肽标准品蛋白质序列均为如SEQIDNO:2所示序列的多肽，且同位素特异肽标准品序列从N段起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素标记。
作为优选，所述试剂盒包括同位素内标物溶液、人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液、同位素特异肽标准品溶液、二硫苏糖醇溶液、碳酸氢铵溶液、碘代乙酰胺溶液、牛胰蛋白酶溶液和纯甲酸。
进一步优选地，所述牛胰蛋白酶溶液由盐酸和牛胰蛋白酶配制而成，所述牛胰蛋白酶比活>3000unit/mgprotein。
更优选地，各组分浓度如下：
20μmol/L同位素内标物溶液、1mmol/L人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液、20μmol/L同位素特异肽标准品溶液、50mmol/L二硫苏糖醇溶液、50mmol/L碳酸氢铵溶液、150mmol/L碘代乙酰胺溶液、200μg/mL牛胰蛋白酶溶液、纯甲酸。
按照本发明所述方法对待测母乳样品进行定量检测，定量限为0.50mg/100mL，日间精密度RSD为1.74%，平均回收率为100.58%，基质效应为0.55%，优于欧盟2002/657/EC指令标准，准确性较其他非特异性的定量检测方法更加准确。
由以上技术方案可知，本发明利用人α-乳白蛋白酶解后所获得的特异多肽序列CELSQLLK，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法提供了一种全新的准确定量检测方法对人α-乳白蛋白进行定量检测，具有较高的准确度、精密度和灵敏度。
具体实施方式
本发明公开了一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：同位素特异肽和人α-乳白蛋白特异肽的一致性
本发明引入了同位素特异肽的目的是为了克服由提取试剂以及基质所引起的基质效应。为了验证本发明所设计的同位素特异肽对人α-乳白蛋白特异肽在相同基质下结果的一致性，实验设计比较了同位素特异肽对人α-乳白蛋白特异肽在同一液相色谱以及质谱条件下的保留时间，子离子裂解方式以及线性。
分别配制本发明中的特异肽与同位素特异肽的标准系列工作溶液，在相同的色谱质谱条件下进样分析，得其保留时间与线性回归方程。其中本发明中的人α-乳白蛋白特异肽与同位素特异肽的保留时间均为6.08min，两者的线性回归方程有高度的一致性（分别为y=1437.5x-11115，R2=0.997；y=1383.1x-9667.3，R2=0.997），充分证明这两者在液相色谱行为方面的一致性。
人α-乳白蛋白特异肽的三个子离子的质荷比分别是290.1m/z、588.5m/z和701.8m/z，其对应的裂解方式分别是b2、y5和y6。同位素特异肽所选择的子离子的质荷比分别是290.1m/z、602.5m/z和715.8m/z，第一个子离子不包含同位素标记的氨基酸，所以其质荷比与α-乳白蛋白特异肽对应子离子相比一致；后两个子离子均含有2个L*，故其质荷比提高了14。同位素特异肽的子离子裂解方式与α-乳白蛋白特异肽的裂解方式一致，均为b2、y5和y6。
由上述结果可知，本发明精心设计的同位素特异肽不但能够与人α-乳白蛋白特异肽在分子量上有所区分，避免了天然同位素丰度对本实验的影响，而且两者在理化性质、色谱行为，线性方程与裂解方式上能保持一致，满足了实验对内标的性质要求。
实施例2：同位素内标物和人α-乳白蛋白酶解效率的对比性
为了验证本发明中的同位素内标物与人α-乳白蛋白是否在各种基质中都具有更加相近的酶解效率，设计进行了如下试验：
将母乳用碳酸氢铵溶液按体积比1:9稀释，精密量取10μL稀释后的母乳于反应管中，向反应管中分别加入0、5、20、50、200μL的脱脂牛乳溶液（1g脱脂牛乳粉溶解于100mL50mM碳酸氢铵溶液中）作为基质，该基质可以模拟母乳中的各种营养成分，而对检测没有影响。随后加入碳酸氢铵溶液至总体积为945μL，加入10μL同位素内标与10μL二硫苏糖醇溶液，摇匀后于60℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。
结果显示，两者α-乳白蛋白特异肽的峰面积的相对标准偏差为6.50%，α-乳白蛋白特异肽与同位素特异肽峰面积比值的相对标准偏差为1.98%，说明本发明所涉及的同位素内标物具有与人α-乳白蛋白同样的酶解效率，可获得等量的同位素特异肽，能够有效排除基质效应对酶解以及质谱离子化所带来的影响，对样品中的人α-乳白蛋白做准确定量。
实施例3：试剂的配制
1、人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液的配制：准确移取1mL超纯水，加入已预先准确称量的人α-乳白蛋白特异肽的管中，超声溶解30s，所得溶液即为1mmol/L的α-乳白蛋白特异肽标准品溶液；
2、同位素特异肽标准品溶液的配制：准确移取1mL超纯水，加入已预先准确称量的同位素特异肽的管中，超声溶解30s，所得溶液即为20μmol/L的同位素特异肽标准品溶液；
3、同位素内标物溶液的配制：准确移取1mL超纯水，加入已预先准确称量的同位素内标物的管中，超声溶解30s，所得溶液即为20μmol/L的同位素内标物溶液；
4、牛胰蛋白酶溶液的配制：准确移取1mL1mmol/L盐酸溶液，加入已预先准确称量的牛胰蛋白酶的管中，（比活>3000unit/mgprotein），超声溶解30s，所得溶液即为200μg/mL的胰蛋白酶溶液；
5、碳酸氢铵（NH4HCO3）溶液的配制：准确称取1.98gNH4HCO3于500mL容量瓶中，加入超纯水超声溶解3min，待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为50mmol/L的碳酸氢铵溶液；
6、碘代乙酰胺（IAA）溶液的配制：准确称取277mgIAA于10mL容量瓶中，加入50mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解3min，待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为150mmol/L的碘代乙酰胺溶液；
7、二硫苏糖醇（DTT）溶液的配制：准确称取77mgDTT于10mL容量瓶中，加入50mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解3min，待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为50mmol/L的二硫苏糖醇溶液。
实施例4：本发明所述方法
1、仪器
液相色谱：AcquityUltraPerformanceLC（Waters公司，美国）
三重四级杆质谱：XevoTQMS（Waters公司，美国）
高效液相色谱分离条件：
色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为体积百分比为0.1%的甲酸的乙腈溶液，流动相B为体积百分比为0.1%的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
其中，梯度洗脱为：
洗脱时，流动相A的体积百分比由3%耗时10min上升至40%，对应地流动相B的体积百分比由97%耗时10min下降至60%，然后改为100%流动相A冲洗2min，最后改为流动相A体积百分比3%和流动相B体积百分比97%保留3min。
三重四级杆质谱检测条件为：
毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。
2、方法
将待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液按体积比1:9稀释，取10μL稀释母乳样品，然后加入20μmol/L同位素内标物溶液10μL、50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液945μL，摇匀后于60℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置30min，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，以内标法获得α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；
分别取1mmol/L人α-乳白蛋白特异肽溶液1μL、10μL、20μL、30μL、40μL和50μL，加50mmol/L碳酸氢铵溶液至1mL。
取上述梯度浓度的α-乳白蛋白特异肽标准品溶液各10μL，分别加入1mmol/L同位素特异肽标准品溶液10μL，50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液955μL，摇匀后于60℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，获得α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的α-乳白蛋白特异肽标准品溶液浓度的标准曲线。
根据得到的标准曲线进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为人α-乳白蛋白特异肽的摩尔浓度，单位为nmol/L；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将前述得到的人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到待测母乳样品中的α-乳白蛋白特异肽浓度。
将待测母乳样品中的α-乳白蛋白特异肽浓度代入含量计算公式人α-乳白蛋白含量=母乳样品中α-乳白蛋白特异肽摩尔浓度×人α-乳白蛋白摩尔质量×103，即可得到被测母乳样品中人α-乳白蛋白的含量。
实施例5：本发明所述方法日间精密度检测
选择同一来源的母乳样品在不同天数不同时间段进行多次检测，结果见表1。
表1日间精密度检测结果
由表2可知，本发明日间精密度RSD仅为1.74%，满足欧盟2002/657/EC指令对精密度<5.64%的要求，并远低于此标准，精密度更优。
实施例6：本发明所述方法定量限检测
选择3nmol/L的人α-乳白蛋白特异肽溶液进样分析，获得色谱峰的信噪比。以10倍信噪比为定量限，以实施例4方法为基础，代入公式α-乳白蛋白检出限=人α-乳白蛋白特异肽摩尔浓度×人α-乳白蛋白摩尔质量×103÷信噪比×10，计算得本方法定量限为0.50mg/100mL，在测定定量限的过程中，在人α-乳白蛋白特异肽摩尔浓度过低或达到本发明定量检测方法定量限临界点时，检测易受到干扰而导致信噪比波动，故为了严谨起见，本实施例进行了3次重复试验，取最高值作为本发明定量检测方法的定量限，具体结果见表2。
表2定量限检测结果
| 平行样品 | 信噪比 | 方法定量限[mg/100mL] |
| 1 | 133 | 0.31 |
| 2 | 85 | 0.50 |
| 3 | 150 | 0.28 |
实施例7：本发明所述方法回收率的检测
将待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液按体积比1:9稀释，取10μL稀释母乳样品，然后加入20μmol/L同位素内标物溶液10μL、15μmol/L（低浓度加标）、30μmol/L（中浓度加标）或者45μmol/L（高浓度加标）的人α-乳白蛋白特异肽溶液10μL、50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液935μL，摇匀后于60℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置30min，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，以内标法获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比，计算人α-乳白蛋白特异肽特异肽的浓度，从而推算出回收率。具体结果见表3。
表3回收率统计结果
由表3可知，本发明回收率为100.58%，满足欧盟2002/657/EC指令对回收率95-105%的要求，且数据接近100%，回收率较好。
实施例8：本发明所述方法基质效应的检测
分别取1mmol/L人α-乳白蛋白特异肽溶液1μL、10μL、20μL、30μL、40μL和50μL，加50mmol/L碳酸氢铵溶液至1mL。
取上述梯度浓度的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液各10μL，分别加入20μmol/L同位素特异肽标准品溶液10μL，50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液955μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液浓度的标准曲线。
取上述梯度浓度的α-乳白蛋白特异肽标准品溶液各10μL，分别加入20μmol/L同位素特异肽标准品溶液10μL，稀释后的母乳溶液10μL（待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液按体积比1:9稀释），50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液945μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液浓度的基质曲线。
基质效应可以通过比较标准曲线与基质曲线的斜率获得，具体结果见表4。
表4基质效应的检测结果
| 平行样品 | 标准曲线斜率 | 基质曲线斜率 | 基质效应 |
| 1 | 0.901852 | 0.907869 | 0.66% |
| 2 | 0.884986 | 0.889875 | 0.55% |
| 3 | 0.899036 | 0.895205 | 0.43% |
| 平均值 | 0.55% |
由表4可知，本发明基质效应为0.55%，满足欧盟2002/657/EC指令对基质效应<10%的要求，且数据远低于标准要求，表明本发明所述方法准确性较高，受基质效应的影响极低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将待测母乳样品用50mmol/L碳酸氢铵溶液按体积比1:9稀释，取10μL稀释母乳样品，然后加入20μmol/L同位素内标物溶液10μL、50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液945μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，然后加入200μg/mL牛胰蛋白酶溶液10μL酶解，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，以内标法获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；
步骤2、取梯度浓度的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液各10μL，分别加入20μmol/L同位素特异肽标准品溶液10μL，50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL以及50mmol/L碳酸氢铵溶液955μL进行反应，反应后加入150mmol/L碘代乙酰胺溶液10μL暗处静置，加入5μL纯甲酸后用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，获得人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液浓度的标准曲线，将步骤1得到的人α-乳白蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入标准曲线获得母乳样品中人α-乳白蛋白特异肽的浓度，然后按下式计算获得人α-乳白蛋白含量；
人α-乳白蛋白含量＝母乳样品中α-乳白蛋白特异肽摩尔浓度×人α-乳白蛋白摩尔质量×母乳样品稀释倍数；
其中，所述同位素内标物为如SEQIDNO:1所示序列的多肽且从N端起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素标记，所述人α-乳白蛋白特异肽标准品和同位素特异肽标准品蛋白质序列均为如SEQIDNO:2所示序列的多肽，且同位素特异肽标准品序列从N端起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素标记；
所述牛胰蛋白酶溶液由盐酸和牛胰蛋白酶配制而成，所述牛胰蛋白酶比活>3000unit/mgprotein；
所述梯度浓度的人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液按照以下方法配制：
分别取1mmol/L人α-乳白蛋白特异肽溶液1μL、10μL、20μL、30μL、40μL和50μL，加碳酸氢铵溶液至1mL；
所述高效液相色谱分离条件：
色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为体积百分比为0.1％的甲酸的乙腈溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酶解为在37℃恒温酶解2h。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述三重四级杆质谱检测条件为：
毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。
4.一种定量检测人α-乳白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括20μmol/L同位素内标物溶液、1mmol/L人α-乳白蛋白特异肽标准品溶液、20μmol/L同位素特异肽标准品溶液、50mmol/L二硫苏糖醇溶液、50mmol/L碳酸氢铵溶液、150mmol/L碘代乙酰胺溶液、200μg/mL牛胰蛋白酶溶液、纯甲酸；
所述同位素内标物为如SEQIDNO:1所示序列的多肽且从N端起第12位和第13位的亮氨酸被碳氮全同位素标记，所述人α-乳白蛋白特异肽标准品和同位素特异肽标准品蛋白质序列均为如SEQIDNO:2所示序列的多肽，且同位素特异肽标准品序列从N端起第6位和第7位的亮氨酸被碳氮全同位素标记。
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