CN1687426A - 生产重组人α－乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——转基因克隆大型家畜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产重组人α－乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α－乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下：(1)利用完整的人α－乳清蛋白基因结构构建乳腺特异表达载体，(2)构建双标记选择载体和单标记选择载体，通过电击方法进行细胞转染，获得转基因细胞，(3)利用转基因细胞为核供体进行体细胞克隆，获得含有人α－乳清蛋白的转基因克隆大型家畜。转基因乳腺特异表达的重组人α－乳清蛋白可以开发成保健品和药品，含重组人α－乳清蛋白的牛奶也可直接开发成高附加值的保健牛奶及奶制品。这样，转基因克隆动物就成为了“制药工厂”，为医用蛋白和蛋白保健品的开发和生产开辟了广阔的应用前景。

Description

生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器 —转基因克隆大型家畜的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及转基因—克隆技术领域。

背景技术

转基因动物研究是人类按着自已的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，而改变其遗传组成的目的是多种多样的。比如遗传学家希望通过改变动物的遗传组成来观察其表型变化，生理学家希望通过特定基因的表达来研究该基因对机体生理状况的影响。与动物生产有关的转基因研究则希望通过转基因技术来赋予动物新的表型性状。该项研究在实验技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。

转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射，逆转录病毒感染发育早期的动物胚胎，精子载体法，ES细胞技术，PGCs技术，体细胞核移植技术，逆转录病毒载体感染MII期的卵母细胞，精子头与DNA合并注射卵母细胞法。这些方法上的改进与提高大大地促进了转基因动物研究由实验室向生产实践转化的进程。

其中最传统和最常用的方法是原核期胚胎的显微注射，该方法由美国人Gordon发明，是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。即在显微操作仪下通过一毛细玻璃管将外源DNA注射进动物受精卵细胞的原核内，再将该受精卵细胞移植进受体细胞子宫内，再将该受精卵分裂时，外源DNA可能整合入宿主染色体组，待该受精卵发育成熟即可获得转基因动物。但是显微注射法获得的转基因家畜的效率极低，特别是牛，羊和猪等，往往低于1％，这将大大增加制作转基因家畜的成本。

随着体细胞克隆技术的发展，基因操作技术与克隆技术相结合是将成为转基因动物，特别是大家畜生产的主要方式。目前，取得的主要进展是转基因技术和靶位操作技术在克隆动物上的应用。首先，利用克隆进行转基因是指在核移植前，先把目的基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞，再通过标记基因的表现来筛选转基因的阳性细胞及其克隆，然后再移植。1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与罗斯林研究所的Wilmut等联手通过体细胞核移植技术率先在世界上制作了转基因绵羊。利用胎儿成纤维细胞系，经过转染之后，再克隆。被转染的外源基因含有人的凝血因子IX基因的完整编码区和β-BLG基因启动子，凝血因子IX能被高效表达，每毫升奶中包含125μg的凝血因子IX蛋白。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上讲，转基因成功率为100％。原核注射的方法会使大量的非转基因胚胎被怀孕，这是一种资源浪费，而利用克隆进行转基因技术不会造成代理母亲去怀孕非转基因动物。此外，利用克隆进行转基因时，转基因动物的性别会被提前决定。这样的话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因动物全是雌性动物。

由于动物转基因技术能按照人们的意愿改变动物的生产性状，得到人们所需要的产品，特别是一些蛋白药品及保健品，科学家们已经开始将动物转基因技术应用到实践当中，目前动物转基因技术主要有以下一些应用：(1)、促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质，(2)、动物抗病育种，(3)建立诊断和治疗人类疾病的动物模型，(4)生产药用蛋白。

动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的一百倍，是一种非常有潜力的高新技术。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶样中的蛋白含量高达23克/升，大约是动物细胞表达蛋白的400倍以上。该技术一经出现就得到迅猛的发展。目前，牛乳白蛋白基因人组织血纤维蛋白溶酶原因子，人生长激素基因，人体抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干扰素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表达。许许多多的著名科学家都认为这将是畜牧业前所未有的革命，可能会给社会带来巨大的经济效益。在过去的十年里，已经有十几家公司开展这方面的研究工作。尤其，随着动物克隆技术成熟，转基因技术得到了更充分的发展。这将使乳腺生物反应器的大规模生产更加现实，因此一场围绕该技术的国际性竞争将是必然。

乳腺生物反应器生产药物的优越性让药物蛋白基因表达在某一特定部位，而不是随机地在身体任意表达。科学家们一致认为，就药物而言，理想的表达场所是乳腺。主要有以下原因：1、动物乳腺是一个封闭的系统。乳腺组织表达的蛋白质绝大部分不会回到血液循环，这样就避免大量表达的外源性蛋白质对动物健康造成的危害。2、乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250～300kg，一只绵羊和山羊可生产乳蛋白25～30kg，即使一只家兔，一年生产乳蛋白也可达到3～5kg，如果把百分之一的乳蛋白合成医用蛋白，其产量就十分可观。3、乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品的生物学活性接近天然产品。4、在动物乳腺表达的外源基因可以遗传。一旦获得一个生产某种有价值蛋白质的动物个体，可以用常规畜牧技术繁殖生产群体，研究技术虽然复杂，费用高昂，但其研究生产的放大过程却较容易5、缩短新药上市周期。从药物生产开发周期方面来看，目前一种新药从它的研制开发、药审，直到上市，整个过程需要10～15年，如果利用转基因动物乳腺反应器，新药生产的周期约5年。6、可以获取巨额经济利润。如荷兰金发马公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从乳汁中提炼出来营养奶粉销售额是50亿美元。

利用乳腺生物反应器的方法改造奶牛、奶山羊，使生产出的奶成分近似于人奶，既有营养的功能，又有药用的功能，这种奶可以使孩子长得高大，促进大脑和神经发育，增强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阔的前途。改善奶的营养成份或生理生化特征也是人们希望通过改变动物的遗传组成来实现的目标之一，即制造所谓的营养药品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工产品可提供人类30％的营养蛋白，含有丰富的必需氨基酸、钙和无机磷酸盐，以及消化率很高的酪蛋白，是人类高质量的营养来源；但乳用家畜奶在品质上还不尽如人意。因此，人们一直在研究如何改善奶品质。自Gordon创立动物转基因技术以来，世界各国都争先开展转基因育种及其相关技术研究。研究表明外源基因不仅能在转基因动物中得到整合与表达，而且能获得组织特异性(乳腺组织、输卵管)和发育特异性表达，并且现在能够利用分子技术找到调节乳成分的所有基因。

牛乳的蛋白含量比人乳的高，牛乳为33g/L，而人乳仅为10g/L。其中最重要的是人乳中乳清蛋白含量(68％)比酪蛋白(32％)比例高，具有免疫活性的乳铁蛋白(15％)和溶菌酶(4％)含量高，且缺乏β-乳球蛋白和κ-酪蛋白。然而，牛乳中含有较高的各种酪蛋白，相应的乳清蛋白含量较少。蛋白牛乳中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是主要过敏原，新生儿大约7.5％有肠胃、皮肤和呼吸过敏反应，这有望通过转基因技术封闭、缺失β-乳球蛋白基因或在牛乳腺细胞中插入人乳蛋白基因来调节它的表达水平，从而使牛乳更加接近人乳，满足消费者需求。动物生物反应器是目前世界范围内转基因研究的热点之一，不仅各国政府投资，一些私人财团也不惜投入大量资金加以研究和开发。

α-乳清蛋白是分子量小、酸性的，高亲和性的Ca²⁺结合蛋白，它几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中。在乳腺分泌细胞中，α-乳清蛋白作为调节亚基通过与半乳糖甘转移酶相互作用催化乳糖的合成。最近还发现α-乳清蛋白的不同的折叠突变体具有杀菌和诱导肿瘤细胞死亡的功能，还能与油酸形成复合物杀死皮肤的乳突淋瘤，具有广阔的应用前景。

α-乳清蛋白的功能：

(1)α-乳清蛋白的营养价值。由于α-乳清蛋白是人乳中重要的组成成分，约占总蛋白含量的28％，占乳清蛋白含量的49％，可以想象，α-乳清蛋白除了生理功能以外，还是乳汁中重要的营养成分。如果比较人奶和牛奶蛋白质的氨基酸组成，就会发现，牛奶中色氨酸和半胱氨酸的含量明显低于人奶中的含量，而造成这一结果的主要原因是牛奶中α-乳清蛋白的含量比较低。人乳中α-乳清蛋白色氨酸和半胱氨酸的含量(wt/wt)分别为6％和5％。色氨酸为必须氨基酸，必须由母乳供给，而半胱氨酸虽然不是必须氨基酸，但由于初生婴儿代谢系统不完善，如果食用牛奶的话，也可能造成半胱氨酸的缺乏。色氨酸和半胱氨酸也可能参与婴幼儿重要的生理活动。例如，色氨酸可能与睡眠行为有关，一直食用牛奶的婴幼儿，他们的睡眠可能会受到影响；而半胱氨酸是谷胱苷肽的组成部分，它可作为抗氧化剂，保护细胞免受氧化作用的伤害。因此，为使婴幼儿的奶制品更加营养合理，人们已开始尝试牛奶人乳化，我们实验室也正在开展这方面的工作。

(2)α-乳清蛋白调节乳糖合成的功能。人们很早就知道，α-乳清蛋白是乳糖合成酶的一个组成部分，葡萄糖存在条件下，与半乳糖苷转移酶结合在一起，调节该酶的专一性。由于α-乳清蛋白易于从半乳糖苷转移酶上解聚，可把它看成乳糖合成酶的一个调节亚基，因而在乳糖合成中起的是调节作用。这个酶的另一个亚基是半乳糖苷转移酶(GT)，它在多种分泌细胞中能够催化半乳糖残基从UDP-半乳糖到糖蛋白上。而在哺乳动物的乳腺中，专一性的半乳糖苷转移酶与α-乳清蛋白相互作用，通过这一过程可增加GT对葡萄糖的亲和性和专一性，使其催化底物对象变为葡萄糖，整个催化过程如下：

这个反应在高尔基体中发生，α-乳清蛋白与高尔基体内膜上的半乳糖苷转移酶结合形成乳糖合成酶，这种结合使乳糖合成酶对于葡萄糖的亲和力大大增加。由于α-乳清蛋白是连续分泌的，因此，它对于乳糖合成的维持是十分必要的。从已知的各种动物乳中乳糖和α-乳清蛋白的含量看，它们二者之间以及它们与乳的分泌量之间呈正相关。乳糖的合成开始总与α-乳清蛋白的出现相伴，这在许多实验中已得到证明。另外，体内实验和体外实验表明，α-乳清蛋白的合成受催乳素或胎盘催乳素以及糖皮质激素的影响，但怀孕期可被孕酮抑制。

金属离子在乳糖合成酶中的作用还不十分清楚，如乳糖合成酶的催化活性需要Mn²⁺参与，而半乳糖苷转移酶和α-乳清蛋白都能与Mn²⁺紧密结合。推测Mn²⁺的作用之一可能在酶复合体中起桥梁作用。

在乳糖合成酶中，Ca²⁺与α-乳清蛋白结合的作用也不清楚。但Zn²⁺与α-乳清蛋白结合可以调节乳糖合成酶的功能，它可能具有重要的生物学意义。由于Zn²⁺结合改变了乳糖合成酶的米氏常数Km和最大反应速度Vmax，并且这种改变还受Mn²⁺浓度的影响，Zn²⁺可引起Mn²⁺激活的乳糖合成酶表观米氏常数Km和最大反应速度Vmax的降低，从而引起乳糖合成酶活性先升高后降低的现象。在高Mn²⁺浓度时，Zn²⁺则降低乳糖合成酶的活性。

(3)α-乳清蛋白的杀菌和诱导细胞凋亡的功能。Pelligrini等人发现用胰蛋白酶和糜蛋白酶水解α-乳清蛋白，产生了三种具有杀菌特性的多肽，这些多肽对绝大多数革兰氏阳性菌起作用，这说明α-乳清蛋白被内肽酶降解后具有抗菌作用。Hakansson et al发现了一种α-乳清蛋白构象的突变体，这个突变体对抗生素敏感和有抗性的肺炎链球菌都具有杀伤能力。具有杀菌活性的蛋白可通过离子交换和凝胶色谱从酪蛋白中分离出来。更为有趣的发现是天然状态的α-乳清蛋白，在有C18:1脂肪酸存在下，可以转变成具有杀菌活性的形式，正如前面所提到的，α-乳清蛋白拥有几个脂肪酸结合位点。

近来Hakansson和Svensson等描述了α-乳清蛋白可能的更为吸引人的功能，他们发现一些多聚体，虽然不能完全代表α-乳清蛋白衍生物的特性，但它们是有效的Ca²⁺增加和编程死亡的诱导剂，具有广泛的细胞毒性，能够杀死所有实验的胚胎和淋巴细胞。多聚体的α-乳清蛋白形式可以从奶的酪蛋白部分分离出来。进一步研究发现，α-乳清蛋白诱导编程死亡的部分包含着该蛋白的寡聚体，而寡聚体又要经历类似熔球构象的改变，寡聚化似乎保持着α-乳清蛋白具有生物活性的熔球状态。前面已经提过，在Zn²⁺存在下，可以得到α-乳清蛋白的积聚体，但却不知道它们有没有细胞毒性。多聚化的α-乳清蛋白结合到细胞表面，进入细胞质并在细胞核中积累；同时，我们也发现脱离子的α-乳清蛋白和Zn²⁺结合与磷脂膜的相互作用比Ca²⁺结合蛋白与磷脂膜的相互作用更有效，这两个现象是完全一致的。Kohler等人也指出聚合的α-乳清蛋白可激活Caspases，并诱导编程死亡，而且α-乳清蛋白直接作用线粒体，引起细胞色素C的释放，这是细胞编程死亡起始非常重要的一步。

(4)α-乳清蛋白具有治疗乳突淋瘤的功能：对于人α-乳清蛋白，最近最激动人心的研究是发现α-乳清蛋白油酸复合物能抑制并清除乳突淋瘤。乳突淋瘤是一种由角化细胞感染乳突淋瘤病毒所引起的，常见的肿瘤，通常发生在皮肤和粘膜上皮。皮肤乳突淋瘤一般是良性的，而粘膜上皮乳突淋瘤会引起其它一些恶性肿瘤。Gustafsson等人(2005)利用阳离子交换层析获得人α-乳清蛋白与C18:1脂肪酸复合物，对40个乳突淋瘤病人进行随机的、以安慰剂为对照，双盲的局部治疗，一期治疗结果显示，75％的病人乳突淋瘤病灶明显缩小，而对照组只有15％；二期治疗两年后，83％的病人乳突淋瘤病灶清除，而且没有任何副作用，表明α-乳清蛋白油酸复合物对于乳突淋瘤具有良好疗效。α-乳清蛋白油酸复合物还具有广普的杀死肿瘤细胞的作用，并且对正常细胞没有损害。

目前人α-乳清蛋白主要从人奶中纯化，由于来源有限，限制了人α-乳清蛋白作为药用蛋白和保健品的使用，因此利用转人α-乳清蛋白基因的克隆牛乳腺生产重组人α-乳清蛋白将具有重要意义。

人、牛、山羊和绵羊的α-乳清蛋白基因分别被定位在第12、5、5和3号染色体上，世界上也已知得到多种编码α-乳清蛋白的基因。除小袋鼠的α-乳清蛋白基因外，其它物种该基因的转录单元长度都在2Kb左右，一般包括4个外显子。人和鼠α-乳清蛋白基因的序列和基因组最先研究清楚。人α-乳清蛋白基因全长2433bp，外显子长717bp，内含子长1636bp。人α-乳清蛋白基因序列含有Alu重复序列，该序列反向插入内含子I中，Alu序列在人类基因组中约有500,000拷贝，占人类总基因组的5％～6％，成员众多，大约有300,000种，故称Alu序列家族。人α-乳清蛋白基因中的Alu序列与Alu共同序列其同源性达88％，含有各种Alu和Alu样序列的保守内部组件。小袋鼠的该基因转录单元中除具有其它的四种相应的外显子序列，可能还有第五个外显子结构，在四个其它外显子5′端上游的一段序列没有任何调控序列存在，人们推测它可能包含了第五个外显子，但这还需要进一步证实。

目前对于人α-乳清蛋白，转基因研究报道并不多，主要侧重于α-乳清蛋白基因的调控和表达研究。日本的Fuiiwara等1997年利用210kb含人α-乳清蛋白基因完整表达调控单元进行转基因大鼠研究，在转基因大鼠奶中获得了2.0-4.3mg/ml人α-乳清蛋白的高效表达，并且不受位置效应的影响。Takase和Hagiwara利用人α-乳清蛋白基因cDNA进行了转基因烟草研究，在5g叶子中表达了具有天然活性的5mg人α-乳清蛋白。1999年Fuiiwara等做了大量的分析研究工作后，认为包含50kb的5’侧翼区和50kb的3’侧翼区的人α-乳清蛋白基因可以获得不受位置效应影响的稳定表达，但是只含有20kb的5’和20kb的3’侧翼区的转基因表达会受到位置效应的影响。2003年刘思国等人利用人α-乳清蛋白基因7.3kb的5’端调控区，2.0kb的编码区以及227bp的牛生长激素3’端调控区构建载体，在五只转基因小鼠中，仅有一只小鼠能检测到人α-乳清蛋白的表达(0.3mg/ml)，表明这个表达载体并不是很理想。

人α-乳清蛋白除了具有重要的营养价值之外，还具有杀菌作用，以及治疗肿瘤的功能。由于目前人α-乳清蛋白主要从人奶中提纯，来源有限，因此利用转基因动物特别是大家畜生产重组人α-乳清蛋白，将具有重要的应用前景。克隆技术的日趋成熟，不仅使动物转基因技术得到了更充分的发展和补充，也使利用乳腺生物反应器大规模生产各种重要的功能蛋白更加现实。采用基因组DNA作为目的基因制作转基因动物要比cDNA序列的获得更高效率的表达^[5]，但过大片段又不便于基因操作，因此获得高效表达的小结构转基因载体有着重要的意义。到目前为止，还不曾见到有α-乳清蛋白全基因组DNA的转基因报道。

发明内容

本发明针对上述领域中的空白，通过转基因、细胞转染技术和体细胞克隆技术相结合，提供一种生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器一人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，为我们实现牛奶人乳化及开发出重组人α-乳清蛋白保健品及药品奠定基础。

生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下：(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因结构构建乳腺特异表达载体，(2)构建双标记选择载体和单标记选择载体，通过电击方法进行细胞转染，获得转基因细胞，(3)利用转基因细胞为核供体进行体细胞克隆，获得有人α-乳清蛋白的转基因克隆大型家畜。

所述完整的人α-乳清蛋白基因是含有6.9kb的5’侧翼区和159bp的3’侧翼区，1-4外显子和1-3内含子，全长9459bp。

所述乳腺特异表达载体为phLa4，重组人α-乳清蛋白的转基因小鼠模型中表达的人α-乳清蛋白与天然人α-乳消蛋白大小一致，具有与天然人乳中乳清蛋白相同的免疫活性。

所述转基因小鼠的人α-乳清蛋白基因表达量达0.48-3.21g/l。

所述双标记选择载体为phLa4-EGFP-NEO，所述单标记选择载体为phLa4-NEO。

所述转基因细胞是通过G418进行筛选获得的阳性细胞。

所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。

所述大型家畜为牛。

在动物乳腺生物反应器的开发中，能够使外源基因获得不受位置效应影响的高效表达是至关重要的。本试验采用包含6.9kb的5’侧翼区和159bp的3’侧翼区的全长9.5kb人α-乳清蛋白基因建立转基因小鼠模型，获得了4只F0代及一只F1代整合阳性母鼠，乳汁中全部检测到了的人α-乳清蛋白，其中58号鼠表达量达到3.01g/L，超过了该蛋白在人乳中2.80g/L的含量，其它个体的表达量也均达到了克级。Southern杂交分析显示这5只母鼠均整合了1个拷贝的外源基因，表达量上虽有所差异，但表达水平基本上稳定，这说明此结构的表达受到位置效应的影响较小，且仅含有159bp的3’侧翼区的结构并不会显著降低人α-乳清蛋白基因的表达水平。本研究构建的结构包含了完整的这个5’区域，由此可见人α-乳清蛋白基因的表达，足够长的5’侧翼区是必不可少的，而3’侧翼区长度并不是影响表达的关键。这也是对人α-乳清蛋白基因表达调控机制更进一步的认识。

将人α-乳清蛋白高效表达于牛的乳腺，进而利用乳腺生物反应器生产人乳化牛乳。本研究侧重于获得一个便于基因操作且高效表达的人α-乳清蛋白转基因载体，继而开展转基因大动物乳腺生物反应器的研制。转基因小鼠模型的建立及分析表明，所构建的转基因载体具有结构较小，表达量较高，可以稳定遗传给后代且在后代中亦能获得高效表达等优点，为利用人α-乳清蛋白基因改造牛乳成份改善牛乳品质奠定了基础。

本发明将在小鼠乳腺中得到高效表达的phLa4表达载体连接上双标记选择载体pEGFP-NEO和单标记选择载体pNEO构建成phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO。利用电击转染及G418筛选取出转基因细胞，再进行单克隆培养。利用体细胞克隆技术获得转基因克隆牛，经PCR和Southern检测，共获得三头转有phLa4-EGFP-NEO的转基因克隆牛。根据转基因小鼠中重组人α-乳清蛋白表达情况，可以推测这些转基因牛也将高效表达具有生物活性的人α-乳清蛋白。这些转基因奶牛乳腺特异表达的重组人α-乳清蛋白将可以开发成保健品和药品，含重组人α-乳清蛋白的牛奶也可直接开发成高附加值的保健牛奶及奶制品。

利用乳腺特异表达的基因调控元件与目的基因构建成乳腺特异表达载体，将该载体导入动物基因组，从而获得能在乳腺特异高效表达外源药用蛋白的转基因动物即动物乳腺生物反应器。乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品的生物学活性接近天然产品，因此动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。这样，转基因克隆动物就成为了“制药工厂”，为医用蛋白和蛋白保健品的开发和生产开辟了广阔的应用前景。

本发明探索和完善了细胞转染技术和体细胞克隆技术相结合生产携带外源功能基因(目的基因自身调控元件)的转基因动物的途径，并极大提高了转基因动物，特别是转基因大家畜的制作效率，本发明所使用的技术路线适用于转基因牛、山羊、绵羊、猪和兔的基础群生产和扩繁。

附图说明

图1：人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4结构模式图

图2：引物为F1-F2的PCR检测转基因小鼠中α-乳清蛋白基因的整合M为100bp梯度DNA标准，H为人类基因组对照，P为阳性质粒对照，B为空白对照，N为野生型小鼠基因组对照，11、24、28、37、46、50、57、58为阳性小鼠。

图3：引物为F4-F5的PCR检测转基因小鼠中α-乳清蛋白基因的整合

M为100bp梯度DNA标准，H为人类基因组对照，P为阳性质粒对照，B为空白对照，N为野生型小鼠基因组对照，11、24、28、37、46、50、57、58为阳性小鼠。

图4：Southern杂交检测转基因小鼠中α-乳清蛋白基因的整合

M为梯度DNA标准，P10、P5、P1分别为阳性质粒的10、5、1拷贝对照，N为野生型小鼠基因组对照，28、37、46、，50、57、58为F0代阳性小鼠基因组；50-2为F0代50号公鼠的后代阳性母鼠基因组。

图5 Western印迹分析F0代转基因阳性母鼠全乳样品

P5、P3、P1分别为人α-乳清蛋白纯品5μg、3μg、1μg，37、46、57、58分别为对应鼠号的全乳样品N为野生型小鼠的全乳样品对照。

图6：双标记选择载体pEGFP-NEO的结构图

EGFP为增强绿色荧光蛋白基因，NEO为新霉素抗性基因，IRES为核糖体结合位点，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，CMV-IE Enhancer为CMV-IE增强子，pEF321为EF了21启动子。

图7：单标记选择载体pNEO的结构图

NEO为新霉素抗性基因，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，pPGK为PGK启动子，Amp为氨苄抗性基因。

图8：phLa4-EGFP-NEO酶切后的线性图谱

human alpha-lactalbumin为人乳清α-乳清蛋白基因，GFP为增强绿色荧光蛋白基因，Neomycin为新霉素抗性基因，SalI，NotI，BamHI和MluI为酶切位点，Ampicillin为氨苄青霉素抗性基因

图9：phLa4-NEO酶切后的线性图谱

human alpha-lactalbumin为人乳清α-乳清蛋白基因，Neomycin为新霉素抗性基因，SalI，NotI，BamHI和MluI为酶切位点，Ampicillin为氨苄青霉素抗性基因

图10：hLA5’端引物的扩增结果。

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照；6：阴性对照；7：blank。

图11：hLA3’端引物的扩增结果。

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照；6：阴性对照；7：blank。

图12：GFP引物的扩增结果。

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照1；6：阳性对照2；7：阴性对照；8：Blank

图13：NEO引物的扩增结果

.M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照1；6：阳性对照2；7：阴性对照；8：Blank

图14：hLA转基因克隆牛的Southern结果。

泳道1为兴娃，泳道2为隆娃，泳道3和4为阴性对照，泳道5-7分别为1，2和5个拷贝的阳性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例

1实验材料

1.1质粒及菌株

宿主菌大肠杆菌DH5α和DH10B，pGEM-5Zf，pGEM-T购自Promega公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO购自Clontech公司

1.2实验动物

Holstein奶牛约3月龄的胎儿取自屠宰场，黄牛卵巢来自北京周边地区屠宰场。

1.3主要试剂

DMEM/F₁₂粉末、DMEM粉末培养基、台盼蓝(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；dNTP以及PCR引物购于上海生物工程公司；Taq酶购于中国农业大学农业生物技术实验室；内切酶SspI和BamHI为华美生物工程公司产品；IPTG、X-gal、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血蓝蛋白(KLH)均购自华美生物公司；饱和酚为鼎国生物工程公司产品；胰蛋白酶、青霉素链霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明质酸酶，HEPES，无脂肪酸BSA，细胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸钠，肝素钠，矿物油和其它无机盐均为Sigma公司产品。

1.4培养基的配制

SOB培养基：配置每升培养基，应在950ml去离子水加入：蛋白胨：20g酵母提取物：5g NaCl 0.5g.摇动容器室溶质完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，  用5mol/L NaOH调节到pH7.0。灭菌LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，调节PH值至7.5，定容制1000ml，高压灭菌。

LR固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，调节pH值至7.5，定容至1000ml，高压灭菌。

1.5试剂的配制

DMEM培养液：DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，链霉素100mg，Mill-Q超纯水定容到1升，PH 7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。使用时加10％的血清。

0.1％Trypsin/EDTA酶消化液：Trypsin 0.1g，KCl 0.04g，NaHCO₃，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用灭菌的Mill-Q超纯水溶解，定容至100ml，用0.2μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。

DPBS液：DPBS粉末9.7g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH7.0-7.2，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。无钙镁PBS溶液：KCl0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄12H₂O 2.88g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

Gimsa母液：Gimsa粉末0.5g，加少量甘油将Gimsa粉末在研钵中充分研磨。再加入甘油至总量为22ml，56℃保温2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色试剂瓶中，备用。

细胞裂解液：10mM Tris.Cl(PH 8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。

蛋白酶K贮存液：蛋白酶K100mg，溶于5mL灭菌水中，分装，-20度保存。

TBS液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高压灭菌。

G418贮液：1gG418溶于1mL 1mol/mLHEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，过滤灭菌，-20度保存。两倍电击缓冲液(2×HeBS)：280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，过滤灭菌，1mL分装，-20度保存。

1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)：121.1g Tris碱溶于800ml水中，用HCl调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5Mol/LEDTA(pH8.0)；126.1g乙二胺四乙酸二钠加入到800ml水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

RNase溶液：将RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

TE缓冲液：10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌。

5mol/L LiCl：30.2g氯化锂二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高压灭菌。

50×TAE：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。

氨苄青霉素(Amp)贮存液：将氨苄青霉素钠溶于灭菌水后用0.22μm的滤器过滤除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。

3mol/L NaAc(pH5.2)：24.604g无水乙酸钠溶于80ml水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至100ml，高压灭菌。

1mol/L CaCl₂：在200ml水中溶解54gCaCl₂.6H₂O，过滤除菌，分装成10ml每份，贮存于-20℃，制备感受态时取出一份稀释至100ml，过滤除菌，预冷备用。

溴化乙锭贮存液：在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4℃棕色瓶内保存。

DNA提取抽提缓冲液：50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/L NaCl，1％SDS。2×Cracking buffer：0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。

酚∶仿(1∶1)：等体积苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。

蛋白酶K溶液：用水配成20mg/ml，-20℃保存。

TCM199培养液：称TCM199粉末9.9g，NaHCO₃2.2g，丙酮酸钠0.1375g，EDTA0.372g，用1L超纯水定容，PH7.2-7.4，正压过滤灭菌，4℃保存。培养用工作液中加入10％FCS。

操作液H199：在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。

冲卵液：DPBS溶液中加入10％FCS。

透明质酸酶：透明质酸酶0.2g，溶于10ml无钙DPBS溶液中，过滤灭菌，-20℃贮存。

工作液：用冲卵液稀释10倍。

融合液：0.3M甘露醇，0.1mM MgSO₄，0.05mM CaCl₂，0.5mMHEPES，0.05％BSA，调PH至7.2-7.4，过滤灭菌。

成熟培养液：M199培养液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，lug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。

CR1aa培养液：

                成份       终浓度(mM)   加入量g/100ml

                NaCl           114.7      0.67

                KCl            3.1        0.023

                NaHCO₃        26.2       0.22

                Na Pyruvate    20.4       0.002

                Phenol Red     1μl/ml    100μl

将上述成份加入90ml ddH₂O中，待所有试剂彻底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。调整pH为7.4，用ddH₂O加到100ml，渗透压为265-285mOsm之间。过滤灭菌。

1.6主要仪器设备

1)CO₂培养箱：美国Forma Scientific Inc.

2)倒置显微镜和荧光显微镜：日本Nikon公司

3)培养皿、培养瓶、离心管和细胞冻存管：Nunc公司

4)电击仪：美国BTX公司(ECM 2001)

5)电泳仪：DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂

6)超净工作台：北京净化设备厂

7)-80℃超低温冰箱：日本SANYO公司

8)制冰机：日本SANYO公司

9)超纯水仪：美国MILLIPORE公司

10)低温离心机：Eppendoff公司

11)高速冷冻离心机：BECKMAN公司

12)凝胶成像系统：ALPHA INNOTECH公司

13)PHS-3C酸度计：上海虹益仪器厂

14)自动灭菌锅：日本SANYO公司

15)测序仪：ABI 377型DNA sequencer，美国PERKIN ELMER公司

16)恒温水浴仪：美国LIFESCIENCE公司

17)9700型PCR仪：美国PERKIN ELMER公司

18)ABI 377 DNA测序仪：美国PERKIN ELMER公司

1.7分析工具软件及网址：

同源性分析软件：DNAMAN

PCR引物设计软件：Oligo6.0

DNA序列分析软件：Chromas

DNA及蛋白序列数据库：NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein

2实验方法

2.1人乳清蛋白转基因小鼠模型的建立

2.1.1转基因表达载体的构建

根据GeneBank序列(X05153)设计引物F1(上游)：5’GAGTGATGCTTCCATTTCAG 3’F2(下游)：5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’。扩增人α-乳清蛋白基因5’端非编码区与第一内含子之间(包含第一外显子)的790bp的片段，反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min。

利用这对引物从Clontech laboratories.Inc.公司粘粒文库中筛选出含有人α-乳清蛋白基因的克隆(命名为phLal)。利用NotI和NdeI双酶切阳性克隆，回收8.5kb的片段，与pGEM-5Zf载体相连，得亚克隆hLa2。将末端测序结果与已知序列比较分析，发现这个克隆缺少包括部分第二内含子至第四外显子在内的大约1kb的片段。为获得完整的α-乳清蛋白基因，以人基因组DNA为模板扩增得到其3’端缺少的片段。设计引物F4-F5，同时在引物5’端分别添加一个酶切位点(F4 BglII，F5 NotI)和一个保护碱基T。F4(上游)：5’-TAGATCTAGGGGTTAGGGGAACT-3’F5(下游)：5’-TGCGGCCGCATTGAGTTGGTACAGACAGT-3’反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min。F4位于基因下游1375bp处，F5位于基因下游2521bp处，扩增1146bp的片段。将人α-乳清蛋白基因3’端的PCR扩增产物与pGEM-T载体相连，得到克隆phLa3，用BglII和NotI酶切该克隆，回收1.1kb的片段，并将此片段与BamHI和NotI双酶切过的phLa2片段相连，即得到人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4，酶切及测序鉴定其正确性。我们所构建的phla4载体含人α-乳清蛋白基因共9459bp，其中包括6.9kb的5’侧翼区和159bp的3’侧翼区。其结构模式如图1。

2.1.2转基因小鼠制备及鉴定

2.1.2.1显微注射

利用NdeI和NotI双酶切phLa4质粒回收9.5kb的DNA片段，透析纯化并稀释至2ng/μ的浓度注射受精卵的雄原核，然后移植于同期发情的假孕母鼠的输卵管中。

2.1.2.2目的基因整合的鉴定

取3周龄小鼠的尾巴组织样，提取基因组DNA。两对引物(F1-F2和F4-F5)做PCR检测，对68只F0代小鼠进行PCR检测获得到8只阳性小鼠(图2与图3)(其中11、24、28、50号为公鼠，37、46、57和58为母鼠)，整合率为11.7％；用EcoRI消化基因组，以(α32P)dCTP标记的利用EcoRI单酶切hLa4质粒所得α-乳清蛋白基因的1561bp片段做探针对PCR检测的阳性个体进行Southern杂交分析，进一步确证基因整合情况并估算整合拷贝数。依据Southern杂交结果确定整合拷贝数，50号整合拷贝数为8，其余5只阳性个体均为单拷贝整合(如图4)用EcoRI消化基因组，以(α32P)dCTP标记的利用EcoRI单酶切hLa4质粒所得1561bp片段做探针对PCR检测的阳性个体进行Southern印迹杂交分析。

2.1.2.3阳性转基因小鼠传代研究

将阳性小鼠与正常的非转基因小鼠配种获得F1代小鼠，两对引物(F1-F2和F4-F5)对后代小鼠做PCR检测，传代研究表明此结构可以获得较为稳定的遗传(表1)。

表1人α-乳清蛋白基因转基因小鼠数据统计表

                                             表达量/拷贝

DNA      阳性鼠号      性别      整合拷贝数               阳性后代数

                                                 数

                                                (g/L)     /后代总数

          11                      -           -           -

          24           

          -           -           -

          28                      1           -          1/10

          37            ♀           1          0.62        1/11

hLa4      50                      8           -           0/3

          46            ♀           1          0.48        8/11

          57            ♀           1          0.90        2/9

          58            ♀           1          3.21        2/16

          50-2          ♀           1          1.03        2/3

2.1.2.4 α-乳清蛋白在转基因小鼠乳汁中表达分析

在阳性转基因母鼠产后1周内取乳样。将50号转基因公鼠的一个后代阳性母鼠(50-2)与正常的非转基因小鼠配种，获取乳样，用以检测目的基因在阳性公鼠后代中的表达。利用PAGE凝胶电泳分析全乳及乳清样品，Western印迹法检测人α-乳清蛋白在小鼠乳汁中表达，放射免疫测定法测定其含量。Western印迹分析进一步证实了外源基因在四只F0代整合阳性母鼠乳样中全部获得高效表达(图5)，放射免疫测定含量分别为0.62g/L、0.48g/L、0.56g/L、3.21g/L；同时放射免疫测定F0代50号公鼠的后代阳性母鼠50-2号乳汁中含量为1.03g/L，证明由原代转基因公鼠遗传给后代的人α-乳清蛋白基因获得了稳定的表达。

2.2phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO表达载体构建

1).phLa4标记表达载体的构建策略

为了便于筛选阳性细胞，我们首先构建了含绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因双选择标记载体(pEGFP-NEO)以及新霉素基因单选择标记载体(pNEO)，然后分别将两个标记载体与此前构建的pBC-hLa载体连接构建成phLa-EGFP-NEO和phLa-NEO表达载体。

2)pEGFP-NEO的构建

用NotI和SalI酶切pBC1回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片断EGFP-IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与EGFP-IRES-NEO连接即构成pEGFP-NEO，如图6。

3)pNEO的构建

用NotI和SalI酶切pBC1回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pIRES-NEO并回收2kb片断IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与IRES-NEO连接即构成pNEO，如图7。

4)phLa4-EGFP-NEO表达载体构建

用NotI和SalI酶切phLa4和pEGFP-NEO，将两者连接即构成phLa4-EGFP-NEO，通过酶切及测序分析，确定phLa4-EGFP-NEO载体构建成功，载体图如下(图8)：

5)phLa4-NEO表达载体构建

用NotI和SalI酶切phLa4和pNEO，将两者连接即构成phLa4-NEO，通过酶切及测序分析，确定phLa4-NEO载体构建成功，载体图如下(图9)：

2.3细胞培养，基因转染及阳性细胞筛选

2.3.1胎儿成纤维细胞的原代培养

在超净工作台中将胎儿浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗几遍，以消毒过的手术器械取下耳部及脊背部的数块表皮组织于DMEM+10％FCS培养液里。

                                    ↓

在直径60mm平皿中将胎儿组织切碎成为1mm³大小的组织碎块，再将组织碎块转移至15ml离心管中，1000rpm下离心洗涤数次。

                                    ↓

用消毒玻璃弯头吸管将小组织碎块吸至25cm²培养瓶中，通过玻璃吸管弯头使组织块均匀分布在瓶壁上。

                                    ↓

小心翻转培养瓶(防止组织块落下)让组织块黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO₂培养箱中放置2～4h，待组织块贴壁后，再正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。

2.3.2胎儿成纤维细胞的传代、冷冻、及复苏

待种植的原代细胞生长至80％汇合时，将细胞一部分冷冻，一部分传代继续培养。

2.3.2.1传代

用消毒玻璃弯头吸管小心吸除培养瓶中的培养液，沿着细胞生长壁的对面瓶壁注入无钙镁PBS(37度温育)冲洗细胞两次，以祛除残余血清及细胞代谢物。

                                    ↓

用同样方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量为可覆盖细胞单层即可(直径100mm培养皿一般加入1ml消化液，35mm培养皿中加入200u L消化液)，放入培养箱中消化1-2min。在显微镜下观察，待细胞开始变圆时，用手指敲打培养皿壁，使细胞彻底脱壁，然后加入培养液终止消化。

                                    ↓

用消毒玻璃弯头吸管反复吹打，细胞，使其分散成为单个细胞，1000rpm下离心5min收集细胞。用培养液按1∶2或1∶3比例稀释并重新接种细胞至培养皿中培养。

2.3.2.2冷冻

贴壁细胞消化后，收集细胞于离心管中，在1000rpm下离心5min以去尽上清。

                                     ↓

加4度预冷的冷冻液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重悬细胞沉淀，使细胞浓度约为10⁷个细胞/ml，转移细胞至冻存管中。

                                     ↓

放入4度冰箱预冷30min，再把冻存管插于厚泡沫上后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。

2.3.2.3复苏

从液氮中取出冻存管，快速投入37度水浴中，开在水浴中不断快速摇动冻存管以迅速解冻。

                                     ↓

待冷冻液彻底解冻后，以新鲜培养液稀释10倍并将溶解液转移至离心管中，在1000rpm下离心5min去除DMSO以缓减冷冻液毒性。

                                     ↓

用新鲜的培养液悬浮细胞沉淀，将细胞稀释至所需浓度，继续培养。

2.3.3体细胞注射用DNA的准备

大提质粒phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO，以SalI酶切质粒，酶切反应如下：

质粒DNA               约10-20μg

10×反应buffer          20μl

限制性内切酶            10-20U

ddH2O                   补足体系至200μl

上述试剂加好后，混匀，37度水浴消化2h，取5μL酶切产物以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍体积无水乙醇和0.1倍体积乙酸钠(PH5.2)，混匀后置一20度过夜；12000rpm离心15min回收沉淀，70％乙醇洗涤一次，真空干燥，加TE溶解。

2.3.4牛胎儿成纤维细胞对G418毒性敏感性检测

细胞培养到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×10⁵个细胞接种到13个直径35mm培养皿中以使细胞尽量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入终浓度从100μg/ml到1200μg/ml的G418，还有一孔中不加入G418作为对照。连续培养三周，每3～4天换液一次，同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡情况。

2.3.5电击转染

转染前将10～50μg 1.2.1纯化回收的DNA融入500μl 2×HeBS中，补充灭菌超纯水至1ml，冰浴预冷。

                                     ↓

在转染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培养细胞。将1×10⁶个细胞转接于75cm²培养瓶内，加入完全培养液，置37度、5％CO₂培养箱中培养。

                                     ↓

转染前，在倒置显微镜下观察培养的细胞，确定细胞处于对数生长后期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，1000rpm离心5min沉淀细胞。

                                      ↓

将细胞沉淀用冰浴预冷的l×HeBS离心洗涤1次，同时进行细胞计数。

                                      ↓

将一定数量的细胞重新悬浮于加有DNA的电极缓冲中，混合均匀后转入电击杯中，在电击前冰浴10min。

                                      ↓

当细胞准备好进行电击时，设置电场强度(E)和脉冲时间(t)，先试一下，确保产生了所需的脉冲。将电击杯插入电击槽中，按照选定的电场强度(E)和脉冲时间(t)，电击细胞。

                                      ↓

将经电击后的细胞冰浴10min后转入75cm²的培养瓶中，加入含20％FCS的DMEM培养液中于37度、5％CO₂培养箱中培养。

                                      ↓

1-2天后待细胞生长状态恢复，将细胞扩大10倍培养，加入适量的G418进行筛选。

                                      ↓

每3～4天换液一次，同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡情况。6-10天后，挑选阳性克隆细胞。

2.3.6阳性细胞的单克隆培养

在荧光显微镜下观察上述方法所得细胞克隆的发光情况，用记号笔圈住分散良好(远离其它克隆)且细胞数量多的荧光克隆；吸除培养液，用无钙镁PBS漂洗细胞二次，在高倍解剖镜下，将30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在标记好的细胞克隆上，待克隆的大多数细胞收缩脱壁后，不等细胞悬浮，快速吸取细胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的细胞；转移细胞到加有500μl培养液的四孔板中，吹打分散细胞团块；挑出的克隆继续培养，降低G418浓度至300μg/ml维持筛选；待克隆细胞数量扩大后或汇合后，将一部分细胞转移到35mm培养皿中继续扩大培养，另一部分用于转基因检测，其它扩大后的细胞尽早冷冻。

2.4转基因体细胞克隆

2.4.1卵母细胞的成熟培养

从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2～8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/ml bLH+1μg/ml estradiol)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO₂培养箱中成熟培养18～20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1％透明质酸酶的管内振荡2～3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体。

2.4.2卵母细胞的去核

将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用。

2.4.3移核与融合

将血清饥饿2～4d的供体细胞用0.25％trypsin消化2～4min，选择直径为10～12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步激活处理。

2.4.4重构胚的激活与培养

将重构胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后换到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO₂培养箱中培养2d后观察分裂率，7d后观察囊胚发育率

2.4.5胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体母牛的子宫角内。受体母牛选择的都是经产母牛，其中红系冀南黄牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入鲁西黄牛。在移植后的第60d进行直肠检测，以确定妊娠率.

2.5转基因克隆的PCR和Southern鉴定

2.5.1 PCR检测

为了确证phLa4-EGFP-NEO或phLa4-NEO转入牛基因组中，对于hLa4，我们设计了两对引物，

引物1序列为，上游：5’GAG TGA TGC TTC CAT TTC AG 3’，下游：5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’；反应条件为：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min；产物长度为790bp；

引物2序列为，上游：5’-TAG ATC TAG GGG TTA GGG GAA CT-3’下游：5’-TGC GGC CGC ATT GAGTTG GT ACA GAC AGT-3’反应条件：94℃ 3min，94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，30个循环，72℃7min；产物长度为1146b。

于EGFP基因，引物序列为：上游：5｀TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3｀下游：5｀CTC AGG TAG TGGTTG TCG GG 3｀。PCR条件：94℃ 5min；94℃ 40sec，62℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，产物长度为380bp。

对于NEO基因，引物序列为：上游：5｀AGG ATC TCC TGT CAT CTCACC TTG CTC CTG 3｀下游：5｀AAG AAC TCG TCA AGA AGG CGA TAG AAG GCG 3｀。PCR条件：94℃ 5min；94℃ 40 sec，60℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 7min，4℃ 1∞，产物长度为490bp。

由于人α-乳清蛋白基因长约10kb，因此我们分别在其5’端和3’端设计一对引物，从图10和图11可以看出，克隆牛兴娃、隆娃和会娃转有完整的人α-乳清蛋白基因。从图12和图13则可以看出，这三头克隆牛同时双标记选择载体。

2.5.1 Southern检测

取PCR检测为阳性的转基因克隆牛DNA约10μg用EcoRI消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P³²dCTP同位素标记的1.5kb的hLA基因片段。以phLa4-EGFP-NEO质粒为阳性对照，以非转基因克隆牛基因组为阴性对照，杂交可得到1.5kb片段，如图14所示进一步确定了兴娃和隆娃转有人乳清蛋白基因，可以估计兴娃和隆娃转有1个拷贝的人α-乳清蛋白基因，根据转基因小鼠结果，可以推测这两头转基因牛将能在乳腺中高效表达人α-乳清蛋白。附1：SEQ ID NO 1：完整的人α-乳清蛋白基因序列，序列图如下：包括6.9kb的5’侧翼区和159bp的3’侧翼区，全长9459bp；四个外显子及三个内含子，其中6937-7185为第一外显子，7743-7911为第二外显子，8390-8465为第三外显子，8965-9297为第四外显子

1     ATATGAACTT TAAAGTAGTT TTTTCCAATT CTGTGAAGAA AGTCATTGGT AGCTTGATGG

61    GGATGGCATT GAATCTATAA ATTACCTTGG GCAGTATGGC CATTTTCACG ATATTGATTC

121   TTCCTACCCA TGAGCATGGA ATGTTCTTCC ATTTGTTTGT ATCCTCTTTT ATTTCATTGA

181   GCAGTGGTTT GTAGTTCTCC TTGAAGAGGT CCTTCACGTC CCTTATAAGT TGGATTCCTA

241   GGTATTTTAT TCTTTTTGAA GCAATTGTGA ATGGGAGTTC ACTCATGATT TGGCTCTCTG

301   TTTGTCTGTT ATTGGTGTAT AAGAATGCTT GTGATTTTTG TACATTGATT TTGTATCCTG

361   AGACTTTGCT GAAGTTGCTT ATCAGCTTAA GGAGATTTTG GGCTGAGACG ATGGGGTTTT

421   CTAGATATAC ATTCATGTCG TCTGCAAAGA GGGACAATTT GACTTCCTCT TTTCCTAATT

481   GAATACCCTT TATTTCCTTC TCCTGCCTAA TTGCCCTGGC TAGAACTTCC AACACTATGT

541   TGAATAGGAG TGCTGAGAGA GGGCATCCCT GTCTTGTGCC AGTTTTCAAA GGGAATGCTT

601   CCAGTTTTTG CCCATTCAGT ATGATATTGG CTGTGGGTTT GTCATAGATA GCTCTTATTA

661   TTTTGAGATA CGTCTCATCA ATACCTAATT TATTGAGAGT TTTTAGCATG AAGGGTTGTT

721   GAATTTTCTC AAAGGCCTTT TCTGCATCTA TTGAAATAAT CATGTGGTTT TTGTCTTTGG

781   TTCTGTTTAT ATGCTGGATT ACATTTATTG ATTTGTGTAT ATTGAACCAG CCTTGCATCC

841   CAGGGATGAA GCCCACTTGA TCATGGTGGA TAAGCTTTTT GATGTGCTGC TGGATTCGGT

901   TTGCCAGTAT TTTACTGAGG ATTTTTGCAT CAATGTTCAT CAAGGATATT GGTCTAAAAT

961   TGTCTTTTTT GGTTGTGTCT CTGCCAGGCT TTGGTATCAG GATGATGCTG GCCTCATAAA

1021  ATGAGTTAGG GAGGATTCCC TCTTTTTCTA TTGATTGGAG TAGTTTCAGA AGGAATGGTA

1081  CCAGTTCCTC CTTGTACCTC TGGTAGAATT TGGCTGTGAA TCCATCTGGT CCTGGACTCT

1141  TTTTGGTTGG TAAGCTATTG ATTATTGCCA CAATTTCACA GACTGGCAAA TTGGATAAAG

1201  AGTCAAGACC CGTCAGTGTG CTGTATTCAG GAAACCCATC TCATGTGCAG AGACACACAT

1261  AGGCTCAAAA TAAAAGGATG GAGGAAGATC TACCAAGCAA ATGGAAAACA AAAAAAGGCA

1321  GGGGTTGCAA TCCTAGTCTC TGATAAAACA GACTTTAAAC CAACAAAGAT CAAAAGAGAC

1381  AAAGAAGGCC ATTACATAAT GGTAAAGGGA TCAATTCAAC AAGAGGAGCT AACTATCCTA

1441  AGTATATATG CACCCAATAC AGGAGCACCC AAGTTCATAA AGCAAGTCCT GAGTGACCTA

1501  CAAAGAGACT TAGACTCCCA CACAATAATA ATGGGAGACT TTAACACCCC ACTGTCAACA

1561  TTAGACAGAT CAACGAGACA GAAAGTTAAC AAGGATACCC AGGAATTGAA CTCAGCTCTG

1621  CACCAAGCAG ACCTAATAGA CATCTACAGA ACTCTCCACC CCAAATCAAC ACAATATACA

1681  TTTTTTTTCA GCACCACACC ACACCTATTC CAAAATTGAC CACATAGTTG GAAGTAAAGC

1741  TCTCCTCAGC AAATGTAAAA GATCAGAAAT TATAACAAAC TGTCTCTCAG ACCACGGTGC

1801  AATCAAACTA CAACTCAGGA TAAAGAAACT CACTCAAAAC CGCTCAACTA CATGGAAACT

1861  GAACAACCTG CTCCTGAATG ACTACTGGGT ACATAACGCA ATGAAGGCAG ACATAAAGAT

1921  GTTCTTTGAA ACCAACGAGA ACAAAGACGC AACATACCAG AATCTCTGGG ACACATTCAA

1981  AGCAGTGTGT AGAGGGAAAT TTATAGCACT AAATGCCCAC AAGAGAAAGC AGGAAAGATC

2041  CAAAATTGAC ACCCTAACAT CACAATTAAA AGAACTAGAA AAGCAAGAGC AAACACATTC

2101  AAAAGCTAGC AGAAAGCAAG AAATAACTAA AATCAGAGCA GAACTGAAGG AAATAGAGAC

2161  ATAAAAAACC CTTCAAAAAT TAATGAATCC AGGAGCTGGT TTTTTTGAAA GGATCAACAA

2221  AATTGATAGA CCGCTAGCAA GGCTAATAAA GAAGAAAAGA GAGAAGAATC AAATAGATGC

2281  AATAAAAAAT GATAAAGGGG ATATCACCAC CGATCCCATA GAGATGCAAA CTACCATCAG

2341  AGAATACTAT AAACATCTCT ACGCAAATAA ACTAGAAAAT CTAGAAGAAA TGGATAAATT

2401  CCTTGACATA TACACCCTCC TAAGACTAAA CCAGGAAGAA GTTGACTCTC TGAATAGACC

2461  AATAACAGGC TCTTTTTTGT TTTTTAAATT TTGGTGGGTA CATCATAGCT GTGTATATTT

2521  ATGGGGTACA TAAAATGTTT TGATACAGGC ATGCAATGTG AAATAAATAC TTTATGGGGA

2581  ATGCGGTGGT AGATTGTTAA TATGAGTTGC CAGGATGATG TTTGGCAAGG AAGAAATGAG

2641  GAGGAAGAAA GGGAAGCCAT TCCTAAAAGG AAAGGAAAAA CTACCATGTT CACAAAAAAT

2701  AGGATGTAAG ATTCTATCAA AGGTGTTGAT GTAAAATTAT GTAAATATGT TTATTTAAAA

2761  ATAAACATTT TATAAATTAA AAATGAAAAA TCAATTAAAA TTTGCATAGA AATTTTTTTA

2821  GCTTCTTGGT AATTACATGT GTATCGGTTT GTTTTAGCTA ATATTCAGTT AAAAAGGTAA

2881  AATTTATTTT AGTATCTTTT AAAATCATTT TTGTGTTATA ATTTATATTT CCATGCTTGC

2941  ATTTTTTGGT TGATACTATC CCCAATTCAC ACAAATGAAT CAATGGTTCA TTTAAGTATA

3001  AAAGCAGTGA TATAAATAGT AATGCAAATA TAGCAATCCA AAATAAGCCC ATATAAATTG

3061  CAAGCAGGCC TTTGGTGTGG GATATAGAAT GTGAATCTAT AATGCTGAGT AACTTTGTAA

3121  GGACTTTTGG ACAAGCAGCT GAAAAAGAAA AATGCCAATA AAAAATCACT CCCTTTCTAA

3181  ATCTTAATTA CTTTAATTAA CTCTTTAATT TGGTTAAACA TTTTCATGAA ATTTGGGTTT

3241  CAAGATCTAG CATCATTGTC TACCTAGTGA TAATTTTCCT GAATTATGAG AGAAAGTAGA

3301  ACAAGATGAG GATATAAGTG TATTTTAAAA TAGAGACAGG GTCTTGCTCT ATTGCCCAGG

3361  CTAGAGTGAG TGGCACAATC AAAGCCCACT GCATTCTTGA ACTCCTGGGC TCAAGCAATC

3421  CTCGTACCTC AGTAGCTAGG ACTATAGGCA CGTGCCACTA TGCCTGGCTA ATTTTTATTT

3481  TTTTTTGTAG TGACAGAGTC TTGCTATGTT GCCCAGGCTG GTCTCCAACT CCTGGCCTCA

3541  AGTGATCCTC CTGCCTCAGC CTCCCAAAAT GTTGGGAGTA TAGGCATGAG CCACTGCAGG

3601  CACAAGGTAA GGATATTAAC TGCAAGATGT AATGGCCATT ATGACTGTGG CTCTCAGGGT

3661  GTTCCCTCTA AATGGCAGGC CTAGGCTCTG TCTAGAAACT CCAGCTCACC TACAGACTAC

3721  AGTTTCAGAT GGAAAACGTG CCTTGAAACA CATGCTTTCA ATTTCTTTAT TTTCAGAAAT

3781  AAAGATATTT TAATTTTATT TTTATTATTA TTATTATTTT TTGAGATGGA GTCTTGCTCT

3841  GTTTCCCAGG CTGGAGTGCA GTGGCACAAT CTTGGCTCAC TGCAGCCTTC ACCTCCTGGG

3901  TTCAAGCGAT CCTCCTGCCT CAGCTGCCCG AGTAGCTGGG ATTATAGACT CCTGCCAGCA

3961  TGCTCAGCTA ATTTTTGTAT TTTTAGTAGA GACGGAATTT TGCCATGTTG GTCAGGCTGG

4021  TCTCGAACTC CTGACCTCAA ATAATCTGCC TACCTTGGCT TCTCAAAGTG CTGGGATTAC

4081  AGGCATGACC CACCATGCCC GGCCTGAACT TTTTATTTTA TAAATAAAGA AATTTACTTT

4141  TAGAAATAAA ATTTTTATTT TGTTCATCTT CAAAAAGGTG ATTTCTGGTT TTAGAAACCT

4201  GGATATTTCC CCACAGCATC TGAGAGAATG AACATAATTT TCTAGTCTAT TTCTAACAAA

4261  ATCTAGGTAA GTGTATTGTA AATGCCTCTT CACCATCTTG ATTCAGCTCT CGACCTCCAT

4321  GCAGAGCACC CTGAGTAAAC CTCTCTGGAA AGGGAGATTT TGGAGGAGGT TTCTTCCTGG

4381  ACAGGAATTG TTGAGCAGGA GCTTTCTTCC ACGAGCTGTG CTTAATGTCT TTCCACATAC

4441  TTCCTCTTTC AGTGCTGCGA TCATTGTGTA TTGTTCTCCT TTGGACAATC TCCAAGAGGC

4501  TGCATCTTTC TCTGGATGTT TGCAGTTGTT CCCATTAGAC ACTTTCTATC TTCTTTTTCA

4561  GATGACCCCC ACGTATCCTA TTTTAAGAAC ATTTATAGGG AAATAATGGT TCCTTTTGCC

4621  GGAGACATGT TTATTTTCTT TTCTGCACTT AGTTGTGATT CCTGACCTGT ATGCTTATTT

4681  TTATTGCTTA TAGGGAAGGG CCAAGGTATA ATCAAATGAT AGGCAAGCAG GCAGCTGCCT

4741  TAGGTCTTGA CTTGGCTGAA AGTGTAGAAA ACCCCTGTGA TTCTTGAGAC CCTGGCCCAC

4801  CCTTTTACTC TATCACAGGT ACTTAGTCAA TAGCCTAGGG CAGGAGGCAT TTTACACAAG

4861  ACTCCACTAT TGGAAGGACT AGTCCTCAGG ACTAGCTTTT CTTATCTTTC CCTCTCACAC

4921  ATGGTTCAAG GTCACTCTCA GCCATATTCT CAACAAAGCT TAGAGTGATA GAATTCCCAT

4981 TCCTGTCGTG TACCCTTGCA GTGCCTCTGG GTGGAATGCG GAGAAATGGA GTGGCTCCAC

5041 TTCTGTTGTG TTTCTGAACA TGTATCTCTT GCTATCAGAA CTTTCTGCTC ATCCCTTCTG

5101 GCACACCAAG ATCCTCCACA TTCCCTTCAC TCATGCCACT TCATATACTG GTTATCCATG

5161 GTACAGAAGA CAGGATTTAA CTGAGAGGAC TTTTCCCTGA CTCTGAATAC ATGTAGGAGA

5221 TAACGATATG GAAGACCTTC AGTATGTAAG TCTTAAATAG ATTGGTTGGG ATAAATGTTC

5281 CCTGAAACAT AAGAAACAGC GCAGCGGCTC CTGTCTGTAA TCCTAGCACT TTGGGAGGCC

5341 GAGGCCCAGG CAGGCAAATT GCCTGAGCTC AGAAGTTTGA GACCAGCCTG GCCAACATGC

5401 AGAAACTCCG TCTCTACTAA AAATACATAA ATTAACCGGG CATGGTAACA CGTGCCTGTA

5461 GTCCCAGCTA CTCGGGAGGC TGAGGCAGGA GAATCACTTG AGCCTGGGAG GCAGAGGTTG

5521 CAGTGAGCCA AGATCGCGCC ACTGCATTCC AGCCTGGGCA ACAGAGTGAG ACTTGGTCAA

5581 AAAAAAAAAA AAAAAAGGAA GAAGAAGAAG AAATCAGGTT TAGAGATGAG GACAAAGAAG

5641 ACGAATGGTG GCATGAAGGA GCTAAGAGCT ACTTGTCACC ATGACATGAA GCTTCATGCC

5701 AGCAAATTAA AGGAGCTATT CAGAACTAGT ATCCTCAACT CTACTTGCTC AGGGGCACTG

5761 ACCTTATAGA GATTCCAGAC ATAAGCTTGT TCAGCCTTAA AGTCCAATCT TTCCACTGGC

5821 TTGGGTCCTT CCCACTTTCT GTGGCCAACT CTGAGGTTGT CTACAAGTTA TTGGTCTTAG

5881 ATTTATGTAA TGTCTCAATG CCAGTGTAGT ATTTGGTTAT TTACGGTAGG AGTGGTTAGG

5941 GGTGGGGAAT CTGATAATAG CTCGTAGGAT AGCTAGATTC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT

6001 TAAAGATAGG GTCTCACTTT GTCTCCCAGG ATGGATGGAG TGCAGTGGAG TGAACATGGC

6061 TCACTGCAGC CTCGACCTCC TGTGCTCAAG TGTTCCTCCT GCCTCAGCCC CTCAAGTAGC

6121 TGGGACTACA GGCACATGTC ACCATGCCCA GCTAATTTTT TTTGTAGAGA TGGGATTTTA

6181 CCATGTTGCC CAGGCTGGTC TCGAGCTCCT GGGCTCAAGT GATCCACCAG ACTCGGCCTC

6241 CCAAAATGCC GGGATTACAG GTGTGAGCCA CTGTGCCTGG CCTAGATGCT TTCATACAGG

6301 CTTTTCAATT ATGCATTTTC CTTAAGTAGG AAGTCTTAAG ATCCAAGTTA TATCGGATTG

6361 TTGTAGTCTA CGTTCCCATA TTCTATTCCT ATTTCTGAGC CTTCAGTCAT GAGCTACCAT

6421 ATTAAAGAAC TAATTCTGGG CCTTGTTACA TGGCTGGATT GGTTGGACAA GTGCCAGCTC

6481 TGATCCTGGG ACTGTGGCAT GTGATGACAT ACACCCCCTC TCCACATTCT GCATGTCTCT

6541 AGGGGGGAAG GGGGAAGCTC GGTATAGAAC TTTATTGTAT TTTCTGATTG CCTCACTTCT

6601 TATATTGCCC CCATGCCCTT CTTTGTTCCT CAAGTAACCA GAGACAGTGC TTCCCAGAAC

6661 CAACCCTACA AGAAACAAAG GGCTAAACAA AGCCAAATGG GAAGCAGGAT CATGGTTTGA

6721 ACTCTTTCTG GCCAGAGAAC AATACCTGCT ATGGACTAGA TACTGGGAGA GGGAAAGGAA

6781 AAGTAGGGTG AATTATGGAA GGAAGCTGGC AGGCTCAGCG TTTCTGTCTT GGCATGACCA

6841 GTCTCTCTTC ATTCTCTTCC TAGATGTAGG GCTTGGTACC AGAGCCCCTG AGGCTTTCTG

6901 CATGAATATA AATAAATGAA ACTGAGTGAT GCTTCCATTT CAGGTTCTTG GGGGTAGCCA

6961 AAATGAGGTT CTTTGTCCCT CTGTTCCTGG TGGGCATCCT GTTCCCTGCC ATCCTGGCCA

7021 AGCAATTCAC AAAATGTGAG CTGTCCCAGC TGCTGAAAGA CATAGATGGT TATGGAGGCA

7081 TCGCTTTGCC TGAATGTGAG TTCCCTGCCT CTGTGTTTCA TCCATTCCTC ATACGCTTCT

7141 CTCCTCCATC CCCTCTTTCT TCCACTTCGC CCCTCCACTT TTACTTAATT ATCTAATCAT

7201 CCTCTTTTCT GCTCATTTGC ATACTCTTTT ATTTCATGTA TGTATATATG TATGTATTTA

7261 TTTATTTTTG AGGTGGAGTT TCGCTCTTGT TGCCCAGACT GGAGTGCAAT GGTGTAATCT

7321 CGGCTCACTG CAACCTCCGC CTCCTCGGTT CAAGTGATTC TCCTGCCTCA GCCTCCCAAG

7381 TAGCTGGAAT TACAGGCACC CACCACCATG CCTGGCTAAT TTTGTATTTT TTGTAGAGAC

7441 AGGGTTTCAC CATGTTGGCC AGGCTGGTCT CAAACTTCTG ACCTCAGGTG ATCCGCCCTC

7501 CTCAGCCTCC CAAAGTGTTG GGATTACAAG CGTGAGCCAT CATGCCTGGC CCCATTTATT

7561 TTCCTATCCT TTCTTTCTCT TATTGTCTGA TTTTTTTTTG GAATTCTCCA TCTCATCAAG

7621 AAACTCTGAG CTTTGCCATC TTTGGAGATT GGCTGGAAAG CATTTTTGTC TGAGAATTAC

7681 AGTTCCTCCT TTATGCAGAT CCTGTACATC TCTGTGGTAT CTCTTTCTCA TCTTTCCCTC

7741 AGTGATCTGT ACCATGTTTC ACACCAGTGG TTATGACACA CAAGCCATAG TTGAAAACAA

7801 TGAAAGCACG GAATATGGAC TCTTCCAGAT CAGTAATAAG CTTTGGTGCA AGAGCAGCCA

7861 GGTCCCTCAG TCAAGGAACA TCTGTGACAT CTCCTGTGAC AGTGAGTAGC CCCTATAACC

7921 CTCTTTCTCT GTTTTTCTGA GGCCTGCCCT TGGGATAATC TCCTTTTTAG TGCCAAGCAG

7981 ACCTCAGGCT TCATTGCCTT GGCTGGGCTC TATAAAAATT GTGGGACTTG AATTGGCAGT

8041 ACTGAGTAAG AAGCTGTTTG GATTTTTCAT GGTCATCAAA TCCCCAGACA GTTCCTTGAG

8101 GTTCAGTGGT AGACAATCGG AGCTGTCTGA GAGTCTTGGA ATCTGATTGT CTGCATTTTC

8161 AGGGTAAGTC AGTTGATGAA GCTGATGATT CCTCCAGAGA TATCCCAGGG AAATGAAGGA

8221 AGTCCCTACC CAGGGTTAGA CATTACCACA TTGGTCCTTT CATATAGAAA GACAACAGGC

8281 ACAAGCCTTG AGTTTAGAGA ACCCACTGGA TCAGGGGTTA GGGGAACTCA GTGCCTTTCT

8341 GGGTAATACT TGTCAGCTGT CTCAATCCTT TCCCTGTAAC TCCTGCCAGA GTTCCTGGAT

8401 GATGACATTA CTGATGACAT AATGTGTGCC AAGAAGATCC TGGATATTAA AGGAATTGAC

8461 TACTGGTGAA TCCTTATTCT ATTTTCTATT TCCCCATCCT CCTTCTCCTT ACCCCATTAG

8521 CCCAGCACCC CTTTCCTCTT ACCCTATCTC TTGGTCATTT AATCTAGAAT ACAGTGTCTG

8581 AAACAAAGCT TACCTAGAGA CTCAGGTTTC TGTTATTAAG CCTCTCTCGC TCCGCTCCTT

8641 GGTAGCAATT TTCCTAATAA GGGGTTGCCT AATGGAGGGC TCAGACCCAG GCCTCCTTTC

8701 ACTTAGACTT GGACATCTAA TTCCACTTGT TTAGTTCTAT GCCCTAAAGC AAGCTGTTGG

8761 TAACATTGCA TCTCTTTTTT AACCCTACAA TTTTCTTGGA TATTTTTTAT GGACTGTATT

8821 CCACTTGATG GCTTGTGTCG CTTGACATCA GGCCAGGAAT GTCTTTCTGT AATTCTCGTC

8881 CACGCTCTTC CACTTCAGCC CTCCTGGGAA TGAATGTAAA GATTCAGTCA GCTAACTCAC

8941 CTTGTCCCCC TTCTCCATTA TCAGGTTGGC CCATAAAGCC CTCTGCACTG AGAAGCTGGA

9001 ACAGTGGCTT TGTGAGAAGT TGTGAGTGTC TGCTGTCCTT GGCACCCCTG CCCACTCCAC

9061 ACTCCTGGAA TACCTCTTCC CTAATGCCAC CTCAGTTTGT TTCTTTCTGT TCCCCCAAAG

9121 CTTATCTGTC TCTGAGCCTT GGGCCCTGTA GTGACATCAC CGAATTCTTG AAGACTATTT

9181 TCCAGGGATG CCTGAGTGGT GCACTGAGCT CTAGACCCTT ACTCAGTGCC TTCGATGGCA

9241 CTTTCACTAC AGCACAGATT TCACCTCTGT CTTGAATAAA GGTCCCACTT TGAAGTCACT

9301 GGCTGTAATT TTTTTCCCCC TGGAGGGAAG GGGAAGAAAT AGGATGAGTA GGTGGACACT

9361 GAAGCCATAG GTCATAGCCA CCTTCCATCT CTACTGAAGA AGAAGTAGGC TGAATTTACA

9421 ATAGAAAGGT GAAGGTTACT GTCTGTACCA ACTCAATGC

附2：SEQ ID NO 2：人α-乳清蛋白一级结构即氨基酸序列，共142个氨基酸，其中前19个为信号肽序列，HLA氨基酸序列图如下：

1    MRFFVPLFLV GILFPAILAK QFTKCELSQL LKDIDGYGGI ALPELICTMF

51   HTSGYDTQAI VENNESTEYG LFQISNKLWC KSSQVPQSRN ICDISCDKFL

101  DDDITDDIMC AKKILDIKGI DYWLAHKALC TEKLEQWLCE KL

Claims (8)

1.生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其操作步骤如下：(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因结构构建乳腺特异表达载体，(2)构建双标记选择载体和单标记选择载体，通过电击方法进行细胞转染，获得转基因细胞，(3)利用转基因细胞为核供体进行体细胞克隆，获得含有人α-乳清蛋白的转基因克隆大型家畜。

2.根据权利要求1所述的生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述完整的人α-乳清蛋白基因是含有6.9kb的5’侧翼区和159bp的3’侧翼区，1-4外显子和1-3内含子，全长9459bp。

3.根据权利要求1所述的生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述乳腺特异表达载体为phLa4，重组人α-乳清蛋白的转基因小鼠模型中表达的人α-乳清蛋白与天然人α-乳清蛋白大小一致，具有与天然人乳中乳清蛋白相同的免疫活性。

4.根据权利要求3所述的生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述转基因小鼠的人α-乳清蛋白基因表达量达0.48-3.21g/l。

5.根据权利要求1所述的生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述双标记选择载体为phLa4-EGFP-NEO，所述单标记选择载体为phLa4-NEO。

6.根据权利要求1所述的生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述转基因细胞是通过G418进行筛选获得的阳性细胞。

7.根据权利要求1所述的任一生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。

8.根据权利要求6所述的生产重组人α-乳清蛋白的动物乳腺生物反应器——人α-乳清蛋白转基因克隆大型家畜的方法，其中所述大型家畜为牛。

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