CN1850974A - 转人α－乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种转人α－乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜生产方法，其操作步骤如下：(1)利用完整的人α一乳清蛋白基因结构构建乳腺特异表达载体，(2)构建人α一乳清蛋白乳腺特异表达载体与双标记选择载体的串联结构，将此串联结构DNA导入家畜体细胞核内，获得转基因细胞，(3)利用转基因细胞为核供体进行体细胞克隆，获得转有人α－乳清蛋白的转基因克隆大型家畜。这些转基因奶牛乳腺特异表达的重组人α－乳清蛋白将可以开发成保健品和药品，含重组人α一乳清蛋白的牛奶也可直接开发成高附加值的保健牛奶及奶制品。

Description

转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及转基因—克隆技术领域。

背景技术

转基因动物研究是人类按着自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，而改变其遗传组成的目的是多种多样的。比如遗传学家希望通过改变动物的遗传组成来观察其表型变化，生理学家希望通过特定基因的表达来研究该基因对机体生理状况的影响。与动物生产有关的转基因研究则希望通过转基因技术来赋予动物新的表型性状。该项研究在实验技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。

转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射，逆转录病毒感染发育早期的动物胚胎，精子载体法，ES细胞技术，PGCs技术，体细胞核移植技术，逆转录病毒载体感染MII期的卵母细胞，精子头与DNA合并注射卵母细胞法。这些方法上的改进与提高大大地促进了转基因动物研究由实验室向生产实践转化的进程。

其中最传统和最常用的方法是原核期胚胎的显微注射，该方法由美国人Gordon发明，是目前应用比较广泛、效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。即在显微操作仪下通过一毛细玻璃管将外源DNA注射进动物受精卵细胞的原核内，再将该受精卵细胞移植进受体细胞子宫内，再将该受精卵分裂时，外源DNA可能整合入宿主染色体组，待该受精卵发育成熟即可获得转基因动物。但是显微注射法获得的转基因家畜的效率极低，特别是牛，羊和猪等，往往低于1％，这将大大增加制作转基因家畜的成本。

随着体细胞克隆技术的发展，基因操作技术与克隆技术相结合是将成为转基因动物，特别是大家畜生产的主要方式。目前，取得的主要进展是转基因技术和靶位操作技术在克隆动物上的应用。首先，利用克隆进行转基因是指在核移植前，先把目的基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞，再通过标记基因的表现来筛选转基因的阳性细胞及其克隆，然后再移植。1997年，英国PPL公司的科学家Schnieke与罗斯林研究所的Wilmut等联手通过体细胞核移植技术率先在世界上制作了转基因绵羊。利用胎儿成纤维细胞系，经过转染之后，再克隆。被转染的外源基因含有人的凝血因子IX基因的完整编码区和β-BLG基因启动子，凝血因子IX能被高效表达，每毫升奶中包含125μg的凝血因子IX蛋白。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上讲，转基因成功率为100％。原核注射的方法会使大量的非转基因胚胎被怀孕，这是一种资源浪费，而利用克隆进行转基因技术不会造成代理母亲去怀孕非转基因动物。此外，利用克隆进行转基因时，转基因动物的性别会被提前决定。这样的话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因动物全是雌性动物。

由于动物转基因技术能按照人们的意愿改变动物的生产性状，得到人们所需要的产品，特别是一些蛋白药品及保健品，科学家们已经开始将动物转基因技术应用到实践当中，目前动物转基因技术主要有以下一些应用：(1)、促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质，(2)、动物抗病育种，(3)建立诊断和治疗人类疾病的动物模型，(4)生产药用蛋白。

动物乳腺生物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的一百倍，是一种非常有潜力的高新技术。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶样中的蛋白含量高达23克/升，大约是动物细胞表达蛋白的400倍以上。该技术一经出现就得到迅猛的发展。目前，牛乳白蛋白基因人组织血纤维蛋白溶酶原因子，人生长激素基因，人体抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干扰素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表达。许许多多的著名科学家都认为这将是畜牧业前所未有的革命，可能会给社会带来巨大的经济效益。在过去的十年里，已经有十几家公司开展这方面的研究工作。尤其，随着动物克隆技术成熟，转基因技术得到了更充分的发展。这将使乳腺生物反应器的大规模生产更加现实，因此一场围绕该技术的国际性竞争将是必然。

利用乳腺生物反应器的方法改造奶牛、奶山羊，使生产出的奶成分近似于人奶，既有营养的功能，又有药用的功能，这种奶可以使孩子长得高大，促进大脑和神经发育，增强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阔的前途。改善奶的营养成份或生理生化特征也是人们希望通过改变动物的遗传组成来实现的目标之一，即制造所谓的营养药品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工产品可提供人类30％的营养蛋白，含有丰富的必需氨基酸、钙和无机磷酸盐，以及消化率很高的酪蛋白，是人类高质量的营养来源；但乳用家畜奶在品质上还不尽如人意。因此，人们一直在研究如何改善奶品质。自Gordon创立动物转基因技术以来，世界各国都争先开展转基因育种及其相关技术研究。研究表明外源基因不仅能在转基因动物中得到整合与表达，而且能获得组织特异性(乳腺组织、输卵管)和发育特异性表达，并且现在能够利用分子技术找到调节乳成分的所有基因。

α-乳清蛋白是分子量小、酸性的，高亲和性的Ca²⁺结合蛋白，它几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中。在乳腺分泌细胞中，α-乳清蛋白作为调节亚基通过与半乳糖苷转移酶相互作用催化乳糖的合成。最近还发现α-乳清蛋白的不同的折叠突变体具有杀菌和诱导肿瘤细胞死亡的功能，还能与油酸形成复合物杀死皮肤的乳突淋瘤，具有广阔的应用前景。

α-乳清蛋白的功能：

(1)α-乳清蛋白的营养价值。由于α-乳清蛋白是人乳中重要的组成成分，约占总蛋白含量的28％，占乳清蛋白含量的49％，可以想象，α-乳清蛋白除了生理功能以外，还是乳汁中重要的营养成分。如果比较人奶和牛奶蛋白质的氨基酸组成，就会发现，牛奶中色氨酸和半胱氨酸的含量明显低于人奶中的含量，而造成这一结果的主要原因是牛奶中α-乳清蛋白的含量比较低。人乳中α-乳清蛋白色氨酸和半胱氨酸的含量(wt/wt)分别为6％和5％。色氨酸为必须氨基酸，必须由母乳供给，而半胱氨酸虽然不是必须氨基酸，但由于初生婴儿代谢系统不完善，如果食用牛奶的话，也可能造成半胱氨酸的缺乏。色氨酸和半胱氨酸也可能参与婴幼儿重要的生理活动。例如，色氨酸可能与睡眠行为有关，一直食用牛奶的婴幼儿，他们的睡眠可能会受到影响；而半胱氨酸是谷胱苷肽的组成部分，它可作为抗氧化剂，保护细胞免受氧化作用的伤害。因此，为使婴幼儿的奶制品更加营养合理，人们已开始尝试牛奶人乳化，我们实验室也正在开展这方面的工作。

(2)α-乳清蛋白调节乳糖合成的功能。人们很早就知道，α-乳清蛋白是乳糖合成酶的一个组成部分，葡萄糖存在条件下，与半乳糖苷转移酶结合在一起，调节该酶的专一性。由于α-乳清蛋白易于从半乳糖苷转移酶上解聚，可把它看成乳糖合成酶的一个调节亚基，因而在乳糖合成中起的是调节作用。这个酶的另一个亚基是半乳糖苷转移酶(GT)，它在多种分泌细胞中能够催化半乳糖残基从UDP-半乳糖到糖蛋白上。而在哺乳动物的乳腺中，专一性的半乳糖苷转移酶与α-乳清蛋白相互作用，通过这一过程可增加GT对葡萄糖的亲和性和专一性，使其催化底物对象变为葡萄糖，整个催化过程如下：

这个反应在高尔基体中发生，α-乳清蛋白与高尔基体内膜上的半乳糖苷转移酶结合形成乳糖合成酶，这种结合使乳糖合成酶对于葡萄糖的亲和力大大增加。由于α-乳清蛋白是连续分泌的，因此，它对于乳糖合成的维持是十分必要的。从已知的各种动物乳中乳糖和α-乳清蛋白的含量看，它们二者之间以及它们与乳的分泌量之间呈正相关。乳糖的合成开始总与α-乳清蛋白的出现相伴，这在许多实验中已得到证明。另外，体内实验和体外实验表明，α-乳清蛋白的合成受催乳素或胎盘催乳素以及糖皮质激素的影响，但怀孕期可被孕酮抑制。

(3)α-乳清蛋白的杀菌和诱导细胞凋亡的功能。Pelligrini等人发现用胰蛋白酶和糜蛋白酶水解α-乳清蛋白，产生了三种具有杀菌特性的多肽，这些多肽对绝大多数革兰氏阳性菌起作用，这说明α-乳清蛋白被内肽酶降解后具有抗菌作用。Hakansson et al发现了一种α-乳清蛋白构象的突变体，这个突变体对抗生素敏感和有抗性的肺炎链球菌都具有杀伤能力。具有杀菌活性的蛋白可通过离子交换和凝胶色谱从酪蛋白中分离出来。更为有趣的发现是天然状态的α-乳清蛋白，在有C18:1脂肪酸存在下，可以转变成具有杀菌活性的形式，正如前面所提到的，α-乳清蛋白拥有几个脂肪酸结合位点。

近来Hakansson和Svensson等描述了α-乳清蛋白可能的更为吸引人的功能，他们发现一些多聚体，虽然不能完全代表α-乳清蛋白衍生物的特性，但它们是有效的Ca²⁺增加和编程死亡的诱导剂，具有广泛的细胞毒性，能够杀死所有实验的胚胎和淋巴细胞。多聚体的α-乳清蛋白形式可以从奶的酪蛋白部分分离出来。进一步研究发现，α-乳清蛋白诱导编程死亡的部分包含着该蛋白的寡聚体，而寡聚体又要经历类似熔球构象的改变，寡聚化似乎保持着α-乳清蛋白具有生物活性的熔球状态。前面已经提过，在Zn²⁺存在下，可以得到α-乳清蛋白的积聚体，但却不知道它们有没有细胞毒性。多聚化的α-乳清蛋白结合到细胞表面，进入细胞质并在细胞核中积累；同时，我们也发现脱离子的α-乳清蛋白和Zn²⁺结合与磷脂膜的相互作用比Ca²⁺结合蛋白与磷脂膜的相互作用更有效，这两个现象是完全一致的。Kohler等人也指出聚合的α-乳清蛋白可激活Caspases，并诱导编程死亡，而且α-乳清蛋白直接作用线粒体，引起细胞色素C的释放，这是细胞编程死亡起始非常重要的一步。

(4)α-乳清蛋白具有治疗乳突淋瘤的功能：对于人α-乳清蛋白，最近最激动人心的研究是发现α-乳清蛋白油酸复合物能抑制并清除乳突淋瘤。乳突淋瘤是一种由角化细胞感染乳突淋瘤病毒所引起的，常见的肿瘤，通常发生在皮肤和粘膜上皮。皮肤乳突淋瘤一般是良性的，而粘膜上皮乳突淋瘤会引起其它一些恶性肿瘤。Gustafsson等人(2005)利用阳离子交换层析获得人α-乳清蛋白与C18:1脂肪酸复合物，对40个乳突淋瘤病人进行随机的、以安慰剂为对照，双盲的局部治疗，一期治疗结果显示，75％的病人乳突淋瘤病灶明显缩小，而对照组只有15％；二期治疗两年后，83％的病人乳突淋瘤病灶清除，而且没有任何副作用，表明α-乳清蛋白油酸复合物对于乳突淋瘤具有良好疗效。α-乳清蛋白油酸复合物还具有广普的杀死肿瘤细胞的作用，并且对正常细胞没有损害。

目前人α-乳清蛋白主要从人奶中纯化，由于来源有限，限制了人α-乳清蛋白作为药用蛋白和保健品的使用，因此利用转人α-乳清蛋白基因的克隆牛乳腺生产重组人α-乳清蛋白将具有重要意义。

人、牛、山羊和绵羊的α-乳清蛋白基因分别被定位在第12、5、5和3号染色体上，世界上也已知得到多种编码α-乳清蛋白的基因。除小袋鼠的α-乳清蛋白基因外，其它物种该基因的转录单元长度都在2Kb左右，一般包括4个外显子。人和鼠α-乳清蛋白基因的序列和基因组最先研究清楚。人α-乳清蛋白基因全长2433bp，外显子长717bp，内含子长1636bp。人α-乳清蛋白基因序列含有Alu重复序列，该序列反向插入内含子I中，Alu序列在人类基因组中约有500,000拷贝，占人类总基因组的5％～6％，成员众多，大约有300,000种，故称Alu序列家族。人α-乳清蛋白基因中的Alu序列与Alu共同序列其同源性达88％，含有各种Alu和Alu样序列的保守内部组件。小袋鼠的该基因转录单元中除具有其它的四种相应的外显子序列，可能还有第五个外显子结构，在四个其它外显子5′端上游的一段序列没有任何调控序列存在，人们推测它可能包含了第五个外显子，但这还需要进一步证实。

目前对于人α-乳清蛋白，转基因研究报道并不多，主要侧重于α-乳清蛋白基因的调控和表达研究。日本的Fujiwara等1997年利用210kb含人α-乳清蛋白基因完整表达调控单元进行转基因大鼠研究，在转基因大鼠奶中获得了2.0-4.3mg/ml人α-乳清蛋白的高效表达，并且不受位置效应的影响。Takase和Hagiwara利用人α-乳清蛋白基因cDNA进行了转基因烟草研究，在5g叶子中表达了具有天然活性的5mg人α-乳清蛋白。1999年Fujiwara等做了大量的分析研究工作后，认为包含50kb的5’侧翼区和50kb的3’侧翼区的人α-乳清蛋白基因可以获得不受位置效应影响的稳定表达，但是只含有20kb的5’和20kb的3’侧翼区的转基因表达会受到位置效应的影响。2003年刘思国等人利用人α-乳清蛋白基因7.3kb的5’端调控区，2.0kb的编码区以及227bp的牛生长激素3’端调控区构建载体，在五只转基因小鼠中，仅有一只小鼠能检测到人α-乳清蛋白的表达(0.3mg/ml)，表明这个表达载体并不是很理想。

人α-乳清蛋白除了具有重要的营养价值之外，还具有杀菌作用，以及治疗肿瘤的功能。由于目前人α-乳清蛋白主要从人奶中提纯，来源有限，因此利用转基因动物特别是大家畜生产重组人α-乳清蛋白，将具有重要的应用前景。克隆技术的日趋成熟，不仅使动物转基因技术得到了更充分的发展和补充，也使利用乳腺生物反应器大规模生产各种重要的功能蛋白更加现实。采用基因组DNA作为目的基因制作转基因动物要比cDNA序列的获得更高效率的表达[5]，但过大片段又不便于基因操作，因此获得高效表达的小结构转基因载体有着重要的意义。到目前为止，还不曾见到有α-乳清蛋白全基因组DNA的转基因报道。

发明内容

本发明针对上述领域中的空白，通过转基因、细胞转染技术和体细胞克隆技术相结合，提供一种转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜生产方法，为我们实现牛奶人乳化及开发出重组人α-乳清蛋白保健品及药品奠定基础。

本发明提供了一种转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜生产方法，其操作步骤如下：(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因结构构建乳腺特异表达载体，(2)构建人α-乳清蛋白乳腺特异表达载体与双标记选择载体的串联结构，将此串联结构DNA导入家畜体细胞核内，获得转基因细胞，(3)利用转基因细胞为核供体进行体细胞克隆，获得转有人α-乳清蛋白的转基因克隆大型家畜。

所述乳腺特异表达载体含有全长9459bp的人α-乳清蛋白基因序列，由6.9kb的人α-乳清蛋白基因5’侧翼区、2.4kb的人α-乳清蛋白基因编码区和159bp的人α-乳清蛋白基因3’侧翼区组成。

所述的双标记选择载体以增强型绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因为标记选择基因。

所述串联结构DNA为phLa4-EGFP-NEO。

所述导入方法为电穿孔转染法。

所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。

所述大型家畜为牛。

本发明将在小鼠乳腺中得到高效表达的phLa4表达载体连接上双标记选择载体pEGFP-NEO构建成phLa4-EGFP-NEO。利用电击转染及G418筛选取出转基因细胞，再进行单克隆培养。利用体细胞克隆技术获得转基因克隆牛，经PCR和Southern检测，共获得三头转有phLa4-EGFP-NEO的转基因克隆牛。这些转基因牛乳腺中均能表达具有天然活性的重组人α-乳清蛋白，表达水平为1.10-1.55克/升。这些转基因奶牛乳腺特异表达的重组人α-乳清蛋白将可以开发成保健品和药品，含重组人α-乳清蛋白的牛奶也可直接开发成高附加值的保健牛奶及奶制品。

本发明探索和完善了细胞转染技术和体细胞克隆技术相结合生产携带外源功能基因(目的基因自身调控元件)的转基因动物的途径，并极大提高了转基因动物，特别是转基因大家畜的制作效率，本发明所使用的技术路线适用于转基因牛、山羊、绵羊、猪和兔的基础群生产和扩繁。

附图说明

图l：人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4结构模式图

图2：双标记选择载体pEGFP-NEO的结构图

EGFP为增强绿色荧光蛋白基因，NEO为新霉素抗性基因，IRES为核糖体结合位点，SalI，NotI，AscI和BamHI为酶切位点，CMV-IE Enhancer为CMV-IE增强子，pEF321为EF了21启动子。

图3：phLa4-EGFP-NEO酶切后的线性图谱

human alpha-lactalbumin为人乳清α-乳清蛋白基因，GFP为增强绿色荧光蛋白基因，Neomycin为新霉素抗性基因，SalI，NotI，BamHI和MluI为酶切位点，Ampicillin为氨苄青霉素抗性基因

图4：hLA5’端引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照；6：阴性对照；7：blank.

图5：hLA3’端引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃：4：非转基因克隆牛；5：阳性对照；6：阴性对照；7：blank.

图6：GFP引物的扩增结果.

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照1；6：阳性对照2；7：阴性对照；8：Blank

图7：NEO引物的扩增结果

M：1kb ladder；1：兴娃；2：隆娃；3：会娃；4：非转基因克隆牛；5：阳性对照1；6：阳性对照2；7：阴性对照；8：Blank

图8：hLA转基因克隆牛的Southern结果.

泳道1为兴娃，泳道2为隆娃，泳道3和4为阴性对照，泳道5-7分别为1，2和5个拷贝的阳性对照.

图9兴娃、隆娃和会娃及对照牛乳样非减性PAGE电泳图，泳道1：HLA标准品，2：人乳，3：兴娃乳样，4：隆娃乳样，5：会娃乳样，6：双标载体转基因牛乳样，7：克隆牛乳样，8：普通牛催乳样，9：普通牛正常产乳样，

图10兴娃、隆娃和会娃及对照牛乳样Western杂交结果，泳道1：HLA标准品(14.1kD)，2：人乳，3：兴娃乳样，4：隆娃乳样，5：会娃乳样，6：双标载体转基因牛乳样，7：克隆牛乳样，8：普通牛催乳样，9：普通牛正常产乳样。

图11：重组和天然人α-乳清蛋白促进乳糖合成能力比较图，S1-3为人α-乳清蛋白标准品，XW，LW和HW代表兴娃，隆娃和会娃样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例

1实验材料

1.1质粒及菌株

宿主菌大肠杆菌DH5α和DH10B，pGEM-5Zf，pGEM-T购自Promega公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO购自Clontech公司

1.2实验动物

Holstein奶牛约3月龄的胎儿取自屠宰场，黄牛卵巢来自北京周边地区屠宰场。

1.3主要试剂

DMEM/F₁₂粉末、DMEM粉末培养基、台盼蓝(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；dNTP以及PCR引物购于上海生物工程公司；Taq酶购于中国农业大学农业生物技术实验室；内切酶SspI和BamHI为华美生物工程公司产品；IPTG、X-gal、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血蓝蛋白(KLH)均购自华美生物公司；饱和酚为鼎国生物工程公司产品；胰蛋白酶、青霉素链霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明质酸酶，HEPES，无脂肪酸BSA，细胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸钠，肝素钠，矿物油和其它无机盐均为Sigma公司产品。

1.4培养基的配制

SOB培养基：配置每升培养基，应在950ml去离子水加入：蛋白胨：20g酵母提取物：5g NaCl0.5g.摇动容器室溶质完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/L NaOH调节到pH7.0。灭菌

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，调节PH值至7.5，定容制1000ml，高压灭菌。

LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，调节pH值至7.5，定容至1000ml，高压灭菌。

1.5试剂的配制

DMEM培养液：DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，链霉素100mg，Mill-Q超纯水定容到1升，PH7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。使用时加10％的血清。

0.1％Trypsin/EDTA酶消化液：Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO₃，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用灭菌的Mill-Q超纯水溶解，定容至100ml，用0.2μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。

DPBS液：DPBS粉未9.7g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH 7.0-7.2，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

无钙镁PBS溶液：KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄ 12H₂0 2.88g，Mill-Q超纯水定容到1升，PH 7.0-7.4，渗透压为280-320mOsm/kg，用0.2μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

Gimsa母液：Gimsa粉末0.5g，加少量甘油将Gimsa粉末在研钵中充分研磨。再加入甘油至总量为22ml，56℃保温2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色试剂瓶中，备用。

细胞裂解液：10mM Tris.Cl(PH8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。

蛋白酶K贮存液：蛋白酶K100mg，溶于5mL灭菌水中，分装，-20度保存。

TBS液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高压灭菌。

G418贮液：1g G418溶于1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，过滤灭菌，-20度保存。

两倍电击缓冲液(2×HeBS)：280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，过滤灭菌，1mL分装，-20度保存。

1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)：121.1gTris碱溶于800ml水中，用HCl调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5Mol/L EDTA(pH8.O)：126.1g乙二胺四乙酸二钠加入到800ml水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

RNase溶液：将RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

TE缓冲液：10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌。

5mol/L LiCl：30.2g氯化锂二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高压灭菌。

50×TAE：242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。氨苄青霉素(Amp)贮存液：将氨苄青霉素钠溶于灭菌水后用0.22μm的滤器过滤除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。

3mol/L NaAc(pH5.2)：24.604g无水乙酸钠溶于80ml水中，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至100ml，高压灭菌。

lmol/L CaCl₂：在200ml水中溶解54gCaCl₂.6H₂O，过滤除菌，分装成10ml每份，贮存于-20℃，制备感受态时取出一份稀释至100ml，过滤除菌，预冷备用。

溴化乙锭贮存液：在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4℃棕色瓶内保存。

DNA提取抽提缓冲液：50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/LNaCl，1％SDS。

2×Cracking buffer：0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。

酚∶仿(1∶1)：等体积苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。

蛋白酶K溶液：用水配成20mg/ml，-20℃保存。

TCM199培养液：称TCM199粉末9.9g，NaHCO₃2.2g，丙酮酸钠0.1375g，EDTA0.372g，用1L超纯水定容，PH7.2-7.4，正压过滤灭菌，4℃保存。培养用工作液中加入10％FCS。

操作液H199：在含有25mM Hepes的TCM199中加入10％FCS。

冲卵液：DPBS溶液中加入10％FCS。

透明质酸酶：透明质酸酶0.2g，溶于10ml无钙DPBS溶液中，过滤灭菌，-20℃贮存。

工作液：用冲卵液稀释10倍。

融合液：0.3M甘露醇，0.1mM MgSO₄，0.05mM CaCl₂，0.5mMHEPES，0.05％BSA，调PH至7.2-7.4，过滤灭菌。

成熟培养液：M199培养液中加入10％FBS，10u/ml FSH，100U/ml LH，1ug/ml estradiol，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。

CRlaa培养液：

成份	终浓度(mM)	加入量g/100ml
			NaClKClNaHCO3Na PyruvatePhenol Red	114.73.126.220.41μl/ml	0.670.0230.220.002100μl

将上述成份加入90ml ddH₂O中，待所有试剂彻底溶解后，加入0.055g Hemicalcium L-lactate(5mM)。调整pH为7.4，用ddH₂O加到100ml，渗透压为265-285mOsm之间。过滤灭菌。

1.6主要仪器设备

1)CO2培养箱：美国Forma Scientific Inc.

2)倒置显微镜和荧光显微镜：日本Nikon公司

3)培养皿、培养瓶、离心管和细胞冻存管：Nunc公司

4)电击仪：美国BTX公司(ECM 2001)

5)电泳仪：DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂

6)超净工作台：北京净化设备厂

7)-80℃超低温冰箱：日本SANYO公司

8)制冰机：日本SANYO公司

9)超纯水仪：美国MILLIPORE公司

10)低温离心机：Eppendorf公司

11)高速冷冻离心机：BECKMAN公司

12)凝胶成像系统：ALPHAINNOTECH公司

13)PHS-3C酸度计：上海虹益仪器厂

14)自动灭菌锅：日本SANYO公司

15)测序仪：ABI 377型DNA sequencer，美国PERKIN ELMER公司

16)恒温水浴仪：美国LIFESCIENCE公司

17)9700型PCR仪：美国PERKIN ELMER公司

18)ABI 377 DNA测序仪：美国PERKIN ELMER公司

1.7分析工具软件及网址：

同源性分析软件：DNAMAN

PCR引物设计软件：Oligo6.0

DNA序列分析软件：Chromas

DNA及蛋白序列数据库：NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein

2实验方法

2.1转基因表达载体的构建

根据GeneBank序列(X05153)设计引物F1(上游)：5’GAGTGATGCTTCCATTTCAG3’F2(下游)：5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’。扩增人α-乳清蛋白基因5′端非编码区与第一内含子之间(包含第一外显子)的790bp的片段，反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min。

利用这对引物从Clontech laboratories.Inc.公司粘粒文库中筛选出含有人α-乳清蛋白基因的克隆(命名为phLa1)。利用NotI和NdeI双酶切阳性克隆，回收8.5kb的片段，与pGEM-5Zf载体相连，得亚克隆hLa2。将末端测序结果与已知序列比较分析，发现这个克隆缺少包括部分第二内含子至第四外显子在内的大约1kb的片段。为获得完整的α-乳清蛋白基因，以人基因组DNA为模板扩增得到其3’端缺少的片段。设计引物F4-F5，同时在引物5’端分别添加一个酶切位点(F4 BglII，F5 NotI)和一个保护碱基T。F4(上游)：

5’-TAGATCTAGGGGTTAGGGGAACT-3’F5(下游)：5’-TGCGGCCGCATTGAGTTGGTACAGACAGT-3’反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min。F4位于基因下游1375bp处，F5位于基因下游2521bp处，扩增1146bp的片段。将人α-乳清蛋白基因3′端的PCR扩增产物与pGEM-T载体相连，得到克隆phLa3，用BglII和NotI酶切该克隆，回收1.1kb的片段，并将此片段与BamHI和NotI双酶切过的phLa2片段相连，即得到人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4，酶切及测序鉴定其正确性。我们所构建的phla4载体含人α-乳清蛋白基因共9459bp，其中包括6.9kb的5’侧翼区、2.4kb的编码区和159bp的3’侧翼区。其结构模式如图1。

2.2phLa4-EGFP-NEO表达载体构建

1).phLa4标记表达载体的构建策略

为了便于筛选阳性细胞，我们首先构建了含绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因双选择标记载体(pEGFP-NEO)以及新霉素基因单选择标记载体(pNEO)，然后分别将两个标记载体与此前构建的pBC-hLa载体连接构建成phLa-EGFP-NEO和phLa-NEO表达载体。

1)pEGFP-NEO的构建

用NotI和SalI酶切pBCl回收约6kb的片断，连接一个依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，构建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片断EGFP-IRES-NEO，同时用BamHI和NotI酶切pXM，并与EGFP-IRES-NEO连接即构成pEGFP-NEO，如图2。

2)phLa4-EGFP-NEO表达载体构建

用NotI和SalI酶切phLa4和pEGFP-NEO，将两者连接即构成phLa4-EGFP-NEO，通过酶切及测序分析，确定phLa4-EGFP-NEO载体构建成功，载体图如下(图3)：

2.3细胞培养，基因转染及阳性细胞筛选

2.3.1胎儿成纤维细胞的原代培养

在超净工作台中将胎儿浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗几遍，以消毒过的手术器械取下耳部及脊背部的数块表皮组织于DMEM+10％FCS培养液里。

                                 ↓

在直径60mm平皿中将胎儿组织切碎成为1mm³大小的组织碎块，再将组织碎块转移至15ml离心管中，1000rpm下离心洗涤数次。

                                 ↓

用消毒玻璃弯头吸管将小组织碎块吸至25cm²培养瓶中，通过玻璃吸管弯头使组织块均匀分布在瓶壁上。

                                 ↓

小心翻转培养瓶(防止组织块落下)让组织块黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO₂培养箱中放置2～4h，待组织块贴壁后，再正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。

2.3.2胎儿成纤维细胞的传代、冷冻、及复苏

待种植的原代细胞生长至80％汇合时，将细胞一部分冷冻，一部分传代继续培养。

2.3.2.1传代

用消毒玻璃弯头吸管小心吸除培养瓶中的培养液，沿着细胞生长壁的对面瓶壁注入无钙镁PBS(37度温育)冲洗细胞两次，以祛除残余血清及细胞代谢物。

                                 ↓

用同样方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量为可覆盖细胞单层即可(直径100mm培养皿一般加入1ml消化液，35mm培养皿中加入200u L消化液)，放入培养箱中消化1-2min。在显微镜下观察，待细胞开始变圆时，用手指敲打培养皿壁，使细胞彻底脱壁，然后加入培养液终止消化。

                                 ↓

用消毒玻璃弯头吸管反复吹打，细胞，使其分散成为单个细胞，1000rpm下离心5min收集细胞。用培养液按1∶2或1∶3比例稀释并重新接种细胞至培养皿中培养。

2.3.2.2冷冻

贴壁细胞消化后，收集细胞于离心管中，在1000rpm下离心5min以去尽上清。

                                 ↓

加4度预冷的冷冻液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重悬细胞沉淀，使细胞浓度约为10⁷个细胞/ml，转移细胞至冻存管中。

                                 ↓

放入4度冰箱预冷30min，再把冻存管插于厚泡沫上后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。

2.3.2.3复苏

从液氮中取出冻存管，快速投入37度水浴中，并在水浴中不断快速摇动冻存管以迅速解冻。

                                 ↓

待冷冻液彻底解冻后，以新鲜培养液稀释10倍并将溶解液转移至离心管中，在1000rpm下离心5min去除DMSO以缓减冷冻液毒性。

                                 ↓

用新鲜的培养液悬浮细胞沉淀，将细胞稀释至所需浓度，继续培养。

2.3.3体细胞注射用DNA的准备

大提质粒phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO，以SalI酶切质粒，酶切反应如下：

质粒DNA                 约10-20μg

10×反应buffer          20μl

限制性内切酶            10-20U

ddH₂O                  补足体系至200μl

上述试剂加好后，混匀，37度水浴消化2h，取5μL酶切产物以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍体积无水乙醇和0.1倍体积乙酸钠(PH5.2)，混匀后置-20度过夜；12000rpm离心15min回收沉淀，70％乙醇洗涤一次，真空干燥，加TE溶解。

2.3.4牛胎儿成纤维细胞对G418毒性敏感性检测

细胞培养到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×10⁵个细胞接种到13个直径35mm培养皿中以使细胞尽量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入终浓度从100μg/ml到1200μg/ml的G418，还有一孔中不加入G418作为对照。连续培养三周，每3～4天换液一次，同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡情况。

2.3.5电击转染

转染前将10～50μg纯化回收的DNA融入500μl 2×HeBS中，补充灭菌超纯水至1ml，冰浴预冷。

                                  ↓

在转染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培养细胞。将1×10⁶个细胞转接于75cm²培养瓶内，加入完全培养液，置37度、5％CO₂培养箱中培养。

                                  ↓

转染前，在倒置显微镜下观察培养的细胞，确定细胞处于对数生长后期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，1000rpm离心5min沉淀细胞。

                                  ↓

将细胞沉淀用冰浴预冷的1×HeBS离心洗涤1次，同时进行细胞计数。

                                  ↓

将一定数量的细胞重新悬浮于加有DNA的电极缓冲中，混合均匀后转入电击杯中，在电击前冰浴10min。

                                  ↓

当细胞准备好进行电击时，设置电场强度(E)和脉冲时间(t)，先试一下，确保产生了所需的脉冲。将电击杯插入电击槽中，按照选定的电场强度(E)和脉冲时间(t)，电击细胞。

                                  ↓

将经电击后的细胞冰浴10min后转入75cm²的培养瓶中，加入含20％FCS的DMEM培养液中于37度、5％CO₂培养箱中培养。

                                  ↓

1-2天后待细胞生长状态恢复，将细胞扩大10倍培养，加入适量的G418进行筛选。

                                  ↓

每3～4天换液一次，同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡情况。6-10天后，挑选阳性克隆细胞。

2.3.6阳性细胞的单克隆培养

在荧光显微镜下观察上述方法所得细胞克隆的发光情况，用记号笔圈住分散良好(远离其它克隆)且细胞数量多的荧光克隆；吸除培养液，用无钙镁PBS漂洗细胞二次，在高倍解剖镜下，将30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在标记好的细胞克隆上，待克隆的大多数细胞收缩脱壁后，不等细胞悬浮，快速吸取细胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的细胞；转移细胞到加有500μl培养液的四孔板中，吹打分散细胞团块；挑出的克隆继续培养，降低G418浓度至300μg/ml维持筛选；待克隆细胞数量扩大后或汇合后，将一部分细胞转移到35mm培养皿中继续扩大培养，另一部分用于转基因检测，其它扩大后的细胞尽早冷冻。

2.4转基因体细胞克隆

2.4.1卵母细胞的成熟培养

从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2～8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/mlbLH+Iμg/ml estradiol)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO₂培养箱中成熟培养18～20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1％透明质酸酶的管内振荡2～3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体.

2.4.2卵母细胞的去核

将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用.

2.4.3移核与融合

将血清饥饿2～4d的供体细胞用0.25％trypsin消化2～4min，选择直径为10～12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步激活处理.

2.4.4重构胚的激活与培养

将重构胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后换到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO₂培养箱中培养2d后观察分裂率，7d后观察囊胚发育率

2.4.5胚胎移植与妊娠检测

将形态优良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受体母牛的子宫角内.受体母牛选择的都是经产母牛，其中红系冀南黄牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入鲁西黄牛.在移植后的第60d进行直肠检测，以确定妊娠率.

2.5转基因克隆的PCR和Southern鉴定

2.5.1PCR检测

为了确证phLa4-EGFP-NEO转入牛基因组中，对于hLa4，我们设计了两对引物，

引物1序列为，上游：5’GAG TGA TGC TTC CAT TTC AG 3’，下游：5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’；反应条件为：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min；产物长度为790bp；

引物2序列为，上游：5’-TAG ATC TAG GGG TTA GGG GAA CT-3’下游：5’-TGCGGC CGC ATT GAG TTG GT ACA GAC AGT-3’反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃7min；产物长度为1146b。

于EGFP基因，引物序列为：上游：5`TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3`下游：5`CTCAGG TAG TGG TTG TCG GG 3`。PCR条件：94℃5min；94℃40sec，62℃40sec，72℃40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，产物长度为380bp。

对于NEO基因，引物序列为：上游：5`AGG ATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTCCTG 3`下游：5`AAG AAC TCG TCA AGA AGG CGA TAG AAG GCG 3`。PCR条件：94℃5min；94℃40sec，60℃40sec，72℃40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，产物长度为490bp。

由于人α-乳清蛋白基因长约10kb，因此我们分别在其5’端和3’端设计一对引物，从图4和图5可以看出，克隆牛兴娃、隆娃和会娃转有完整的人α-乳清蛋白基因。从图6和图7则可以看出，这三头克隆牛同时双标记选择载体。

2.5.2Southern检测

取PCR检测为阳性的转基因克隆牛DNA约10μg用EcoRI消化，低压慢速电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P³²dCTP同位素标记的1.5kb的hLA基因片段。以phLa4-EGFP-NEO质粒为阳性对照，以非转基因克隆牛基因组为阴性对照，杂交可得到1.5kb片段，如图8所示进一步确定了兴娃和隆娃转有人乳清蛋白基因，可以估计兴娃和隆娃转有1个拷贝的人α-乳清蛋白基因，根据转基因小鼠结果，可以推测这两头转基因牛将能在乳腺中高效表达人α-乳清蛋白.

2.6转基因牛重组人α-乳清蛋白表达及活性分析

2.6.1药物催乳

以西安草滩药厂生产的催乳针按1/4剂量对6-8月龄的转基因克隆牛进行药物催乳，同时以双标记载体转基因克隆牛、普通克隆牛、同月龄普通黑白花奶牛作为对照进行催乳，还以普通牛奶为对照，每天收集3次奶样，共收集两周。

2.6.2转基因牛奶的PAGE电泳、Western和放免测定

对转基因牛的乳样用重蒸灭菌水稀释三倍，进行去乳脂、去酪蛋白的处理，最后得到乳清部分。α-乳清蛋白即存在于乳清中。对转基因牛奶样和对照乳样进行脱脂和去酪蛋白后，用减性(reducing)SDS上样Buffer变性的PAGE胶进行电泳，结果如图9。从此图可以看出三头转基因牛奶样有一条与人α-乳清蛋白标准品大小一致的特异条带。用兔抗人α-乳清蛋白抗体进行Western杂交，结果如图10。从Western结果可以看出三头转基因牛奶样和人奶有一条与α-乳清蛋白标准品大小一致的特异条带，表明转人α-乳清蛋白基因的转基因牛乳腺中能表达完整的重组人α-乳清蛋白。

利用放射性免疫法检测转基因牛奶样中重组人α-乳清蛋白的表达量。人α-乳清蛋白标准品用¹²⁵I用氯胺—T法标记，取6个时间点的乳样进行检测。测得乳样中重组人α-乳清蛋白的表达量平均值为1.10-1.55g/l，表明我们所使用的具有完整自身调控区的人α-乳清蛋白基因结构可以在转基因牛乳腺中高效表达完整的重组人α-乳清蛋白。

2.6.3重组人α-乳清白蛋白生物活性检测

α-乳清白蛋白可以改变β-1，4-半乳糖苷转移酶底物的特异性，使乳糖能在生理条件合成。在缺乏α-乳清白蛋白的情况下，β-1，4-半乳糖苷转移酶催化UDP-半乳糖与N-乙酰葡萄胺结合，合成N-乙酰乳糖胺和UDP，化学反应式如下：

。

而加入α-乳清白蛋白后，可以提高β-1，4-半乳糖苷转移酶对葡萄糖的底物结合能力，化学反应式为： 。

为了鉴定重组的人α-乳清白蛋白是否具有此活性，进行体外验证。在此反应体系下：100ul溶液中加入5.78mU GTase，50mM Hepes (pH6.63)，0.0245％Triton X-100，0.0245％BSA，9mM MnCl₂，25mM Glucose，0.4mM UDP-Galactose，10μl重组alpha-lactalbumin，37℃反应2小时，合成乳糖。用乳糖检测试剂盒检测乳糖的合成。结果如图11所示，重组蛋白同样可以合成乳糖，表明重组α-乳清白蛋白具有天然生物活性。

附1：SEQ ID NO 1：完整的人α-乳清蛋白基因序列，序列图如下：包括6.9kb的5’侧翼区和159bp的3’侧翼区，全长9459bp；四个外显子及三个内含子，其中6937-7185为第一外显子，7743-7911为第二外显子，8390-8465为第三外显子，8965-9297为第四外显子。

1      ATATGAACTT TAAAGTAGTT TTTTCCAATT CTGTGAAGAA AGTCATTGGT AGCTTGATGG

61     GGATGGCATT GAATCTATAA ATTACCTTGG GCAGTATGGC CATTTTCACG ATATTGATTC

121    TTCCTACCCA TGAGCATGGA ATGTTCTTCC ATTTGTTTGT ATCCTCTTTT ATTTCATTGA

181    GCAGTGGTTT GTAGTTCTCC TTGAAGAGGT CCTTCACGTC CCTTATAAGT TGGATTCCTA

241    GGTATTTTAT TCTTTTTGAA GCAATTGTGA ATGGGAGTTC ACTCATGATT TGGCTCTCTG

301    TTTGTCTGTT ATTGGTGTAT AAGAATGCTT GTGATTTTTG TACATTGATT TTGTATCCTG

361    AGACTTTGCT GAAGTTGCTT ATCAGCTTAA GGAGATTTTG GGCTGAGACG ATGGGGTTTT

421    CTAGATATAC ATTCATGTCG TCTGCAAAGA GGGACAATTT GACTTCCTCT TTTCCTAATT

481    GAATACCCTT TATTTCCTTC TCCTGCCTAA TTGCCCTGGC TAGAACTTCC AACACTATGT

541    TGAATAGGAG TGCTGAGAGA GGGCATCCCT GTCTTGTGCC AGTTTTCAAA GGGAATGCTT

601    CCAGTTTTTG CCCATTCAGT ATGATATTGG CTGTGGGTTT GTCATAGATA GCTCTTATTA

661    TTTTGAGATA CGTCTCATCA ATACCTAATT TATTGAGAGT TTTTAGCATG AAGGGTTGTT

721    GAATTTTCTC AAAGGCCTTT TCTGCATCTA TTGAAATAAT CATGTGGTTT TTGTCTTTGG

781    TTCTGTTTAT ATGCTGGATT ACATTTATTG ATTTGTGTAT ATTGAACCAG CCTTGCATCC

841    CAGGGATGAA GCCCACTTGA TCATGGTGGA TAAGCTTTTT GATGTGCTGC TGGATTCGGT

901    TTGCCAGTAT TTTACTGAGG ATTTTTGCAT CAATGTTCAT CAAGGATATT GGTCTAAAAT

961    TGTCTTTTTT GGTTGTGTCT CTGCCAGGCT TTGGTATCAG GATGATGCTG GCCTCATAAA

1021    ATGAGTTAGG GAGGATTCCC TCTTTTTCTA TTGATTGGAG TAGTTTCAGA AGGAATGGTA

1081    CCAGTTCCTC CTTGTACCTC TGGTAGAATT TGGCTGTGAA TCCATCTGGT CCTGGACTCT

1141    TTTTGGTTGG TAAGCTATTG ATTATTGCCA CAATTTCACA GACTGGCAAA TTGGATAAAG

1201    AGTCAAGACC CGTCAGTGTG CTGTATTCAG GAAACCCATC TCATGTGCAG AGACACACAT

1261    AGGCTCAAAA TAAAAGGATG GAGGAAGATC TACCAAGCAA ATGGAAAACA AAAAAAGGCA

1321    GGGGTTGCAA TCCTAGTCTC TGATAAAACA GACTTTAAAC CAACAAAGAT CAAAAGAGAC

1381    AAAGAAGGCC ATTACATAAT GGTAAAGGGA TCAATTCAAC AAGAGGAGCT AACTATCCTA

1441    AGTATATATG CACCCAATAC AGGAGCACCC AAGTTCATAA AGCAAGTCCT GAGTGACCTA

1501    CAAAGAGACT TAGACTCCCA CACAATAATA ATGGGAGACT TTAACACCCC ACTGTCAACA

1561    TTAGACAGAT CAACGAGACA GAAAGTTAAC AAGGATACCC AGGAATTGAA CTCAGCTCTG

1621    CACCAAGCAG ACCTAATAGA CATCTACAGA ACTCTCCACC CCAAATCAAC ACAATATACA

1681    TTTTTTTTCA GCACCACACC ACACCTATTC CAAAATTGAC CACATAGTTG GAAGTAAAGC

1741    TCTCCTCAGC AAATGTAAAA GATCAGAAAT TATAACAAAC TGTCTCTCAG ACCACGGTGC

1801    AATCAAACTA CAACTCAGGA TAAAGAAACT CACTCAAAAC CGCTCAACTA CATGGAAACT

1861    GAACAACCTG CTCCTGAATG ACTACTGGGT ACATAACGCA ATGAAGGCAG ACATAAAGAT

1921    GTTCTTTGAA ACCAACGAGA ACAAAGACGC AACATACCAG AATCTCTGGG ACACATTCAA

1981    AGCAGTGTGT AGAGGGAAAT TTATAGCACT AAATGCCCAC AAGAGAAAGC AGGAAAGATC

2041    CAAAATTGAC ACCCTAACAT CACAATTAAA AGAACTAGAA AAGCAAGAGC AAACACATTC

2101    AAAAGCTAGC AGAAAGCAAG AAATAACTAA AATCAGAGCA GAACTGAAGG AAATAGAGAC

2161    ATAAAAAACC CTTCAAAAAT TAATGAATCC AGGAGCTGGT TTTTTTGAAA GGATCAACAA

2221    AATTGATAGA CCGCTAGCAA GGCTAATAAA GAAGAAAAGA GAGAAGAATC AAATAGATGC

2281    AATAAAAAAT GATAAAGGGG ATATCACCAC CGATCCCATA GAGATGCAAA CTACCATCAG

2341    AGAATACTAT AAACATCTCT ACGCAAATAA ACTAGAAAAT CTAGAAGAAA TGGATAAATT

2401    CCTTGACATA TACACCCTCC TAAGACTAAA CCAGGAAGAA GTTGACTCTC TGAATAGACC

2461    AATAACAGGC TCTTTTTTGT TTTTTAAATT TTGGTGGGTA CATCATAGCT GTGTATATTT

2521    ATGGGGTACA TAAAATGTTT TGATACAGGC ATGCAATGTG AAATAAATAC TTTATGGGGA

2581    ATGCGGTGGT AGATTGTTAA TATGAGTTGC CAGGATGATG TTTGGCAAGG AAGAAATGAG

2641    GAGGAAGAAA GGGAAGCCAT TCCTAAAAGG AAAGGAAAAA CTACCATGTT CACAAAAAAT

2701    AGGATGTAAG ATTCTATCAA AGGTGTTGAT GTAAAATTAT GTAAATATGT TTATTTAAAA

2761    ATAAACATTT TATAAATTAA AAATGAAAAA TCAATTAAAA TTTGCATAGA AATTTTTTTA

2821    GCTTCTTGGT AATTACATGT GTATCGGTTT GTTTTAGCTA ATATTCAGTT AAAAAGGTAA

2881    AATTTATTTT AGTATCTTTT AAAATCATTT TTGTGTTATA ATTTATATTT CCATGCTTGC

2941    ATTTTTTGGT TGATACTATC CCCAATTCAC ACAAATGAAT CAATGGTTCA TTTAAGTATA

3001    AAAGCAGTGA TATAAATAGT AATGCAAATA TAGCAATCCA AAATAAGCCC ATATAAATTG

3061    CAAGCAGGCC TTTGGTGTGG GATATAGAAT GTGAATCTAT AATGCTGAGT AACTTTGTAA

3121    GGACTTTTGG ACAAGCAGCT GAAAAAGAAA AATGCCAATA AAAAATCACT CCCTTTCTAA

3181    ATCTTAATTA CTTTAATTAA CTCTTTAATT TGGTTAAACA TTTTCATGAA ATTTGGGTTT

3241    CAAGATCTAG CATCATTGTC TACCTAGTGA TAATTTTCCT GAATTATGAG AGAAAGTAGA

3301    ACAAGATGAG GATATAAGTG TATTTTAAAA TAGAGACAGG GTCTTGCTCT ATTGCCCAGG

3361    CTAGAGTGAG TGGCACAATC AAAGCCCACT GCATTCTTGA ACTCCTGGGC TCAAGCAATC

3421    CTCGTACCTC AGTAGCTAGG ACTATAGGCA CGTGCCACTA TGCCTGGCTA ATTTTTATTT

3481    TTTTTTGTAG TGACAGAGTC TTGCTATGTT GCCCAGGCTG GTCTCCAACT CCTGGCCTCA

3541    AGTGATCCTC CTGCCTCAGC CTCCCAAAAT GTTGGGAGTA TAGGCATGAG CCACTGCAGG

3601    CACAAGGTAA GGATATTAAC TGCAAGATGT AATGGCCATT ATGACTGTGG CTCTCAGGGT

3661    GTTCCCTCTA AATGGCAGGC CTAGGCTCTG TCTAGAAACT CCAGCTCACC TACAGACTAC

3721    AGTTTCAGAT GGAAAACGTG CCTTGAAACA CATGCTTTCA ATTTCTTTAT TTTCAGAAAT

3781    AAAGATATTT TAATTTTATT TTTATTATTA TTATTATTTT TTGAGATGGA GTCTTGCTCT

3841    GTTTCCCAGG CTGGAGTGCA GTGGCACAAT CTTGGCTCAC TGCAGCCTTC ACCTCCTGGG

3901    TTCAAGCGAT CCTCCTGCCT CAGCTGCCCG AGTAGCTGGG ATTATAGACT CCTGCCAGCA

3961    TGCTCAGCTA ATTTTTGTAT TTTTAGTAGA GACGGAATTT TGCCATGTTG GTCAGGCTGG

4021    TCTCGAACTC CTGACCTCAA ATAATCTGCC TACCTTGGCT TCTCAAAGTG CTGGGATTAC

4081    AGGCATGACC CACCATGCCC GGCCTGAACT TTTTATTTTA TAAATAAAGA AATTTACTTT

4141    TAGAAATAAA ATTTTTATTT TGTTCATCTT CAAAAAGGTG ATTTCTGGTT TTAGAAACCT

4201    GGATATTTCC CCACAGCATC TGAGAGAATG AACATAATTT TCTAGTCTAT TTCTAACAAA

4261    ATCTAGGTAA GTGTATTGTA AATGCCTCTT CACCATCTTG ATTCAGCTCT CGACCTCCAT

4321    GCAGAGCACC CTGAGTAAAC CTCTCTGGAA AGGGAGATTT TGGAGGAGGT TTCTTCCTGG

4381    ACAGGAATTG TTGAGCAGGA GCTTTCTTCC ACGAGCTGTG CTTAATGTCT TTCCACATAC

4441    TTCCTCTTTC AGTGCTGCGA TCATTGTGTA TTGTTCTCCT TTGGACAATC TCCAAGAGGC

4501    TGCATCTTTC TCTGGATGTT TGCAGTTGTT CCCATTAGAC ACTTTCTATC TTCTTTTTCA

4561    GATGACCCCC ACGTATCCTA TTTTAAGAAC ATTTATAGGG AAATAATGGT TCCTTTTGCC

4621    GGAGACATGT TTATTTTCTT TTCTGCACTT AGTTGTGATT CCTGACCTGT ATGCTTATTT

4681    TTATTGCTTA TAGGGAAGGG CCAAGGTATA ATCAAATGAT AGGCAAGCAG GCAGCTGCCT

4741    TAGGTCTTGA CTTGGCTGAA AGTGTAGAAA ACCCCTGTGA TTCTTGAGAC CCTGGCCCAC

4801    CCTTTTACTC TATCACAGGT ACTTAGTCAA TAGCCTAGGG CAGGAGGCAT TTTACACAAG

4861    ACTCCACTAT TGGAAGGACT AGTCCTCAGG ACTAGCTTTT CTTATCTTTC CCTCTCACAC

4921    ATGGTTCAAG GTCACTCTCA GCCATATTCT CAACAAAGCT TAGAGTGATA GAATTCCCAT

4981    TCCTGTCGTG TACCCTTGCA GTGCCTCTGG GTGGAATGCG GAGAAATGGA GTGGCTCCAC

5041    TTCTGTTGTG TTTCTGAAeA TGTATCTCTT GCTATCAGAA CTTTCTGCTC ATCCCTTCTG

5101    GCACACCAAG ATCCTCCAeA TTCCCTTCAC TCATGCCACT TCATATACTG GTTATCCATG

5161    GTACAGAAGA CAGGATTTAA CTGAGAGGAC TTTTCCCTGA CTCTGAATAC ATGTAGGAGA

5221    TAACGATATG GAAGACCTTC AGTATGTAAG TCTTAAATAG ATTGGTTGGG ATAAATGTTC

5281    CCTGAAACAT AAGAAACAGC GCAGCGGCTC CTGTCTGTAA TCCTAGCACT TTGGGAGGCC

5341    GAGGCCCAGG CAGGCAAATT GCCTGAGCTC AGAAGTTTGA GACCAGCCTG GCCAACATGC

5401    AGAAACTCCG TCTCTACTAA AAATACATAA ATTAACCGGG CATGGTAACA CGTGCCTGTA

5461    GTCCCAGCTA CTCGGGAGGC TGAGGCAGGA GAATCACTTG AGCCTGGGAG GCAGAGGTTG

5521    CAGTGAGCCA AGATCGCGCC ACTGCATTCC AGCCTGGGCA ACAGAGTGAG ACTTGGTCAA

5581    AAAAAAAAAA AAAAAAGGAA GAAGAAGAAG AAATCAGGTT TAGAGATGAG GACAAAGAAG

5641    ACGAATGGTG GCATGAAGGA GCTAAGAGCT ACTTGTCACC ATGACATGAA GCTTCATGCC

5701    AGCAAATTAA AGGAGCTATT CAGAACTAGT ATCCTCAACT CTACTTGCTC AGGGGCACTG

5761    ACCTTATAGA GATTCCAGAC ATAAGCTTGT TCAGCCTTAA AGTCCAATCT TTCCACTGGC

5821    TTGGGTCCTT CCCACTTTCT GTGGCCAACT CTGAGGTTGT CTACAAGTTA TTGGTCTTAG

5881    ATTTATGTAA TGTCTCAATG CCAGTGTAGT ATTTGGTTAT TTACGGTAGG AGTGGTTAGG

5941    GGTGGGGAAT CTGATAATAG CTCGTAGGAT AGCTAGATTC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT

6001    TAAAGATAGG GTCTCACTTT GTCTCCCAGG ATGGATGGAG TGCAGTGGAG TGAACATGGC

6061    TCACTGCAGC CTCGACCTCC TGTGCTCAAG TGTTCCTCCT GCCTCAGCCC CTCAAGTAGC

6121    TGGGACTACA GGCACATGTC ACCATGCCCA GCTAATTTTT TTTGTAGAGA TGGGATTTTA

6181    CCATGTTGCC CAGGCTGGTC TCGAGCTCCT GGGCTCAAGT GATCCACCAG ACTCGGCCTC

6241    CCAAAATGCC GGGATTACAG GTGTGAGCCA CTGTGCCTGG CCTAGATGCT TTCATACAGG

6301    CTTTTCAATT ATGCATTTTC CTTAAGTAGG AAGTCTTAAG ATCCAAGTTA TATCGGATTG

6361    TTGTAGTCTA CGTTCCCATA TTCTATTCCT ATTTCTGAGC CTTCAGTCAT GAGCTACCAT

6421    ATTAAAGAAC TAATTCTGGG CCTTGTTACA TGGCTGGATT GGTTGGACAA GTGCCAGCTC

6481    TGATCCTGGG ACTGTGGCAT GTGATGACAT ACACCCCCTC TCCACATTCT GCATGTCTCT

6541    AGGGGGGAAG GGGGAAGCTC GGTATAGAAC TTTATTGTAT TTTCTGATTG CCTCACTTCT

6601    TATATTGCCC CCATGCCCTT CTTTGTTCCT CAAGTAACCA GAGACAGTGC TTCCCAGAAC

6661    CAACCCTACA AGAAACAAAG GGCTAAACAA AGCCAAATGG GAAGCAGGAT CATGGTTTGA

6721    ACTCTTTCTG GCCAGAGAAC AATACCTGCT ATGGACTAGA TACTGGGAGA GGGAAAGGAA

6781    AAGTAGGGTG AATTATGGAA GGAAGCTGGC AGGCTCAGCG TTTCTGTCTT GGCATGACCA

6841    GTCTCTCTTC ATTCTCTTCC TAGATGTAGG GCTTGGTACC AGAGCCCCTG AGGCTTTCTG

6901    CATGAATATA AATAAATGAA ACTGAGTGAT GCTTCCATTT CAGGTTCTTG GGGGTAGCCA

6961    AAATGAGGTT CTTTGTCCCT CTGTTCCTGG TGGGCATCCT GTTCCCTGCC ATCCTGGCCA

7021    AGCAATTCAC AAAATGTGAG CTGTCCCAGC TGCTGAAAGA CATAGATGGT TATGGAGGCA

7081    TCGCTTTGCC TGAATGTGAG TTCCCTGCCT CTGTGTTTCA TCCATTCCTC ATACGCTTCT

7141    CTCCTCCATC CCCTCTTTCT TCCACTTCGC CCCTCCACTT TTACTTAATT ATCTAATCAT

7201    CCTCTTTTCT GCTCATTTGC ATACTCTTTT ATTTCATGTA TGTATATATG TATGTATTTA

7261    TTTATTTTTG AGGTGGAGTT TCGCTCTTGT TGCCCAGACT GGAGTGCAAT GGTGTAATCT

7321    CGGCTCACTG CAACCTCCGC CTCCTCGGTT CAAGTGATTC TCCTGCCTCA GCCTCCCAAG

7381    TAGCTGGAAT TACAGGCACC CACCACCATG CCTGGCTAAT TTTGTATTTT TTGTAGAGAC

7441    AGGGTTTCAC CATGTTGGCC AGGCTGGTCT CAAACTTCTG ACCTCAGGTG ATCCGCCCTC

7501    CTCAGCCTCC CAAAGTGTTG GGATTACAAG CGTGAGCCAT CATGCCTGGC CCCATTTATT

7561    TTCCTATCCT TTCTTTCTCT TATTGTCTGA TTTTTTTTTG GAATTCTCCA TCTCATCAAG

7621    AAACTCTGAG CTTTGCCATC TTTGGAGATT GGCTGGAAAG CATTTTTGTC TGAGAATTAC

7681    AGTTCCTCCT TTATGCAGAT CCTGTACATC TCTGTGGTAT CTCTTTCTCA TCTTTCCCTC

7741    AGTGATCTGT ACCATGTTTC ACACCAGTGG TTATGACACA CAAGCCATAG TTGAAAACAA

7801    TGAAAGCACG GAATATGGAC TCTTCCAGAT CAGTAATAAG CTTTGGTGCA AGAGCAGCCA

7861    GGTCCCTCAG TCAAGGAACA TCTGTGACAT CTCCTGTGAC AGTGAGTAGC CCCTATAACC

7921    CTCTTTCTCT GTTTTTCTGA GGCCTGCCCT TGGGATAATC TCCTTTTTAG TGCCAAGCAG

7981    ACCTCAGGCT TCATTGCCTT GGCTGGGCTC TATAAAAATT GTGGGACTTG AATTGGCAGT

8041    ACTGAGTAAG AAGCTGTTTG GATTTTTCAT GGTCATCAAA TCCCCAGACA GTTCCTTGAG

8101    GTTCAGTGGT AGACAATCGG AGCTGTCTGA GAGTCTTGGA ATCTGATTGT CTGCATTTTC

8161    AGGGTAAGTC AGTTGATGAA GCTGATGATT CCTCCAGAGA TATCCCAGGG AAATGAAGGA

8221    AGTCCCTACC CAGGGTTAGA CATTACCACA TTGGTCCTTT CATATAGAAA GACAACAGGC

8281    ACAAGCCTTG AGTTTAGAGA ACCCACTGGA TCAGGGGTTA GGGGAACTCA GTGCCTTTCT

8341    GGGTAATACT TGTCAGCTGT CTCAATCCTT TCCCTGTAAC TCCTGCCAGA GTTCCTGGAT

8401    GATGACATTA CTGATGACAT AATGTGTGCC AAGAAGATCC TGGATATTAA AGGAATTGAC

8461    TACTGGTGAA TCCTTATTCT ATTTTCTATT TCCCCATCCT CCTTCTCCTT ACCCCATTAG

8521    CCCAGCACCC CTTTCCTCTT ACCCTATCTC TTGGTCATTT AATCTAGAAT ACAGTGTCTG

8581    AAACAAAGCT TACCTAGAGA CTCAGGTTTC TGTTATTAAG CCTCTCTCGC TCCGCTCCTT

8641    GGTAGCAATT TTCCTAATAA GGGGTTGCCT AATGGAGGGC TCAGACCCAG GCCTCCTTTC

8701    ACTTAGACTT GGACATCTAA TTCCACTTGT TTAGTTCTAT GCCCTAAAGC AAGCTGTTGG

8761    TAACATTGCA TCTCTTTTTT AACCCTACAA TTTTCTTGGA TATTTTTTAT GGACTGTATT

8821    CCACTTGATG GCTTGTGTCG CTTGACATCA GGCCAGGAAT GTCTTTCTGT AATTCTCGTC

8881    CACGCTCTTC CACTTCAGCC CTCCTGGGAA TGAATGTAAA GATTCAGTCA GCTAACTCAC

8941    CTTGTCCCCC TTCTCCATTA TCAGGTTGGC CCATAAAGCC CTCTGCACTG AGAAGCTGGA

9001    ACAGTGGCTT TGTGAGAAGT TGTGAGTGTC TGCTGTCCTT GGCACCCCTG CCCACTCCAC

9061    ACTCCTGGAA TACCTCTTCC CTAATGCCAC CTCAGTTTGT TTCTTTCTGT TCCCCCAAAG

9121    CTTATCTGTC TCTGAGCCTT GGGCCCTGTA GTGACATCAC CGAATTCTTG AAGACTATTT

9181    TCCAGGGATG CCTGAGTGGT GCACTGAGCT CTAGACCCTT ACTCAGTGCC TTCGATGGCA

9241    CTTTCACTAC AGCACAGATT TCACCTCTGT CTTGAATAAA GGTCCCACTT TGAAGTCACT

9301    GGCTGTAATT TTTTTCCCCC TGGAGGGAAG GGGAAGAAAT AGGATGAGTA GGTGGACACT

9361    GAAGCCATAG GTCATAGCCA CCTTCCATCT CTACTGAAGA AGAAGTAGGC TGAATTTACA

9421   ATAGAAAGGT GAAGGTTACT GTCTGTACCA ACTCAATGC

附2：SEQ ID NO 2：人α-乳消蛋白一级结构即氨基酸序列，共142个氨基酸，其中前19个为信号肽序列，HLA氨基酸序列图如下：

1      MRFFVPLFLV GILFPAILAK QFTKCELSQL LKDIDGYGGI ALPELICTMF

51     HTSGYDTQAI VENNESTEYG LFQISNKLWC KSSQVpQSRN ICDISCDKFL

101    DDDITDDIMC AKKILDIKGI DYWLAHKALC TEKLEQWLCE KL

Claims (7)

1.一种转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，其操作步骤如下：(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因结构构建乳腺特异表达载体，(2)构建人α-乳清蛋白乳腺特异表达载体与双标记选择载体的串联结构，将串联结构DNA导入家畜体细胞核内，获得转基因细胞，(3)利用转基因细胞为核供体进行体细胞克隆，获得含有人α-乳清蛋白的转基因克隆大型家畜。

2.根据权利要求1所述的转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，其中所述乳腺特异表达载体含有全长9459bp的完整人α-乳清蛋白基因序列，所述完整人α-乳清蛋白基因序列由6.9kb的人α-乳清蛋白基因5’侧翼区、2.4kb的人α-乳清蛋白基因编码区和159bp的人α-乳清蛋白基因3’侧翼区组成。

3.根据权利要求1所述的转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，所述的DNA导入方法为电穿孔转染法。

4.根据权利要求1所述的转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，所述的双标记选择载体以增强型绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因为标记选择基因。

5.根据权利要求4所述的转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，所述串联结构DNA为phLa4-EGFP-NEO。

6.根据权利要求1所述的转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，所述大型家畜为牛、山羊、绵羊、猪或兔。

7.根据权利要求6所述的转人α-乳清蛋白基因的转基因克隆大型家畜的生产方法，其中所述大型家畜为牛。

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