CN1274814C - 一种提高转基因动物生产效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高非人类转基因动物生产效率的方法，该方法是利用包括基因转移步骤在内的体细胞核移植技术进行生产转基因动物，所述基因转移是利用能够同时表达增强绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因、并且包括细胞巨化病毒IE增强子、人延伸因子1α启动子pEF321、EGFP-IRES-NEO以及SV40的加尾信号和多克隆位点的双标记选择载体实现的；所述基因转移的受体细胞是胎儿输卵管上皮细胞。本发明建立了一套能够有效提高体细胞克隆介导的转基因动物特别是转基因家畜生产效率的方法，为转基因动物特别是转基因家畜在药用蛋白、营养蛋白和工业蛋白的生产，异种器官移植，牛乳的人乳化以及动物疾病模型的建立等方面的广泛应用提供了一个重要的技术基础，具有重要的理论意义和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及动物转基因技术领域中一种提高转基因动物生产效率的方法。
背景技术
动物转基因研究是生物技术领域的研究热点，它的应用范围已经渗透到基础研究、农业、医药等诸多领域。动物转基因研究是指借助各种实验手段，使按照特定目的构建的外源基因结构整合到宿主动物的基因组中，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代的过程。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称转基因动物。
自从首例转基因动物于1980年成功诞生以来，虽然有多种生产转基因动物的方法问世，但应用最广泛的仍然是最早建立的原核显微注射法。它首先应用于生产转基因小鼠，之后也用于生产转基因的家畜。可是该方法却存在着效率低下(1％-5％)、成本昂贵、后代嵌合体比例高等缺陷，特别是对于生产转基因大家畜而言，情况尤为严重。首先，要获得大量的原核期受精胚胎，无论是通过超排后的外科手术，还是超排后的直接屠宰，代价都十分昂贵；其次，外源基因整合效率的严重低下致使成功培育一头转基因大家畜需要耗费数量众多的代孕母畜；再次，由于大家畜的生产周期都比较长，从获得原代转基因动物(founder)到形成具有生产能力的转基因动物群系的时间将使生产成本再次攀升。正是由于相对于生产转基因小鼠而言，生产转基因大家畜的效率更为低下，成本极为高昂，所以许多动物转基因研究仅限于小鼠，而不敢涉足大家畜。
与外源基因的随机整合相比，对动物基因组特定位点的定点修饰，包括基因的定点插入和定点敲除(knock-in或knock-out)，则有以下优势：1)对特定目标基因的定点修饰可更为精确地研究特定基因的表达调控；2)可避免外源基因的随机插入导致宿主内源功能基因的失活；3)可克服外源基因随机整合时整合位点的位置效应对外源基因表达的影响。利用胚胎干细胞技术进行基因的定点修饰在小鼠上已经广泛应用。虽然目前胚胎干细胞技术在小鼠上较为成熟，但在大家畜上胚胎干细胞还未能得到成功分离，以致还不能利用该技术对大家畜进行基因的定点修饰。
1997年，首例体细胞克隆绵羊“Dolly”诞生的报道引起了社会各界的强烈关注，同时也标志着生物领域的一种新的技术-哺乳动物体细胞核移植技术的成功建立。但是，在动物转基因研究领域，同年报道的首例利用体细胞核移植技术培育出的转基因绵羊“Polly”的诞生才是真正的里程碑，它掀开了体细胞核移植技术用于生产转基因大家畜的新篇章。随后的几年间，利用体细胞核移植技术培育的转基因牛、山羊乃至定点整合有外源基因的绵羊相继诞生。近2年来，科学家又相继培育出定点敲除单拷贝(单敲除)和双拷贝(双敲除)α-1，3半乳糖苷转移酶基因的克隆猪，将该技术的应用领域不断扩展。
体细胞核移植技术与体细胞基因转移技术相结合为生产转基因动物开辟了一条有效途径。该技术路线的最大特点主要体现在将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段。细胞基因转移是指通过电穿孔，脂质体转化，磷酸钙沉淀以及显微注射等方法，使外源目标基因整合进细胞基因组内，并利用特定的筛选标记，大量扩增、富集转基因细胞，从而获得转基因细胞株。直接利用这种已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体所培育出的克隆动物必定全部为转基因动物。通过体细胞核移植技术生产转基因家畜的优势非常明显：首先，该方法取材简便。卵母细胞可从屠宰场获取，动物体细胞来源更是丰富。其次，由于所产动物就大部分为转基因动物，从而大幅度地压缩了代孕母畜的数量，降低了生产成本；再次，如果转基因动物的各种表型性状得到确认后，可利用相同的供体细胞为核供体进行大规模地复制，从而缩短原代转基因动物的获得到形成具有生产能力的转基因动物群系的时间；更可贵的是，利用该技术还可以获得基因定点修饰的大家畜。在当前条件下，这是其它转基因方法所无法达到的。
尽管应用体细胞核移植技术生产转基因家畜的优势非常明显，并且在绵羊、牛、山羊和猪等家畜的转基因生产中取得了成功，但是该技术体系也存在局限因素。如前所述，该技术路线的优势主要体现在将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植，这样所培育出的克隆动物必定全部为转基因动物。可是相关研究表明，由于许多非转基因细胞得到周围转基因细胞所产生的抗药性物质的保护而存活，导致经过药物筛选所获得的具有抗药性细胞并非全部都整合有外源基因，利用这些抗药性细胞培育出的克隆动物也并非全部都是转基因动物。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种能有效提高非人类转基因动物生产效率的方法，该方法的应用将大大提高转基因动物的可靠性。
本发明所提供的提高非人类转基因动物生产效率的方法，是利用包括基因转移步骤在内的体细胞核移植技术进行生产转基因动物，所述基因转移是利用能够同时表达增强绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因、并且包括细胞巨化病毒IE增强子、人延伸因子1α启动子pEF321、EGFP-IRES-NEO以及SV40的加尾信号和多克隆位点的双标记选择载体实现的；所述基因转移的受体细胞是胎儿输卵管上皮细胞。
其中，新霉素抗性基因用于转基因细胞的筛选和富集；增强绿色荧光蛋白基因用于有效地筛选出转基因囊胚用于胚胎移植，以确保培育出的克隆动物全为转基因动物。
本方法中的转基因动物可为转基因家畜和转基因鼠等哺乳动物。其中，转基因家畜可为转基因兔、转基因牛、转基因羊、转基因猪等，尤其是转基因牛，意义重大。
上述双标记选择载体的核苷酸序列可为序列表中序列1。序列1中自5′端1位-24位碱基为多克隆位点。所述双标记选择载体可通过电穿孔法导入受体细胞。电穿孔法导入受体细胞的条件可以是电场强度为1-1.4kV/cm、脉冲时间为0.8-1.2ms优选为电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms。
本发明构建了一个能够同时用于转基因细胞富集和转基因囊胚筛选的双标记选择载体；优化了电穿孔介导的动物体细胞基因转化方法的条件；并借助绿色荧光蛋白这一标记基因，有效地筛选出转基因囊胚用于胚胎移植，确保培育出的克隆动物100％为转基因动物，从而建立一套能够有效提高体细胞克隆介导的转基因家畜的生产效率的方法，克服了体细胞克隆技术生产转基因动物中存在的所培育出的克隆动物并非全部都是转基因动物的缺点。
本发明建立了一套能够有效提高体细胞克隆介导的转基因动物特别是转基因家畜生产效率的方法，为转基因动物特别是转基因家畜在药用蛋白、营养蛋白和工业蛋白的生产，异种器官移植，牛乳的人乳化以及动物疾病模型的建立等方面的广泛应用提供了一个重要的技术基础，具有重要的理论意义和实际意义。
附图说明
图1为双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-NEO的物理图谱
图2为体细胞克隆介导的转基因牛的高效生产流程示意图
图3为脉冲时间为0.8ms时不同电场强度的转化效率曲线
图4为电场强度为1.2kV cm-1时不同脉冲时间的转化效率曲线
图5A为三头转基因克隆牛的PCR鉴定电泳图谱
图5B为三头转基因克隆牛的Southern Blot鉴定电泳图谱
图6A1为绿色荧光蛋白基因在牛转基因输卵管上皮细胞中表达情况的明视野照片
图6A2为绿色荧光蛋白基因在牛转基因输卵管上皮细胞中表达情况的暗视野照片
图6B1为绿色荧光蛋白基因在转基因克隆囊胚中表达情况的明视野照片
图6B2为绿色荧光蛋白基因在转基因克隆囊胚中表达情况的暗视野照片
图6C1为绿色荧光蛋白基因在转基因克隆牛的皮肤组织样中表达情况的明视野照片
图6C2为绿色荧光蛋白基因在转基因克隆牛的皮肤组织样中表达情况的暗视野照片
图6D1为绿色荧光蛋白基因在从乐娃皮肤组织块衍生出的成纤维细胞中表达情况的明视野照片
图6D2为绿色荧光蛋白基因在从乐娃皮肤组织块衍生出的成纤维细胞中表达情况的暗视野照片
具体实施方式
化学试剂与实验材料
细胞和胚胎的培养器皿购自Costar或Nunc公司；DMEM/F12，Trypsin购自Gibco公司，FBS购自Hyclone公司，其他药品除特殊注明外均购自Sigma公司
荷斯坦奶牛的胎儿取自北京市奶牛中心，黄牛卵巢来自北京周边地区屠宰场。
实施例1、体细胞克隆介导的转基因牛的高效生产
体细胞克隆介导的转基因牛的高效生产流程如图2所示，具体包括以下步骤：
1、双标记选择载体的构建和质粒DNA的制备
以EcoRI、XbaI双酶切质粒pCE321-FL(购自Clontech公司)和质粒pCMV-EGFP-IRES-NEO(购自Clontech公司)，将质粒pCMV-EGFP-IRES-NEO中细胞巨化病毒(CMV)启动子后的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和内部核糖体进入位点(IRES)携带的新霉素抗性基因(Neor)插入到质粒pCE321-FL中由细胞巨化病毒增强子(CMV-IE Enhancer)和人延伸因子1α启动子(pEF321)组成的5’调控区pCE321后，以pCE321替代CMV启动子。去除位于DNA片段EGFP-IRES-NEO间的NotI位点和BamHI位点形成中间质粒pCE-EGFP-IRES-NEO-dNdB。去除NotI位点是为在双标记选择载体旁端插入多克隆位点作准备，去除BamHI位点是为将双标记选择载体从质粒上完整切下。然后，在中间质粒pCE-EGFP-IRES-NEO-dNdB的基因构件CE-EGFP-IRES-NEOD的5’调控区端插入多克隆位点形成双标记选择载体pCE-EGFP-IRES-NEO，插入的多克隆位点为其他目标基因的插入做好了准备。经过酶切鉴定，表明构建好的双标记选择载体pCE-EGFP-IRES-NEO与试验设计完全符合。
本实施例构建的能够同时表达增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素抗性基因(Neor)两个标记基因的双标记选择载体pCE-EGFP-IRES-NEO的物理图谱如图1所示，图中MCS为多克隆位点；CMV-IE Enhancer为细胞巨化病毒增强子；pEF321为人延伸因子1α启动子；EGFP为增强绿色荧光蛋白基因；IVS为人工内含子；IRES为内部核糖体进入位点；Neor为新霉素抗性基因；polyA为SV40的加尾信号；Ampr为氨苄青霉素抗性基因；Ori为pBR322复制原点。其全序列如序列表中序列1所示，自5｀端1位-24位碱基为多克隆位点；自5｀端25位-385位碱基为细胞巨化病毒增强子序列；自5｀端386位-1575位碱基为人延伸因子1α启动子序列；自5｀端1624位-2343位碱基为增强绿色荧光蛋白基因序列；自5｀端2360位-2655位碱基为人工内含子序列；自5｀端2681位-3266位碱基为内部核糖体进入位点序列；自5｀端3292位-4095位碱基为新霉素抗性基因序列；自5｀端4176位-4310位碱基为SV40的加尾信号序列；自5｀端4325位-10217位碱基为pHC79粘粒载体序列；自5｀端4557位-5416位碱基为氨苄青霉素抗性基因序列；自5｀端5587位-5710位碱基为pBR322复制原点序列。
其中，新霉素抗性基因用于转基因细胞的筛选和富集；增强绿色荧光蛋白基因用于有效地筛选出转基因囊胚用于胚胎移植，以确保培育出的克隆动物全为转基因动物IRES(微小RNA病毒的内部核糖体进入位点)保证EGFP和Neor能同时表达。
质粒pCE-EGFP-IRES-NEO经SalI和AscI双酶切后获得线性双标记选择载体，经QIAGEN公司的QIAEX II试剂盒纯化回收，溶于灭菌超纯水中，-20℃保存。
2、牛胎儿输卵管上皮细胞系的建立
一头5月龄荷斯坦奶牛胎儿取自北京市奶牛中心，将整个子宫运回实验室，取出胎儿，以PBS和70％酒精清洗数遍后从胎儿输卵管取出组织样，剪碎成1mm3左右的小块，DMEM/F12清洗2遍后分批植块于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10％FBS至6mL，于37℃、5％ CO2培养箱培养6-7d，每2d换液1次，待细胞生长汇合后，以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化传代2-3次，分批以DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO冻存。经原代培养、传代培养、冷冻等体外培养操作，建立了牛胎儿输卵管上皮细胞系。
3、电穿孔介导的细胞基因转移方法的优化
以双标记选择载体质粒pCE-EGFP-IRES-NEO经SalI和AscI双酶切后的CE-EGFP-IRES-NEO为目标基因，通过比较不同电场强度(E)、不同脉冲时间(t)在细胞密度为5×106个细胞/mL、DNA浓度为20μg/mL的条件下对转化效率的影响，对电击介导的牛胎儿输卵管上皮细胞转基因方法的效率进行优化，同时验证双标记选择载体pCE-EGFP-IRES-NEO的有效性。通过牛胎儿输卵管上皮细胞对不同浓度G418毒性的敏感性试验确定G418的筛选浓度。
结果表明，200-800μg/mL G418对牛胎儿输卵管上皮细胞有明显毒害作用，在培养后5-21d内可杀死全部细胞。细胞对G418的毒性敏感性随G418浓度升高而增加，其中800μg/mL G418可在8d内杀死全部细胞，300μg/mL G418在15d内杀死全部细胞。
结果如图3和图4所示，表明在细胞密度为5×106个细胞/mL，DNA浓度为20μg/mL的条件下，当电场强度为1.2kV/cm，脉冲时间为1ms时可获得最佳转化效率。每105个细胞中可以获得约50个转基因细胞克隆，优于其他处理组。
4、不同类型的转基因细胞株的获得
收集对数期细胞，电击液HeBS(140mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、0.75mmol/LNa2HPO4、6mmol/L葡萄糖、25mmol/L Hepes)重悬细胞至5×106个/mL，在DNA浓度为20μg/mL、电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms的条件下进行电击，48h后加入800μg/mL G418筛选，每2-3d换液1次，筛选14d后以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化收集克隆点细胞并继续以300μg/mL G418筛选4-5代，待生长汇合并血清饥饿2-4d后用于体细胞核移植。
5、卵母细胞的成熟培养
从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/mL bFSH+0.01U/mL bLH+1μg/mL雌二醇)洗涤两遍，然后将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％ CO2培养箱中成熟培养18-20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体。
6、核移植程序和克隆胚胎的体外培养
将带有第一极体的卵母细胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/mL细胞松驰素B的操作液中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培养箱中备用。
将血清饥饿2-4d的转基因细胞用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化2-4min，选择直径为10-12μm的胎儿输卵管上皮细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入0.3M甘露醇(Mannitol)，0.15mmol/L Ca2+，0.15mmol/L Mg2+液中3-5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后观察融合率，挑选融合胚进行下一步激活处理。
将重构胚放入5μmol/L离子霉素(Ionomycin，Sigma)液中，4min后换到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CRlaa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培养箱中培养，分别在2d和7d后观察GFP的表达情况和胚胎的发育状况。
7、胚胎移植与妊娠检测
将形态优良的第7d的GFP克隆囊胚移入已同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并分别在移植后的第60d和第90d进行直肠检测以确定妊娠率。
共移植受体牛17头，移植后的第60d的直肠检测表明其中5头怀孕。有3头转基因克隆牛出生，产犊率为17.6％。
8、转基因克隆牛的分子生物学鉴定
采集转基因和非转基因克隆牛耳部组织样，按常规方法提取基因组DNA。
(1)PCR鉴定
用一对PCR引物(上游：5’-TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC-3’下游：5’-CTC AGG TAG TGG TTG TCG GG-3’)对转基因和非转基因克隆牛基因组DNA样品进行PCR扩增，以普通荷斯坦奶牛基因组DNA作为阴性对照，以双标记载体质粒pCE-EGFP-IRES-NEO作为阳性对照。PCR条件：94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 30sec，30循环；72℃ 7min。扩增产物全长为约384bp的DNA片段。结果如图5A所示，表明3头转基因克隆牛扩增出阳性带，而非转基因克隆牛和普通荷斯坦奶牛未能扩出阳性带。图5A中，M为1kb ladder，1为转基因克隆牛“乐娃”，2为转基因克隆牛“九妹”，3为转基因克隆牛“8C2”，4为非转基因克隆牛“浒娃”，5为普通荷斯坦奶牛，6为阳性质粒，7为灭菌蒸馏水。
(2)Southern鉴定
取大约10μg基因组DNA，用BglII内切酶消化，30V低压电泳，转膜后，进行Southern杂交，杂交所用探针为α-P32dCTP同位素标记的双标记载体质粒BglII酶切回收产物。以普通荷斯坦奶牛基因组DNA作为阴性对照，以双标记载体pCE-EGFP-IRES-NEO作为阳性对照，杂交阳性信号为1.6kb片段。
结果如图5B所示，表明3头转基因克隆牛基因组内整合有外源目标基因CE-EGFP-IRES-NEO，转基因阳性率为100％。Southern Blot结果和PCR结果完全一致。图5B中，1为转基因克隆牛“乐娃”，2为转基因克隆牛“九妹”，3为转基因克隆牛“8C2”，4为非转基因克隆牛“浒娃”，5为普通荷斯坦奶牛，6为1拷贝阳性质粒，7为5拷贝阳性质粒，8为10拷贝阳性质粒。
9、绿色荧光蛋白基因在供体细胞、转基因克隆胚胎和转基因克隆牛中表达的检测
将作为核供体的牛转基因输卵管上皮细胞在转化后1天后加入G418，经G418筛选14d后均有阳性细胞克隆点出现，并于荧光显微镜的蓝光下观察，以检测GFP的表达情况。结果如图6A1和图6A2所示，表明输卵管上皮细胞被转化后发现绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
在克隆胚胎体外发育到囊胚阶段，取部分囊胚于荧光显微镜的蓝光下观察，以检测GFP的表达情况。结果如图6B1和图6B2所示，表明转基因克隆囊胚表达绿色荧光蛋白。
将转基因克隆牛的耳部皮肤组织剪碎后置于蓝光下激发，结果如图6C1和图6C2所示，表明在组织中有绿色荧光蛋白的表达。
从转基因克隆牛“乐娃”耳部下缘获取组织样，剪碎成1mm3左右的小块，DMEM/F12清洗2遍后分批植块于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10％FBS至6M1，于37℃、5％ CO2培养箱培养6-7天，每2天换液1次，待细胞从皮肤组织分离后，观察GFP在细胞中的表达情况。结果如图6D1和图6D2所示，表明细胞中有绿色荧光蛋白的表达。
序列表
<160>1
<210>1
<211>10237
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gcggccgcga tattaagctt ccgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 60
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 120
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 180
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 240
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattggcgtc 300
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 360
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattaccc ggcatgcgtg aggctccggt 420
gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc 480
ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 540
tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 600
gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt 660
tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg 720
cccctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag 780
ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg 840
gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga 900
taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga 960
tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg 1020
cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg 1080
gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct 1140
cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc 1200
gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg 1260
gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc 1320
agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt 1380
ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt 1440
tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc 1500
cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt 1560
tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtgaaaacta cgaattcggt accggtcgcc 1620
accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 1680
gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 1740
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 1800
accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 1860
aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 1920
ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 1980
ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 2040
cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 2100
aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 2160
gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 2220
cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 2280
gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 2340
taaagcgcga ctctagctgg aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag 2400
tactccctct caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag 2460
gaggatttga tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg 2520
tcagaaaaga caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga gatctggcca 2580
tacacttgag tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg 2640
tccaactgca ggtcgagcat gcatctaggg cggccaattc cgcccctctc cctccccccc 2700
ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtg 2760
attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 2820
cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 2880
tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 2940
cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 3000
tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 3060
tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 3120
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gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 3660
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 3720
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 3780
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 3840
ggcgatgatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 3900
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 3960
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 4020
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 4080
gacgagttct tctgagggga tcaattctct agagaaaaaa cctcccacac ctccccctga 4140
acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg 4200
gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 4260
ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc tggcctacta 4320
ggccggatcc ggcgcgccac ggccgcaatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc 4380
tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 4440
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 4500
cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 4560
gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 4620
ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 4680
tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 4740
aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg 4800
ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 4860
agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 4920
gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 4980
gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 5040
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tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 5460
aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 5520
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ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 5820
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ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 5940
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cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 6060
gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 6120
ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 6180
cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 6240
tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 6300
cgctcgccgc agccgaacga ccgagagcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg 6360
cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac 6420
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tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca 6660
gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt 6720
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tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga 6840
taccgatgaa acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt 6900
tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa 6960
tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc 7020
agcagcatcc tgcgatgcag atctattaat acgatacctg cgtcataatt gattatttga 7080
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ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtca acaaaaagca 7380
gctggctgac attttcggtg cgagtatccg taccattcag aactggcagg aacagggaat 7440
gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat 7500
aaaatggtat gccgaaaggg atgctgaaat tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga 7560
agaactgcgg caggccagcg aggcagatcc ccagccagga actattgagt acgaacgcca 7620
tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca ggaactgaag aatgccagag actccgctga 7680
agtggtggta accgcattct gtactttcgt gctgtcgcgg atcgcaggtg aaattgccag 7740
tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca gcggcgtttt ccggaactgg aaaaccgaca 7800
tgttgatttc ctgaaacggg atatcatcaa agccatgaac aaagcagccg cgctggatga 7860
actgataccg gggttgctga gtgaatatat cgaacagtca ggataacagg ctgcggcatt 7920
ttgtccgcgc cgggcttcgc tcactgttca ggccggagcc acagaccgcc gttgaatggg 7980
cggatgctaa ttactatctc ccgaaagaat ccgcatacca ggaagggcgc tgggaaacac 8040
tgccctttca gcgggccatc atgaatgcga tgggcagcga ctacatccgt gaggtgaatg 8100
tggtgaagtc tgcccgtgtc ggttattcca aaatgctgct gggtgtttat gcctacttta 8160
tagagcataa gcagcgcaac acccttatct ggttgccgac ggatggtgat gccgagaact 8220
ttatgaaaac ccacgttgag ccgactattc gtgatattcc gtcgctgctg gcgctggccc 8280
cgtggtatgg caaaaagcac cgggttaaca cgctcaccat gaagcgtttc actaatgggc 8340
gtggcttctg gtgcctgggc ggtaaagcgg caaaaaacta ccgtgaaaag tcggtggatg 8400
tggcgggtta tgatgaactt gctgcttttg atgatgatat tgaacaggaa ggctctccga 8460
cgttcctggg tgacaagcgt attgaaggct cggtctggcc aaagtccatc cgtggctcca 8520
cgccaaaagt gagaggcacc tgtcagattg agcgtgcagc cagtgaatcc ccgcatttta 8580
tgcgttttca tgttgcctgc ccgcattgcg gggaggagca gtatcttaaa tttggcgaca 8640
aagagacgcc gtttggcctc aaatggacgc cggatgaccc ctccagcgtg ttttatctct 8700
gcgagcataa tgcatgcgtc atccgccagc aggagctgga ctttactgat gcccgttaga 8760
tctcggcgta tatcaaatcg cgatcaacaa ggccattcat gcaggccgaa agattttttt 8820
aactataaac gctgatggaa gcgtttatgc ggaagaggta aagcccttcc cgagtaacaa 8880
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ttaaaccaca cctatggtgt atgcatttat ttgcatacat tcaatcaatt gttatctaag 9000
gaaatactta catatggttc gtgcaaacaa acgcaacgag gctctacgaa tcgagagtgc 9060
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taagtcgcag atcagcaggt ggaagaggga ctggattcca aagttctcaa tgctgcttgc 9180
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gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtcatta tgacaaatac agcaaaaata 9360
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gtgacgatca gcggtccagt gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag cgatccttga 9780
agctgtccct gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa cgcgggcatc 9840
ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata atggggaagg ccatccagcc tcgcgtcgcg 9900
aacgccagca agacgtagcc cagcgcgtcg gccgccatgc cggcgataat ggcctgcttc 9960
tcgccgaaac gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt gagcgagggc gtgcaagatt 10020
ccgaataccg caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc agcgaaagcg gtcctcgccg 10080
aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt gcatgataaa gaagacagtc 10140
ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag 10200
gctctcaagg gcatcggtcg acccagcatt atgctgg 10237
Claims (7)
1、一种提高非人类转基因动物生产效率的方法，是利用包括基因转移步骤在内的体细胞核移植技术进行生产转基因动物，其特征在于：所述基因转移是利用能够同时表达增强绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因、并且包括细胞巨化病毒IE增强子、人延伸因子1α启动子pEF321、EGFP-IRES-NEO以及SV40的加尾信号和多克隆位点的双标记选择载体实现的；所述基因转移的受体细胞是胎儿输卵管上皮细胞。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转基因动物为转基因家畜。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述转基因家畜为转基因牛、转基因羊、转基因猪或转基因兔。
4、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述双标记选择载体的核苷酸序列是序列表中序列1。
5、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述双标记选择载体通过电穿孔法导入受体细胞。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述电穿孔法导入受体细胞的条件是电场强度为1-1.4kV/cm、脉冲时间为0.8-1.2ms。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述电穿孔法导入受体细胞的条件是电场强度为1.2kV/cm、脉冲时间为1ms。
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