CN105899667A

CN105899667A - 用于产生遗传修饰的动物的组合物和方法

Info

Publication number: CN105899667A
Application number: CN201480072361.5A
Authority: CN
Inventors: 弗兰克·科恩特根
Original assignee: Ozgene Holdings Pty Ltd
Current assignee: Ozgene Holdings Pty Ltd
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2016-08-24
Also published as: AU2020202321A1; US20220201992A1; CA2928744C; AU2014346342C1; KR102444117B1; CA2928744A1; HUE055766T2; PT3066204T; AU2014346342B2; JP2020202857A; NZ758970A; IL245306A0; EP3066204A4; DK3066204T3; US20160360736A1; IL307495A; WO2015066768A1; US11937586B2; JP2016539660A; JP6845013B2

Abstract

公开了用于改进遗传修饰的种系传递的方法、组合物和非人类动物及其部分。更特别地，本发明公开了用于产生具有破坏的或可破坏的育性基因的非人类胚胎的方法和组合物，所述非人类胚胎可被用作用于使供体多能细胞包括遗传修饰的供体多能细胞发育成生殖细胞和配子的宿主。还公开了用于从此类胚胎产生具有破坏的育性基因的嵌合非人类动物和用于使用包含缺乏破坏的育性基因的同类非人类动物繁殖所述嵌合非人类动物以产生具有源自所述供体多能细胞的基本上所有的配子和/或生殖细胞的非人类动物的方法和组合物。本发明还公开了用于在主题方法中使用的非人类配子、生殖细胞、胚胎和动物。

Description

用于产生遗传修饰的动物的组合物和方法

相关申请

本申请要求2013年11月7日提交的标题为“Compositions and Methods forProducing Genetically Modified Animals”的澳大利亚临时申请号2013904307和2014年6月6日提交的标题为“Compositions and Methods for Producing GeneticallyModified Animals”的澳大利亚临时申请号2014902162的优先权，其每个的内容通过引用以其全文并入本文。

发明领域

本发明一般性地涉及用于产生具有破坏的或可破坏的育性基因的非人类胚胎的方法和组合物，所述非人类胚胎可被用作用于使供体多能细胞发育为生殖细胞和配子的宿主，所述供体多能细胞包括遗传修饰的供体多能细胞。本发明还涉及用于从此类胚胎产生具有破坏的育性基因的嵌合非人类动物和用于使用同类(cognate)非人类动物繁殖所述嵌合非人类动物以产生具有源自供体多能细胞的基本上所有的配子和/或生殖细胞的非人类动物的方法和组合物，所述同类非人类动物包含缺乏破坏的育性基因。

发明背景

小鼠胚胎干(ES)细胞是多能的，并且能够在囊胚注射后促成小鼠的所有组织。其还能够相对简便地被遗传操作，并且已经被用于在将靶突变引入基因组中之后产生遗传修饰的小鼠(参见例如Doetschman T等,1987.Nature 330:576-578)。

当被引入到囊胚胚胎环境中之后，具有遗传修饰的小鼠‘供体’ES细胞整合到宿主囊胚的内细胞团中并分化成体细胞谱系和生殖细胞(germ cell)谱系，最终产生被称为嵌合体的嵌合小鼠。嵌合性的差异是由于供体ES细胞对囊胚的贡献的不同量。供体ES细胞在囊胚中发挥作用越好，越多的细胞源自供体ES细胞，这继而增强遗传修饰传递到种系(germline)中(种系传递(germ line transmission))。

但是，由于知之甚少的若干复杂因素，在嵌合体中由供体ES细胞促成的种系是不可预知的并且从0％至100％变化，所述若干复杂因素包括：(i)需要供体ES细胞在正确的时间在正确的位置用于整合到内细胞团(inner cell mass，ICM)发育过程中，(ii)供体ES细胞变成原生殖细胞(primordial germ cell)并随后发育成功能性配子的固有(遗传和表观遗传)能力，和(iii)在常规嵌合体中，在胚胎发育期间宿主和供体干细胞之间竞争发育微环境以最终变成配子。

因此，需要改进遗传修饰的多能细胞诸如ES细胞的种系传递和加快从嵌合体产生多能细胞衍生的动物。

发明概述

本发明部分起源于以下结论(determination)：通过破坏其中被引入供体多能细胞的植入前(pre-implantation)非人类胚胎中的育性基因，能够显著增强包含内源性育性基因的供体多能细胞(例如，包含遗传修饰的供体多能细胞)的种系传递。在合适的替代(surrogate)或代孕(foster)非人类动物中，胚胎的植入和孕育产生后代，包括：包含内源性生殖细胞或配子的嵌合非人类动物，所述内源性生殖细胞或配子包含破坏的育性基因；以及包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的嵌合非人类动物，所述源自供体多能细胞的生殖细胞或配子不包含育性基因中的破坏。当与包含未破坏的育性基因的同类非人类动物交配时，包含含有破坏的育性基因的内源性生殖细胞或配子的嵌合非人类动物将具有受损的或抑制的能育性，并且包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的那些嵌合非人类动物将具有正常的或者未受损的能育性，从而增强了包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的第一窝后代的产生。

因此，在一个方面，本发明提供了一种植入前非人类宿主胚胎，所述植入前非人类宿主胚胎包含在其种系中的破坏的育性基因或基本上由其组成。被破坏的育性基因可以在任何染色体上，并且在一些实施方案中，育性基因位于性染色体(例如，X或Y染色体)上。在特定的实施方案中，育性基因位于X染色体上。育性基因的破坏可以是杂合的或者纯合的，并且在特定的实施方案中，育性基因的两个等位基因均被破坏。合适地，育性基因的破坏抑制雄性能育性，并且在这种类型的示例性实例中，破坏抑制精子功能或精子发生。在特定的实施方案中，育性基因是GILZ。

在相关方面，本发明提供了一种如上文广泛描述的植入前非人类宿主胚胎，所述植入前非人类宿主胚胎还包含供体多能细胞，所述供体多能细胞包含缺乏对其的破坏的育性基因。在一些实施方案中，供体多能细胞是干细胞(例如，选自胚胎干(ES)细胞、上胚层干细胞、胚胎生殖细胞、诱导性多能干细胞、遗传修饰的ES细胞、遗传修饰的上胚层干细胞、遗传修饰的胚胎生殖(EG)细胞、遗传修饰的诱导性多能干(iPS)细胞或者这些中的任何两个或更多个的组合)。合适地，多能细胞包含遗传修饰。在特定的实施方案中，供体多能细胞是雄性多能细胞。

本发明的另一个方面提供了一种包含如上文和本文其他位置广泛限定的破坏的育性基因和供体多能细胞的非人类宿主胚胎，所述供体多能细胞包含缺乏对其的破坏的育性基因。在一些实施方案中，供体多能细胞是适当地包含遗传修饰的干细胞(例如，ES细胞)。适当地，供体多能细胞是雄性多能细胞。

在本发明的又另一方面，提供了用于产生非人类动物的方法。这些方法一般地包括以下或者基本上由以下组成：将如上文和本文其他位置广泛限定的植入前非人类宿主胚胎引入到假孕非人类动物中，并在适于胚胎的发育的条件下孕育植入前非人类宿主胚胎，从而产生非人类动物。

在相关方面，本发明提供了一种由这些方法得到的非人类动物。

本发明的仍然另一个方面提供了一种替代或代孕非人类动物，所述替代或代孕非人类动物包含如上文和本文其他位置广泛限定的非人类宿主胚胎或者基本上由其组成。

在本发明的另一个方面，提供了用于产生嵌合非人类动物的方法。这些方法一般地包括以下或基本上由以下组成：将如上文和本文其他位置广泛限定的植入前非人类宿主胚胎引入到假孕非人类动物中，所述植入前非人类宿主胚胎包含供体多能细胞，所述供体多能细胞包含缺乏对其的破坏的育性基因；并且在适合于胚胎的发育的条件下孕育植入前非人类宿主胚胎，从而产生嵌合非人类动物。

在相关方面，本发明提供了一种由这些方法获得的嵌合非人类动物。

本发明的又另一个方面提供了用于产生具有破坏的育性基因的非人类宿主胚胎的方法。这些方法一般地包括以下或者基本上由以下组成：使1)携带可破坏的育性基因的第一动物品系；与2)携带不育性激活转基因(包括破坏所述可破坏的育性基因的基因)的第二动物品系杂交，从而产生包含具有破坏的育性基因的生殖细胞的转基因非人类宿主胚胎。在一些实施方案中，使所述第一动物品系的雌性成员与所述第二动物品系的雄性成员杂交。如本文使用的，所述第一动物品系和所述第二动物品系的各自的成员是非人类动物的繁殖对(breeding pair)的繁殖配偶(breeding partner)。

在仍然另一个方面，本发明提供了一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的育性转基因，所述可破坏的育性转基因包括如上文和本文其他位置广泛描述的可破坏的育性基因，所述可破坏的育性基因通过育性基因破坏物(disruptor)分子可破坏，其中所述可破坏的育性基因与启动子可操作连接，和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含编码育性基因破坏物分子的核苷酸序列(“破坏物核苷酸序列”)，其中所述破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接。在一些实施方案中，育性基因破坏物分子是重组酶并且可破坏的育性基因与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在所述重组酶的存在下介导可破坏的育性基因的破坏。在其它实施方案中，育性基因破坏物分子是抑制性RNA分子，所述抑制性RNA分子适当地通过反义抑制或RNA干扰抑制可破坏的育性基因的表达。在仍然其它实施方案中，育性基因破坏物分子是抗体，所述抗体与可破坏的育性基因的多肽产物免疫相互作用。

在一些实施方案中，破坏物核苷酸序列是条件性地可表达的，并且在这种类型的示例性实例中，破坏物转基因包含与破坏物核苷酸序列可操作连接的表达调节元件(expression-modulating element)，其中所述元件条件性地抑制破坏物核苷酸序列的表达。例如，在第一条件下表达调节元件可以抑制破坏物核苷酸序列的转录，并且在第二条件下表达调节元件的破坏可以允许或者增强破坏物核苷酸序列的转录。在一些实施方案中，表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列抑制破坏物核苷酸序列的表达并且与重组酶识别位点可操作连接，其中所述重组酶识别位点在重组酶的存在下介导抑制子核苷酸序列的破坏。在这种类型的示例性实例中，第一繁殖配偶包含刺激或增强破坏物核苷酸序列的表达的激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的所述重组酶的编码序列。

在一些实施方案中，第一繁殖配偶是雌性，并且第二繁殖配偶是雄性。

适当地，第一繁殖配偶的激活子转基因是纯合的和/或第二繁殖配偶的破坏物转基因是纯合的。

在相关方面，本发明提供了一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的转基因，所述可破坏的转基因包括可破坏的育性基因，所述可破坏的育性基因与启动子且与在重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在重组酶的存在下介导所述育性基因的破坏；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含编码育性基因破坏物分子的破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接，其中所述育性基因破坏物分子包括重组酶。在一些实施方案中，第一繁殖配偶是雌性并且第二繁殖配偶是雄性。

在一些实施方案中，第一繁殖配偶的可破坏的转基因是纯合的和/或第二繁殖配偶的破坏物转基因是纯合的。

在一些实施方案中，非人类动物的繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含第一可破坏的转基因和第一破坏物转基因，所述第一可破坏的转基因包括与启动子且与第一重组酶识别位点可操作连接的可破坏的育性基因，所述第一重组酶识别位点在第一重组酶的存在下介导所述可破坏的育性基因的破坏，所述第一破坏物转基因包含与启动子可操作连接的第二重组酶的编码序列，其中所述第二重组酶特异性地识别第二重组酶识别位点，和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含第二可破坏的转基因和第二破坏物转基因，所述第二可破坏的转基因包括与启动子且与第二重组酶识别位点可操作连接的可破坏的育性基因，所述第二重组酶识别位点在所述第二重组酶的存在下介导所述可破坏的育性基因的破坏，所述第二破坏物转基因包含与启动子可操作连接的所述第一重组酶的编码序列，其中所述第一重组酶特异性地识别所述第一重组酶识别位点。适当地，所述第一繁殖配偶的所述第一可破坏的转基因和所述第一破坏物转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述第二可破坏的转基因和所述第二破坏物转基因是纯合的。

在另一个相关的方面，本发明提供了一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的育性基因；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接，并且所述破坏物核苷酸序列编码抑制所述可破坏的育性基因的表达的抑制性RNA分子(例如，反义RNA、siRNA、shRNA等)。在一些实施方案中，所述破坏物核苷酸序列是条件性地可表达的并且在这种类型的示例性实例中，破坏物转基因包含与所述破坏物核苷酸序列可操作连接的表达调节元件，其中所述元件条件性地抑制所述破坏物核苷酸序列的表达。例如，在第一条件下所述表达调节元件可以抑制所述破坏物核苷酸序列的转录，并且在第二条件下所述表达调节元件的破坏可以允许或增强所述破坏物核苷酸序列的转录。在一些实施方案中，所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列抑制所述破坏物核苷酸序列的表达并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，其中所述重组酶识别位点在重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏。在这种类型的示例性实例中，所述第二繁殖配偶包含激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列。所述第二繁殖配偶的可破坏的育性基因适当地是野生型基因。在一些实施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述第二繁殖配偶是雄性。

因此，在一些实施方案中，所述非人类动物的繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含与启动子可操作连接的可破坏的育性基因和激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列编码抑制所述可破坏的育性基因的表达的抑制性RNA分子(例如，反义RNA、siRNA、shRNA等)，其中所述破坏物核苷酸序列与启动子并且与表达调节元件可操作连接，所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列在所述重组酶的不存在下抑制所述破坏物核苷酸序列的表达并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在所述重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏。适当地，所述第一繁殖配偶的所述激活子转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破坏物转基因是纯合的。在一些实施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖配偶是雄性。

在又另一个相关的方面，本发明提供了一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的育性基因；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列编码与所述可破坏的育性基因的多肽产物免疫相互作用的抗体，并且所述破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接。在一些实施方案中，所述破坏物核苷酸序列是条件性地可表达的并且在这种类型的示例性实例中，所述破坏物转基因包含与所述破坏物核苷酸序列可操作连接的表达调节元件，其中所述元件条件性地抑制所述破坏物核苷酸序列的表达。例如，在第一条件下所述表达调节元件可以抑制所述破坏物核苷酸序列的转录，并且在第二条件下所述表达调节元件的破坏可以允许或增强所述破坏物核苷酸序列的转录。在一些实施方案中，所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列抑制所述破坏物核苷酸序列的表达，并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，其中所述重组酶识别位点在重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏。在这种类型的示例性实例中，所述第一繁殖配偶包含激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的所述重组酶的编码序列。所述第二繁殖配偶的可破坏的育性基因适当地是野生型基因。在一些实施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述第二繁殖配偶是雄性。

因此，在一些实施方案中，所述非人类动物的繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含与启动子可操作连接的可破坏的育性基因和激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列编码与所述育性基因的多肽产物免疫相互作用的抗体，其中所述破坏物核苷酸序列与启动子并且与表达调节元件可操作连接，所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列在重组酶的不存在下抑制所述破坏物核苷酸序列的表达，并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在所述重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏。适当地，所述第一繁殖配偶的所述激活子转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破坏物转基因是纯合的。在一些实施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述第二繁殖配偶是雄性。

在另一个方面，本发明提供了用于产生包含破坏的育性基因的非人类宿主胚胎的方法。这些方法一般地包括以下或者基本上由以下组成：(a)使如上文和本文其他位置广泛描述的非人类动物的繁殖对的第一繁殖配偶与所述繁殖对的第二繁殖配偶交配；和(b)从所述繁殖对的雌性成员产生植入前非人类胚胎，所述胚胎包含在其种系中的所述育性基因的破坏。在一些实施方案中，所述方法还包括在允许所述植入前非人类宿主胚胎的形成的条件下培养非人类宿主胚胎。在一些实施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述第二繁殖配偶是雄性。在一些实施方案中，所述方法还包括将如例如上文和本文其他位置所描述的供体多能细胞引入到所述植入前非人类胚胎中。适当地，所述多能细胞包含遗传修饰。在特定的实施方案中，所述多能细胞是雄性多能细胞。

在相关方面，本发明提供了一种从以上方法得到的非人类宿主胚胎。

在又另一个方面，本发明提供了产生嵌合非人类动物的方法。这些方法一般地包括以下或基本上由以下组成：(1)移植植入前非人类胚胎，所述植入前非人类胚胎包含在其种系中的如例如上文和本文其他位置所描述的育性基因的破坏，并且所述植入前非人类胚胎还包含如例如上文和本文其他位置所描述的异源多能细胞；和(2)在适于所述胚胎发育的条件下孕育(1)的非人类宿主胚胎，从而产生具有在其种系中的破坏的育性基因和遗传修饰的嵌合非人类动物。适当地，所述嵌合非人类动物是雄性嵌合非人类动物。

在相关方面，本发明提供了一种嵌合非人类动物，所述嵌合非人类动物从这些方法得到。

本发明的仍然另一个方面提供了产生在其基因组中包含遗传修饰的非人类动物的方法。这些方法一般地包括以下或者基本上由以下组成：(1)移植植入前非人类胚胎，所述植入前非人类胚胎包含在其种系中的如例如上文和本文其他位置所描述的育性基因的破坏，并且所述植入前非人类胚胎还包含如例如上文和本文其他位置所描述的异源多能细胞；和(2)在适于所述胚胎发育的条件下孕育(1)的非人类宿主胚胎，从而产生包括嵌合非人类动物的一窝幼崽，所述嵌合非人类动物具有在其种系中的破坏的育性基因和遗传修饰；(3)用在其基因组中包含缺乏对其的破坏的育性基因的同类雌性非人类动物繁殖来自该窝幼崽的雄性嵌合非人类动物，以当所述雄性嵌合非人类动物包含源自所述异源多能细胞的生殖细胞或配子时产生包含所述遗传修饰的非人类动物。

在相关方面，本发明提供了一种包含遗传修饰的非人类动物，所述非人类动物从以上的方法得到。

在另一个方面，本发明提供了一种非人类动物(例如，替代或代孕非人类动物)，所述非人类动物具有移植在其中的如上文和本文其他位置广泛描述的植入前非人类宿主胚胎。

本发明的另一个方面提供了一种嵌合非人类动物，所述嵌合非人类动物源自如上文和本文其他位置广泛描述的植入前非人类宿主胚胎。

附图简述

图1是Tsc22d3条件性敲除靶向载体的示意图。蓝框：外显子；neo：用于在ES细胞中选择的新霉素盒；FRT：用于flp重组酶介导的neo去除的识别序列；loxP：用于cre重组酶介导的外显子缺失的识别序列；amp：氨苄青霉素抗性基因；ori：复制起点。

图2是示出靶ROSA26等位基因变体A的示意图。Ubic：人泛素启动子；neo：用于在ES细胞中选择的新霉素盒；cre：Cre重组酶；终止(STOP)：转录/翻译‘终止’元件；loxP：用于Cre重组酶介导的终止缺失的识别序列；pA：聚腺苷酸化信号；破坏物元件：破坏育性基因的表达或者其蛋白质产物的功能的任何元件(例如，shRNA、抗体)。

图3是示出靶ROSA26等位基因变体B的示意图。Ubic：人泛素启动子；neo：用于在ES细胞中选择的新霉素盒；cre：Cre重组酶；终止：转录/翻译‘终止’元件；loxP：用于Cre重组酶介导的终止缺失的识别序列；pA：聚腺苷酸化信号；破坏物元件：破坏育性基因的表达或者其蛋白质产物的功能的任何元件(例如，shRNA、抗体)。

图4是示出后代中的靶ROSA26等位基因变体A的示意图。Ubic：人泛素启动子；neo：用于在ES细胞中选择的新霉素盒；cre：Cre重组酶；终止：转录/翻译‘终止’元件；loxP：用于Cre重组酶介导的终止缺失的识别序列；pA：聚腺苷酸化信号；破坏物元件：破坏育性基因的表达或者其蛋白质产物的功能的任何元件(例如，shRNA、抗体)。

图5是显示通过本发明的方法的一个实施方案产生的第一窝后代的非限制性实例的照片展示。该图中显示的幼畜是两种嵌合体的所有幼崽。嵌合体是基于Tsc22d3conKO/conKO囊胚产生的。所有幼畜显示出白色毛色，这是源自靶ES细胞的动物所预期的。

图6是显示用于基因分型的DNA印迹分析的代表性实例的照片表示。将活组织检查样品裂解并用BamHI消化。wt等位基因的预期大小是17.5kb，并且靶等位基因的预期大小是9.7kb。A045、A046、A049、A055、A077、A078、A065、A066、A056、A057、A058、A059、A064&A074被确定为wt/靶；A047、A048、A050、A076、A080、A067、A068、A069、A060、A070&A075被确定为wt/wt并且A054、A079&A070不能被确定。

发明详述

1.定义

除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管任何类似或等同于本文记载的那些方法和材料的方法和材料能够被用于本发明的实践或测试中，描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语在下文中被定义。

冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中被用来指一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法客体。举例来说，“育性基因”意指单个育性基因或多于一个育性基因。

如本文使用的，“和/或”是指并包括列出的相关项的一个或更多个的任何和所有可能的组合，以及当以选择性(或)解读时，没有组合。

术语“抗体”被用来指任何具有抗原结合区域并包含抗体片段的抗体样分子，所述抗体片段诸如Fab’、Fab、F(ab’)₂、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。

术语“反义”是指相对于DNA双链体的有义链中的脱氧核苷酸残基的序列，其核苷酸残基的序列为相反的5’至3’方向的核苷酸序列。DNA双链体的“有义链”是指在DNA双链体中被在其天然状态下的细胞转录成“有义mRNA”的链。因此，“反义”序列是具有与DNA双链体中的非编码链相同的序列的序列。术语“反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补并且通过干扰靶基因的初级转录物或mRNA的加工、转运和/或翻译阻断靶基因的表达的RNA转录物。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分，换言之，在5’非编码序列、3’非编码序列、内含子或编码序列。另外，如本文使用的，反义RNA可含有增加反义RNA阻断基因表达的效力的核酶序列的区域。“核酶”是指有催化作用的RNA并且包括序列特异性的内切核糖核酸酶。“反义抑制”是指反义RNA转录物的产生能够阻止靶蛋白的表达。

如本文使用的术语“繁殖”意指雄性配子和雌性配子的结合以使得受精发生。此类结合可以通过交配(mating)(交配(copulation))或者通过体外或体内人工方法引起。此类人工方法包括，但不限于，人工授精、外科手术辅助的人工授精、体外受精、细胞质内精子注射、透明带钻孔(zona drilling)、受精的卵母细胞的体外培养、卵巢转移和卵巢分裂(splitting)。

“细胞”、“宿主细胞”、“转化的宿主细胞”等是不仅指特定的受试细胞还指此类细胞的后代或潜在后代的术语。因为某些修饰由于突变或环境影响可在随后的世代中发生，所以此类后代实际上可以与亲本细胞不相同，但是仍然包括在如本文使用的术语的范围内。

如本文使用的，术语“顺式作用序列”或“顺式调控区域”或类似术语应被用来意指源自可表达的基因序列的任何核苷酸序列，其中基因序列的表达至少部分地被核苷酸序列调控。本领域技术人员将意识到，顺式调控区域可以能够激活、沉默、增强、抑制或在其它方面改变任何结构基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。

“编码序列”，编码区等意指促成基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。相对地，术语“非编码序列”和“非编码区”是指不促成基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。

术语“构建体”在本文中被用来指包含至少两个核酸序列或区段的基因或核酸序列或区段，所述至少两个核酸序列或区段来自在天然条件下不同时具有那些序列或区段的物种，或者所述序列或区段以在未转化的宿主的天然基因组或核小体中通常不存在的方式被定位或连接。

如本文使用的，“互补的”多核苷酸是能够经由根据标准沃森-克里克互补规则碱基配对而杂交的那些多核苷酸。具体地，嘌呤将与嘧啶碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对的结合(G:C)和在DNA的情况中腺嘌呤与胸腺嘧啶配对的结合(A:T)或者在RNA的情况中腺嘌呤与尿嘧啶配对的结合(A:U)。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。应理解两个多核苷酸可以彼此杂交，即使它们不完全或全部彼此互补，条件是每个多核苷酸具有与另一个基本上互补的至少一个区域。如本文使用的术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当在单链分子之间沿着分子的整个长度或者沿着单链分子的一部分或区域存在完全互补性时，两个单链分子之间的互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。如本文使用的，术语“基本上互补的”或“部分互补的”意指两个核酸序列至少在其核苷酸的约50％、60％、70％、80％或90％处互补。在一些实施方案中，两个核酸序列可以在其核苷酸的约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多处互补。术语“基本上互补的”和“部分互补的”还可以意指两个核酸序列能够在高严格度条件下杂交并且此类条件是本领域公知的。

贯穿本说明书，除非上下文另有需要，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”应被理解为暗示包括陈述的步骤或元素或者步骤或元素的组，但是不排除任何其它步骤或元素或者步骤或元素的组。因此，术语“包含(comprising)”等的使用表明所列出的元素是必需的或强制性的，但是其它元素是任可选的并且可以存在或不存在。“由……组成(consisting of)”意指包括，并且限于，在短语“由……组成”之后的任何元素。因此，短语“由……组成”表明所列出的元素是必需的或强制性的，并且没有其它元素可以存在。通过“基本上由……组成”意指包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或者有助于本公开内容中详细说明的所列出的元素的活性或作用的其它元素。因此，短语“基本上由……组成”表明所列出的元素是必需的或者强制性的，但是其它元素是任选的并且根据它们是否影响所列出的元素的活性或作用可以存在或不存在。

“组成型启动子”是指指导可操作连接的可转录序列在生物体的许多或所有组织中表达的启动子。

术语“构建体”是指包含来自不同来源的一个或更多个分离的核酸序列的重组遗传分子。如本文使用的，术语“表达构建体”、“重组构建体”或“重组DNA构建体”是指源自任何来源、能够基因组整合或自主复制、包含其中一个或更多个核酸分子已经可操作连接的核酸分子的任何重组核酸分子，诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子。“表达构建体”一般至少包含与感兴趣的核苷酸序列可操作连接的控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供与待表达的核苷酸序列可操作连接的植物启动子，用于在植物、植物部分、植物器官和/或植物细胞中表达。将可转录多核苷酸分子转录为功能性mRNA分子，所述功能性mRNA分子被翻译并且因此被表达为蛋白质产物，以如此方式将构建体引入到细胞中的方法是已知的。还可以将构建体制备为能够表达抑制性RNA分子，例如以抑制感兴趣的特异性RNA分子的翻译。对于本发明的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法本领域技术人员所熟知的，参见例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3.sup.rd版卷1、2和3，J.F.Sambrook、D.W.Russell和N.Irwin,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000。

“控制元件”或“控制序列”意指影响可操作连接的核苷酸序列的表达(例如，转录、RNA加工或稳定性或者相关编码序列的翻译)的核酸序列(例如，DNA)。调控序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化信号序列。控制元件或控制序列可以位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)。它们包括天然序列和合成序列以及可以为合成序列和天然序列的组合的序列。例如，适用于在原核细胞中表达可操作连接的核苷酸序列的控制序列包括，例如，启动子和任选的顺式作用序列诸如操纵子序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括转录控制序列诸如：启动子；多腺苷酸化信号；转录增强子；翻译控制序列，诸如翻译增强子和内部核糖体结合位点(IRES)；调节RNA稳定性的核酸序列；以及使由转录的多核苷酸编码的产物靶向细胞内的细胞内区室或细胞外环境的靶向序列。代表性控制序列包括天然序列和合成序列以及可以为合成序列和天然序列的组合的序列。

“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意指表现出与参考核酸序列的基本的序列同一性(例如，与参考核酸序列的全部或一部分的至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高达100％的序列同一性)的核酸序列或者表现出与参考氨基酸序列的基本的序列相似性或同一性(例如，与参考氨基酸序列的全部或一部分至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性)的氨基酸序列。

术语“培养(culture)”、“培养的(cultured)”和“培养(culturing)”在本文中可互换使用，以指胚胎或多能细胞藉以在体外生长的方法。

如应用于核酸的术语“破坏”和“破坏的”在本文中可互换使用，以指减少或消除核酸或其表达产物的表达和/或功能活性的任何遗传修饰。例如，基因的破坏在其范围内包括减少或消除基因的表达和/或相应的基因产物(例如，mRNA和/或蛋白质)的功能活性的任何遗传修饰。遗传修饰包括核酸(例如基因)的完全或部分的失活、抑制、缺失、中断(interruption)、阻断(blockage)或下调。示例性遗传修饰包括，但不限于：基因敲除；失活；突变(例如，破坏基因产物的表达或活性的插入、缺失、点突变或移码突变)；或者抑制性核酸(例如，抑制性RNA诸如有义或反义RNA，介导RNA干扰的分子诸如siRNA、shRNA、miRNA；等)、抑制性多肽(例如，抗体、多肽结合伴侣、显性负性多肽、酶等)或者抑制育性基因的活性或育性基因的表达产物的水平或功能活性的任何其它分子。

“显性负性”是指当与野生型基因产物在同一细胞中共表达时、甚至当细胞为杂合的(野生型和显性负性)时，不利地影响、阻断或消除正常的野生型基因产物的功能的基因产物。显性负性突变体的表达一般导致野生型基因产物的正常功能的降低。

如本文使用的，“早期胚胎”包括开始于卵母细胞的受精(即，受精的卵母细胞)并延伸通过2细胞期、4细胞期、8细胞期和桑椹胚(16至31细胞期胚胎)的全部胚胎发育期。如本文所定义的，早期胚胎不包括发育的囊胚期。“囊胚”意指以被称为囊胚腔的腔周围的细胞的中空球的发育为特征的胚胎发育期。本领域技术人员将认识到，囊胚的整体结构将根据生物体而不同。例如，“囊胚”是指以由外滋养层细胞和内细胞团组成的细胞的中空球为特征的卵裂期哺乳动物胚胎。

术语“胚胎干细胞”和ES细胞在本文中可互换使用，来指能够在胚胎或成体中引起许多分化的细胞类型(包括生殖细胞)的细胞。ES细胞包括早期胚胎来源的培养的细胞，所述ES细胞特征在于此类细胞能够在保持退行发育(anaplasticity)(全能性)的同时增殖。一般来说，胚胎干细胞为通过以下建立的细胞系：培养存在于动物的早期胚胎的囊胚内部为未分化的干细胞的内细胞团的细胞，以使得细胞在维持其未分化状态的同时保持增殖。

如本文使用的，术语“胚胎生殖细胞”，也被称为EG细胞，是指源自原生殖细胞的培养的细胞，所述“胚胎生殖细胞”特征在于其具有几乎等同于以上胚胎干细胞的能力的能力。胚胎生殖细胞为通过以下建立的细胞系：培养从受精之后数天至数周的胚胎(例如，在小鼠的情况中，大约8.5日龄的胚胎)获得的原生殖细胞，以使得细胞在维持其未分化状态的同时保持增殖。

如本文使用的，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列能够被转录和/或翻译以产生多肽或者如果核酸序列能够被加工为能够被转录和/或翻译以产生多肽的形式，则称所述核酸序列“编码”多肽。此类核酸序列可以包括编码序列或者编码序列和非编码序列二者。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等包括由DNA分子的转录产生的RNA产物，由RNA分子的翻译产生的蛋白质，由DNA分子的转录以形成RNA产物以及随后RNA产物的翻译产生的蛋白质，或者由DNA分子的转录以提供RNA产物、RNA产物的加工以提供加工的RNA产物(例如mRNA)和随后加工的RNA产物的翻译产生的蛋白质。

如本文使用的，“濒危哺乳动物”属于由于其数量很少或者受到改变的环境或捕食参数的威胁而处于走向灭绝的风险的哺乳动物的群体，诸如大象、大型猫科动物和非人灵长类动物，包括灰狼、纹兔袋鼠、美洲虎(jaguar)、亚洲象、高鼻羚羊和北白犀(北白犀(ceratotherium simum cottoni))。

在核酸或蛋白质的上下文中，术语“内源性”是指通常发现于宿主生物体或宿主细胞中的核酸序列或区段或者氨基酸序列或区段。

如本文使用的术语“内源性配子”和“内源性生殖细胞”是指“起源于或者产生自宿主胚胎内”的配子和生殖细胞并且排除宿主细胞内的源自供体多能细胞的配子和生殖细胞。

关于基因序列的术语“表达”是指基因的转录以及所得到的mRNA转录物根据情况翻译为蛋白质。因此，如从上下文中将变得清楚的，编码序列的表达由编码序列的转录和翻译引起。相对地，非编码序列的表达由非编码序列的转录引起。

如本文使用的，“育性基因”是指涉及产生后代或者涉及怀孕的能力的基因。因此，育性基因的破坏可以减小、损坏或消除非人类动物的怀孕或产生后代的能力，从而导致不育。导致的不育能够存在于雄性或雌性中。不育的非限制性实例包括：无精症；与有缺陷的精子发生相关的遗传性紊乱(例如，克氏综合征和性腺发育不全)；少精症；精索静脉曲张；和与受损的精子功能相关的其它精子紊乱，包括但不限于低下的精子数目、精子活力和精子形态；以及排卵功能异常(例如，多囊卵巢综合征(PCOS)或慢性停止排卵)。如本文使用的，可破坏的(例如通过破坏物分子)的育性基因被称为“可破坏的育性基因”。

术语“侧翼为(flanked by)”、“在……侧翼(flanking)”等当其应用于本发明的靶向构建体中的两个或更多个核苷酸序列之间的关系时，不要求这些核苷酸序列中的一个位于与另一个核苷酸序列直接邻接处。例如，三个参考核苷酸序列(A、B和C)的侧翼可以为重组靶位点序列，或者重组靶位点序列可以在那些参考序列的侧翼，即使参考序列B未与这些位点直接邻接。因此，术语“侧翼为”等同于“在”重组位点“之间”并且术语“在……侧翼”等同于重组位点在参考序列的上游或下游。

“功能基因”是指产生执行可定义的功能的基因产物的基因。在特定的实施方案中，功能基因是内源性基因。

术语“配子(gamete)”和“配子(gametes)”可互换使用并且是指次级生殖细胞，包括卵母细胞、卵细胞、精子(spermatozoa)和精子(sperm)。

如本文使用的，术语“基因”是指能够被用于产生mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等的核酸分子。基因可以或者可以不能够被用于产生功能性蛋白质。基因可包括编码区和非编码区二者(例如，内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列以及5’非翻译区和3’非翻译区)。

术语“遗传修饰”是指在引入新核酸(即，对于细胞外源性的核酸)之后，在细胞中引起的永久性或暂时性的遗传改变。遗传改变(“修饰”)能够通过将新核酸并入到宿主细胞的基因组中，或者通过瞬时或稳定保持新核酸作为染色体外元件实现。当细胞为真核细胞时，永久性遗传改变能够通过将核酸引入细胞的基因组中实现。遗传修饰在其范围内包括敲入(knock-in)和敲除遗传改变。

术语“生殖细胞(germ cell)”、“生殖细胞(germ cells)”和“种系”可互换使用并且是指产生配子的细胞。这些术语包括原生殖细胞、对碱性磷酸酶呈阳性的细胞、初级卵母细胞、卵原细胞、精原干细胞、精原细胞和初级精母细胞。

术语“异源的”是指不是来源于特定的生物体、组织或细胞内的物体(例如，核酸分子、多肽、细胞、组织等)。例如，“异源细胞”，包括“异源多能细胞”，是指通常地或天然地无法发现于生物体中或者生物体的组织中的细胞。

术语“异源多核苷酸”、“外来多核苷酸”、“外源性多核苷酸”等在本文中可互换使用以描述已经或即将被人工引入宿主生物体的基因组中并且被传递到该宿主的后代的遗传物质。异源多核苷酸可以包括在基因序列被引入或即将被引入至其的生物体中发现的所述基因序列，只要引入的多核苷酸相对于天然存在的多核苷酸含有一些修饰(例如，点突变、存在可选择的标记物基因、存在LoxP位点等)。异源多核苷酸可以包含在合适的条件下能够被转录为RNA并且任选地被翻译和/或表达的核酸序列。在一些实施方案中，其被转录为干扰转录或翻译的分子(例如，反义分子)或介导RNA干扰的分子(例如，siRNA或shRNA)。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含肽或多肽的编码序列。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含用于将遗传修饰引入基因组中的靶向盒。

术语“异源多肽”、“外来多肽”和“外源性多肽”可互换使用以指由如上文定义的“异源多核苷酸”、“外来多核苷酸”和“外源性多核苷酸”编码的任何肽或多肽。

术语“宿主细胞”是指构建体或本发明的构建体被引入其中的细胞。本发明的宿主细胞包括，但不需要限于，细菌、酵母、动物(包括脊椎动物)、昆虫和植物细胞。宿主细胞可以是单细胞的，或者可以在组织培养中作为液体培养物、单层等生长。宿主细胞还可以直接或间接地源自组织，或者可以存在于包括动物在内的生物体内。在特定的实施方案中，宿主细胞是动物宿主细胞，特别是脊椎动物宿主细胞，包括哺乳动物宿主细胞。

在本文中提及“免疫相互作用的”包括提及任何相互作用、反应或分子之间联系的其它形式并且特别是当分子之一是或者模拟免疫系统的组分时。

术语“敲入(knock-in)”一般是指已经通过同源重组被插入基因组中的异源或外来多核苷酸。敲入的多核苷酸可以是代替内源性、野生型基因或基因部分的突变形式的基因或基因部分。此类突变包括异源序列的插入、缺失、点突变、移码突变和可阻止、破坏或改变正常基因表达的任何其它突变。因此，如本文使用的“敲入”的动物是指其中异源或外来多核苷酸被插入到动物的基因组中或者其中动物的基因组的特定基因或其部分被外源基因或DNA序列代替的遗传修饰的动物。“条件性敲入”在其范围内包括已经通过同源重组被插入到基因组中并且在指定的发育期或在特定的环境条件下引起活性(例如，转录或翻译的调控、包括编码和/或非编码序列在内的核苷酸序列的产生等)的异源或外来多核苷酸。“条件性敲入载体”是包含可以通过同源重组插入到基因组中并且可在指定的发育期或在特定的环境条件下引起活性(例如，转录或翻译的调控、包括编码和/或非编码序列在内的核苷酸序列的产生等)的异源或外来基因或其部分的载体。

通过“敲除”意指基因的失活或破坏，所述基因的失活或破坏降低、消除或者以其他方式抑制该基因的表达产物的水平或功能活性。“敲除”的动物是指其中基因被破坏的遗传修饰的动物。“条件性敲除”是指在特定条件下被破坏的基因，诸如以组织特异性或时间特异性的模式被破坏的基因。“条件性敲除载体”是指包含能够在特定的条件下被破坏的基因的载体。

通过“标记物基因”意指给予表达标记物基因的细胞一种不同的表型并由此允许此类转化的细胞区别于不具有该标记物的细胞的基因。可选择的标记物基因赋予一种性状，由于该性状，技术人员能够基于对选择剂(例如，除草剂、抗生素、射线、热或对未转化的细胞的其它处理伤害)的耐受来‘选择’。可筛选的(screenable)标记物基因(或报告物基因)赋予技术人员能够通过观察或测试，即通过‘筛选’鉴定的性状(例如，β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白或在未转化的细胞中不存在的其它活性)。

术语“微小RNA”或“miRNA”是指已经在包括植物在内的很多不同的真核细胞中发现的小的非编码RNA分子。miRNA前体共有特征性次级结构，形成短的‘发夹’RNA。术语“miRNA”包括经加工的序列以及相应的长的初级转录物(pri-miRNA)和经加工的前体(pre-miRNA)。遗传学和生物化学研究已经表明，miRNA被RNA酶III家族核酸酶Dicer加工为其成熟形式，并且通过RNA介导的干扰(RNAi)和相关的途径发挥作用以调控靶基因的表达(Hannon,2002,Nature 418,244-251；Pasquinelli等,2002,Annu.Cell.Dev.Biol.18,495-513)。miRNA可以被配置为合成的沉默引发物‘短发夹RNA’(shRNA)以允许细胞中基因表达的实验操作(Paddison等,2002,Cancer Cell2,17-23)。通过shRNA的沉默涉及RNAi机器(machinery)并且与小干扰RNA(siRNA)的产生相关，这些是RNAi的特征。

如本文使用的，“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能够编码自然界中存在的蛋白质。

术语“非编码序列”是指不促成基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。

术语“非人类动物”意指排除人类之外的动物，并且意图包括任何脊椎动物诸如哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。合适的哺乳动物包括啮齿动物、非人灵长类动物、马科动物诸如马、绵羊、山羊、兔形目动物诸如兔子、狗、猫、牛、动物园动物以及濒危或外来(exotic)哺乳动物。在一些实施方案中，非人类动物选自包括大鼠和小鼠在内的啮齿动物类。在特定的实施方案中，非人类动物是小鼠。

“核组(nucleome)”意指总的核酸组(nucleic acid complement)并且包括基因组、染色体外核酸分子和所有RNA分子诸如mRNA、异源核RNA(hnRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小胞质RNA(scRNA)、核糖体RNA(rRNA)、翻译控制RNA(tcRNA)、转运RNA(tRNA)、eRNA、信使RNA干扰性互补RNA(micRNA)或干扰RNA(iRNA)、叶绿体或质粒RNA(cpRNA)和线粒体RNA(mtRNA)。

术语“可操作连接的(operably connected)”、“可操作连接的(operablylinked)”、“可操作连接的(in operable linkage)”、“可操作连接的(in operableconnection)”等在本文中被用来指多核苷酸元件在功能性关联中的连接。当核酸被置于与另一个核酸序列的功能性关联中时，所述核酸被“可操作连接”。例如，当重组酶识别位点足够紧密靠近以促进宿主细胞基因组中靶向盒与靶位点之间的重组时，重组酶识别位点与靶向盒可操作连接。在一些实施方案中，重组酶识别位点位于距离靶向盒不多于10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、90bp、80bp、70bp、60bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp处。在其它实施方案中，“可操作连接”等是指将可转录序列放置在启动子的调节性控制下，所述启动子控制序列的转录和任选地翻译。在异源启动子/可转录序列组合的构建中，通常期望将遗传序列或启动子放置在距离基因转录起始位点与该遗传序列或启动子与它在其天然设置(即，遗传序列或启动子源自的基因)中控制的基因之间的距离大约相同处。如本领域已知的，以该距离的一些变体能够被适应而不会失去功能。类似地，另一个控制元件相对于待被放置在其控制下的异源核酸序列或基因的期望的位置由该元件在其天然设置(即所述控制元件源自的基因)中的位置限定。这些术语在其范围内还包括启动子与可转录序列之间的可操作连接(linkage)或连接(connection)，其中在第一条件下表达调节元件被用于抑制可转录序列的转录，并且其中在第二条件下表达调节元件的破坏被用于允许或增强可转录序列的转录。

如本文使用的，术语“转录后基因沉默”(PTGS)是指基因沉默的一种形式，其中抑制机制在转录后发生。这能够导致特异性的RNA靶的降低的稳态水平或翻译的抑制(Tuschl等,2001,ChemBiochem 2:239-245)。在文献中，术语RNA干扰(RNAi)和转录后共抑制经常被用来表明转录后基因沉默。

术语“多能”是指细胞分化为在成年生物体(例如，非人类动物)中存在的许多分化的细胞类型的能力。与全能细胞相比，多能细胞的分化能力是受限制的。多能细胞包括，但不限于，能够分化为生殖细胞的干细胞诸如ES细胞、上胚层干细胞(EpiSC或epi干细胞)、胚胎生殖(EG)细胞和诱导性多能干(iPS)细胞。术语“多能细胞”包括遗传修饰的多能细胞。

如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”表示mRNA、RNA、cRNA、cDNA、iRNA、siRNA、shRNA、miRNA或DNA。该术语通常指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物以及氨基酸残基的聚合物的变体和合成的类似物。因此，这些术语适用于其中的一个或更多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。

术语“后代”、“转基因非人类动物的后代”等是指继最初转化的非人类动物之后的每代的任何和所有后代。

“启动子”意指至少部分控制转录的起始和水平的DNA区域。在本文中提及“启动子”将取其最广的语境(broadest context)，并且包括经典基因组基因的转录调控序列(包括TATA盒和CCAAT盒序列)，以及响应于发育和/或环境刺激或以组织特异性或细胞类型特异性的方式改变基因表达的另外的调控元件(即，激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常，但不必然位于其表达被所述启动子调控的可转录序列(例如编码序列或编码功能RNA的序列)的上游或5’端。此外，包含启动子的调控元件通常位于基因的转录起始位点的2kb内。根据本发明的启动子可以含有位于距离起始位点更远处的另外的特异性调控元件，以进一步增强在细胞中的表达和/或改变与所述启动子可操作连接的结构基因的表达的时间控制或可诱导性。术语“启动子”在其范围内还包括诱导型启动子、阻抑型启动子和组成型启动子以及小启动子。小启动子通常指能够起始与所述小启动子可操作连接的选择的DNA序列的转录的小的表达控制元件。在一些实例中，小启动子在基础水平以上的另外的调控元件(例如，增强子或其它顺式作用调控元件)的不存在下不能起始转录。小启动子经常由TATA盒或TATA样盒组成。很多小启动子序列是文献中已知的。例如，小启动子可以选自很多的已知序列，包括除了很多其它的以外，来自fos、CMV、SV40和IL-2的启动子区域。提供了使用小CMV启动子或小IL2基因启动子(相对于起始位点-72至+45；Siebenlist,1986)的示例性实例。

如本文使用的，“稀有或者濒危物种”包括但不限于被任何组织列为受到威胁的或者濒危的任何动物，或者其种群或栖息地受到威胁的任何动物，或者被圈养而期望地繁殖的任何动物。例如，濒危物种的列表可在U.S.Fish and wildlife Service,EndangeredSpecies Program中找到或者在Endangered Species Act)(ESA)中被列出。

“重组酶识别位点”(RRS)意指重组酶与其结合或者以其它方式相互作用的核酸位点或序列。此类结合或相互作用可以是直接的或者间接的。

术语“可调控启动子”是指并非组成型地而是以在时间上和/或在空间上调控的方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子二者。其包括天然的序列和合成的序列以及可以为合成的序列和天然的序列的组合的序列。不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育期，或者响应于不同的环境条件指导基因的表达。可用于宿主细胞的多种类型的新启动子被不断发现。由于在大多数情况中调控序列的精确边界尚未被彻底界定，因此不同长度的核酸片段可以具有相同的启动子活性。

如本文使用的，术语“RNA干扰”和“RNAi”是指一种序列特异性的过程，通过所述过程靶分子(例如，靶基因、蛋白质或RNA)经由表达的下调而被下调。不被束缚于特定的机制，如本领域技术人员目前所理解的，RNAi涉及RNA分子例如细胞内的mRNA分子通过酶性的RNA诱导的沉默复合体(RISC)催化而降解。RNAi在细胞中天然地发生以去除外来RNA(例如病毒RNA)，RNAi由从更长的dsRNA裂解得到的dsRNA片段引发，dsRNA片段将降解机制导向具有密切同源的序列的其它RNA序列。随着作为一项技术实践，RNAi能够通过人类介入被起始，以使用外源地合成的dsRNA或在细胞中转录的dsRNA(例如，被合成为形成短的发夹结构的序列)减少或者甚至沉默靶基因的表达。

如本文使用的，术语“小干扰RNA”和“短干扰RNA”(“siRNA”)是指短的RNA分子，通常为长度约为约10-50个核苷酸(术语“核苷酸”包括核苷酸类似物)、优选地长度在约15-25个核苷酸之间的双链RNA分子。在大多数情况中，siRNA的长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。此类siRNA能够具有突出端(例如，1个、2个或3个核苷酸(或核苷酸类似物)的3’-突出端)。此类siRNA能够介导RNA干扰。

如与本发明相关使用的，术语“shRNA”是指具有茎-环结构的RNA分子。茎-环结构包括两条相互互补的序列，其中各自的方向和互补性的程度允许两个序列之间的碱基配对。相互互补的序列通过环区域连接，环由环区域内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对产生。

如本文使用的术语“序列同一性”是指序列在比较窗口中在核苷酸到核苷酸的基础上或者在氨基酸到氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性的百分数”通过以下来计算：在比较窗口中比较两个最佳对齐的序列；确定在两个序列中均存在相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目，以得到匹配的位置的数目；将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数(即窗口大小)；并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分数。为了本发明的目的，“序列同一性”将被理解为意指通过DNASIS计算机程序(2.5版本用于windows；从Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA可得)使用如软件所附的参考手册中使用的标准默认值计算的“匹配百分数”。

“相似性”是指相同的或者构成如表1中限定的保守置换的氨基酸的百分数。

表1

相似性可是使用序列比较程序诸如GAP(Deveraux等1984,Nucleic AcidsResearch 12,387-395)来确定。以这种方式，与本文引用的那些序列长度相似或大体上不同的序列可以通过将空位插入到对齐物中来比较，此类空位例如通过GAP使用的比较算法来确定。

用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性的百分数”和“基本同一性”。“参考序列”的长度为至少12个但经常15至18个并且通常至少25个单体单位，所述单体单位包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的仅一部分)，以及(2)两个多核苷酸之间不同的序列，所以两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过比较“比较窗口”中的两个多核苷酸的序列以鉴定并比较序列相似性的局部区域来进行。“比较窗口”是指至少6个连续位置、通常约50个至约100个、更通常约100个至约150个连续位置的概念区段，在所述概念区段中，在两个序列被最佳对齐后，一个序列被与具有相同数目的连续位置的参考序列比较。当与参考序列(其不包含添加或缺失)比较时，比较窗口可以包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)用于两个序列的最佳对齐。用于对齐比较窗口的最佳序列对齐可以通过算法的计算机化执行(WisconsinGenetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575ScienceDrive Madison,WI,USA中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过观察和由选择的多种方法中的任一种产生的最佳对齐(即，在比较窗口中产生最高百分比的同源性)来进行。如例如由Altschul等,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公开的，参考还可以被制作成BLAST程序族。序列分析的详细讨论可在Ausubel等"Current Protocols in MolecularBiology",John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章的19.3单元中找到。

术语“位点特异性同源重组”是指在核苷酸组成上基本上相似的核酸序列之间的链交换交叉事件。这些交叉事件可发生于在本发明的靶向构建体中包含的序列与内源性基因组核酸序列之间。另外，能够发生多于一个位点特异性同源重组事件是可能的，这会导致置换事件，在所述置换事件中，靶向构建体中包含的核酸序列具有存在于内源性基因组序列中的被置换的特定序列。

如应用于基因的破坏或者重组酶识别位点的识别，术语“特异性地”是指破坏该基因或者识别那些重组酶识别位点，而基本上不破坏另一个基因或者基本上不识别其它重组酶识别位点。例如，特异性地破坏育性基因的剂是表现出对该育性基因相对于另一个育性基因或者与育性不相关的基因的破坏大约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大约100倍、500倍、1000倍的特异性的剂。在另一个实例中，特异性地识别指定重组酶的识别位点的剂是表现出对那些识别位点相对于对另一个重组酶的识别位点的特异性大约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大约100倍、500倍、1000倍的特异性的剂。

如本文使用的“严格度”是指在杂交和洗涤程序期间，温度和离子强度条件以及某些有机溶剂的存在或不存在。严格度越高，在固定化的靶核苷酸序列和洗涤后与靶维持杂交的标记的探针多核苷酸序列之间的互补性程度将越高。

“严格条件”是指在其下只有具有高频互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。所需的严格度是核苷酸序列依赖性的，并且取决于在杂交和随后的洗涤期间存在的多种成分以及这些处理允许的时间。一般来说，为了最大化杂交比率，选择非严格的杂交条件；比热力学熔点(T_m)低约20℃至25℃。T_m是在特定的离子强度和pH的溶液中50％的特定靶序列与完全互补的探针杂交的温度。一般来说，为了获得杂交序列的至少约85％的核苷酸互补性，将高度严格的洗涤条件选择为比T_m低约5℃至15℃。为了获得杂交序列的至少约70％的核苷酸互补性，将中等严格的洗涤条件选择为比T_m低约15℃至30℃。高度允许性(低严格度)洗涤条件可以低到比T_m低50℃，允许杂交序列之间高水平的错配。本领域技术人员将认识到，杂交和洗涤阶段中的其它物理和化学参数也可被改变以影响来自靶和探针序列之间特定的序列同一性水平的可检测杂交信号的结果。

术语“靶向盒”、“靶向构建体”等是指通过同源重组促进在生物体或宿主细胞的基因组中破坏或插入特定核酸序列的核酸构建体。一般来说，靶向盒包含：(1)至少一个同源区或同源臂，所述同源区或同源臂具有与宿主细胞内源性基因位点中存在的序列基本上相同或者基本上互补的序列，和(2)靶向区，所述靶向区通过靶向构建体同源区和内源性基因位点序列之间的同源重组变为被整合到宿主细胞内源性基因位点中。靶向区可以包含与内源性基因序列基本上同源的序列和/或在一些实施方案中可以包含非同源序列，诸如可选择的标记物(例如，neo、tk、gpt)或者异源多核苷酸。术语“靶向盒”、“靶向构建体”等不必然表示靶向区包含变为被整合到宿主基因组中的基因，也不必然表示靶向区包含完整的结构基因序列。如本领域中所使用的，术语“靶向盒”、“靶向构建体”等与如本文所使用的术语“转基因”是同义的。

术语“全能的”是指细胞分化成成年生物体(例如，非人类动物)的所有细胞类型的能力。

术语“可转录核酸序列”或“转录的核酸序列”不包括驱动转录的非转录的调控序列。根据本发明的方面，可转录序列可以全部或者部分源自本领域已知的任何来源，所述来源包括：植物；真菌；动物；细菌基因组或附加体；真核、核或质粒DNA；cDNA；病毒DNA或化学合成的DNA。可转录序列可以在编码区或非翻译区含有一个或更多个修饰，所述修饰能够影响表达产物的生物学活性或化学结构、表达的速度或表达控制的方式。此类修饰包括，但不限于，一个或更多个核苷酸的插入、缺失和置换。可转录序列可以含有不中断的编码序列或者其可以包含一个或更多个通过合适的剪接点结合的内含子。可转录序列还可以编码融合蛋白。在其它实施方案中，可转录序列仅包含非编码区。

“转染”意指期间核酸分子(例如，质粒或DNA片段)被插入到真核细胞中的过程。通常，2-50％的细胞摄入质粒并持续～3天表达蛋白质产物，而不将质粒DNA或DNA片段并入到细胞的染色体中(＝瞬时转染)。这些细胞的小部分将最终将质粒DNA并入到它们的染色体中并永久性地表达蛋白质产物(＝稳定转染)。

术语“转基因”在本文中被用来描述已经或者即将被人工引入宿主生物体的基因组中并且被传递到该宿主的后代的遗传物质。转基因通常将包含多核苷酸，所述多核苷酸包含通常但非必然影响或引起活性(例如，转录或翻译的调控、包含编码和/或非编码序列的核苷酸序列的产生，等)的非编码和/或编码序列。在一些实施方案中，转基因包含能够在合适的条件下转录为RNA并且任选地翻译和/或表达的多核苷酸。在一些实施方案中，其转录为干扰转录或翻译的分子(例如，反义分子)或者介导RNA干扰的分子(例如，siRNA或shRNA)的分子。在一些实施方案中，转基因包含多肽的编码序列。在一些实施方案中，转基因包含用于将遗传修饰引入基因组中的靶向盒。可以使用多种个方法中的任一种可被用来将转基因引入到非人类动物中以产生转基因动物。此类技术是本领域所公知的，并且包括，但不限于，胚胎干细胞和iPS细胞的原核显微注射、病毒转染和转化。可使用的用于产生转基因动物的方法包括，但不限于，J.P.Sundberg和T.Ichiki,编辑,GeneticallyEngineered Mice Handbook,CRC Press；2006；M.H.Hofker和I.van Deursen,编辑,Transgenic Mouse Methods and Protocols,Humana Press,2002；A.L Joyner,GeneTargeting:A Practical Approach,Oxford University Press,2000；Manipulating theMouse Embryo:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002,ISBN-10:0879695919；K.Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods andprotocols in Methods Mol.Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in StemCell Biology,ISBN:978047015180；Meyer等PNAS USA,第107卷(34),15022-15026中记载的那些方法。

如本文使用的，关于宿主细胞、宿主部分、宿主组织或宿主的术语“转基因的”或“转化的”意指包含已经被引入宿主细胞、宿主部分、宿主组织或宿主动物的核组、特别是基因组中的遗传修饰的宿主细胞、宿主部分、宿主组织或宿主动物，所述引入通常通过转基因的方式。

“载体”意指核酸序列可以被插入或克隆到其中的核酸分子，适当地为源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子。载体通常含有一个或更多个独特的限制位点，并且可以能够在特定的宿主细胞内自主复制，所述特定的宿主细胞包括靶细胞或组织或者其祖细胞或组织，或者可与特定的宿主的基因组整合以使得克隆的序列可复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，闭合的环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何手段。可选地，载体可以是当被引入宿主细胞中时被整合到基因组中并与已经被整合入所述载体的基因组一起被复制的载体。载体系统可以包括：单种载体或质粒；两种或更多种载体或质粒，所述两种或更多种载体或质粒共同包含待被引入到宿主细胞的基因组的总DNA；或者转座子。载体的选择将通常取决于载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体还可以包含能够被用来鉴定合适的转化子的标记物，诸如抗生素抗性基因。此类抗性基因的实例是本领域技术人员公知的。

术语“5’非编码区”以其最广泛的语境在本文中使用，以包括除了编码包含基因的多肽产物的氨基酸残基的那些序列之外，源自可表达基因的上游区域的所有核苷酸序列，其中5’非编码区至少部分地赋予或者激活或者以其他方式促进基因的表达。

如本文使用的，术语“5’非翻译区”或者“5’UTR”是指位于启动子区的3’和下游编码区的5’的序列。因此，此类序列当被转录时在翻译起始密码子的上游(即，5’)并因此通常不被翻译为多肽产物的一部分。

术语“3’非翻译区”或“3’UTR”是指在编码序列的下游(即，3’)的核苷酸序列。其从编码序列的终止密码子后的第一个核苷酸延伸至刚好在相应的转录的mRNA的多聚(A)尾之前。3’UTR可以含有调控翻译效率、mRNA稳定性、mRNA靶向和/或聚腺苷酸化的序列。

术语“野生型”是指具有从天然存在的来源分离的基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常被观察到的基因，并且因此被主观武断地指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相对地，术语“修饰的”“变体”或“突变体”是指当与野生型基因或基因产物比较时，表现出序列和或功能特性方面的修饰(即，改变的特征)的基因或基因产物。人们注意到，能够分离到天然存在的突变体；这些天然存在的突变体通过当与野生型基因或基因产物比较时它们具有改变的特征的事实而被鉴定。

如本文使用的，对基因的名字加下划线或用斜体表示应该指示基因，与其蛋白质产物相对，蛋白质产物以不存在任何下划线或斜体的方式指示。例如，“GILZ”应该意指GILZ基因，而“GILZ”应该指示“GILZ”基因的蛋白质产物。

除非另有明确说明，本文描述的每个实施方案与每个和各个实施方案参照适用。

2.缩写

以下缩写贯穿本申请使用：

dpc＝交配后天数

ES细胞＝胚胎干细胞

epi干细胞＝上胚层干细胞

EG细胞＝胚胎生殖细胞

iPS细胞＝诱导性多能干细胞

d＝天

h＝小时

s＝秒

3.具有破坏的育性基因的非人类胚胎用于增强供体多能细胞的种系传递的用途

本发明提供了用于增强供体多能细胞的种系传递的组合物和方法，所述供体多能细胞包括具有遗传修饰的那些供体多能细胞。修饰起源于非人类宿主胚胎的生殖细胞，使得至少一个有助于能育性的基因(即，育性基因)被破坏。然后使用修饰的非人类宿主胚胎“寄养(host)”引入的具有功能性育性基因(即，未被破坏的育性基因)的供体多能细胞。在替代的或代孕非人类动物中得到的非人类宿主胚胎的移植和孕育产生通常包括以下两种类型的嵌合后代的一窝幼崽：具有通常源自非人类宿主胚胎、带有破坏的育性基因的内源性生殖细胞或配子的那些嵌合后代；以及包含通常源自供体多能细胞、带有功能性育性基因的生殖细胞或配子的那些嵌合后代。当与包含功能性育性基因的同类非人类动物交配时，包含具有破坏的育性基因的内源性生殖细胞或配子的嵌合非人类动物将具有受损的或抑制的能育性。相反，包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的嵌合非人类动物将具有正常的或未受损的能育性，从而增强包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的第一窝后代的产生。

3.1育性基因

根据本发明，可以破坏任何适当的育性基因或育性基因的组合以提供非人类宿主胚胎以及衍生的非人类动物和后代。育性基因的非限制性实例连同引起育性基因破坏并导致不育(例如，雄性不育)的示例性突变(其以上标呈现)和等位基因组成一起被列于表2中。在表2中还呈现了示例性的遗传背景，在所述遗传背景中这些育性基因的破坏导致不育(例如，雄性不育)。

表2：育性基因和导致不育的示例性突变

在其它实施方案中，育性基因选自精子发生基因，所述精子发生基因的示例性实例包括在美国专利申请公开2005/0176943中公开的那些基因，所述专利申请公开的完整内容被通过引用并入本文。代表性基因包括：包含具有该公开的SEQ ID NO:1-89示出的核酸序列的转录物的那些基因。这些基因的非限制性实例包括AKAP110、RBcc728、Trim36、Nopp140、ATR、HSpb、Spergen-1、芳香基硫酸酯酶A(arylsulfatase A)、Drctnnbla、CDC14B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生蛋白、妊娠诱导的生长抑制剂、脂肪酸辅酶A连接酶、长链、Fem、主要80,000Mr纤维鞘组分、甘油磷酸脱氢酶1、线粒体Lim结构域包含1(mitochondrial,Lim domains containing 1)、oaz-t、pctp-1、睾丸特异性磷酸甘油酸酯激酶、磷脂酶Cδ4、精蛋白1、精蛋白2、scot-t1、scot-t2、线粒体外膜硒蛋白、Spehzin、oppo1、Galβ-1、3-GalNAc-特异性GalNAcα-2,6-唾液酸转移酶(3-GalNAc-specific GalNAcalpha-2,6-sialyltransferase)、融合同系物的抑制子、t-肌动蛋白1、t-肌动蛋白2、t-复合体Tcp-lOa、筑丝蛋白-t、teek 1、TP-2、tsec-1、tssk 1.2亚基、丝氨酸/苏氨酸激酶22B(精子发生相关的)、tsga2、Gapd-S、meichroacidin、halap-X、Ssecks、gsgl、haspin、gsg3、hilsl、shippol和推定的溶血磷脂酸酰基转移酶。

在有利的实施方案中，育性基因是位于性染色体上的基因。在这种类型的示例性实例中，育性基因位于X染色体上(即，X-连锁的育性基因)诸如，但不限于，GILZ(TSC22d3)。

可使用任何适当的技术破坏育性基因。在一些实施方案中，使用靶向构建体进行破坏，在所述靶向构建体中育性基因的一部分可操作地位于靶向盒的两个侧翼部分之间，所述靶向盒的两个侧翼部分与细胞基因组中靶位点的区域足够同源以允许靶向盒与靶位点之间的同源重组。例如，靶位点可以包含育性基因的外显子或编码序列或者控制序列(例如，启动子)，并且在某些实施方案中，破坏物序列(例如，标记物基因)位于靶向盒的侧翼部分附近处以破坏或替换育性基因的至少一部分，从而使得育性基因失活并因此无功能。在这种类型的示例性实例中，侧翼部分中的一个与育性基因的5’非翻译序列的一部分基本同源，并且另一个与内源性基因的3’非翻译序列的至少一部分基本同源。在其它示例性实例中，靶向盒的侧翼部分与育性基因的邻接干预性编码序列的区域基本同源，所述干预性编码序列编码由育性基因编码的多肽的能育性所需的结构域。在这些实施方案中，靶向构建体和靶位点之间的位点特异性同源重组随后导致育性基因的至少一部分被标记物基因替换以及育性基因的破坏。

在特定的实施方案中，为育性基因提供了重组酶识别位点(也被称为受体序列)，所述重组酶识别位点位于该基因的内部或者毗邻该基因，并且被位点特异性重组酶蛋白识别，所述重组酶蛋白通过结合重组酶识别位点并催化导致该基因的破坏的重组酶识别位点之间的位点特异性重组而充当育性基因破坏物分子。重组酶可以催化位点之间的分子内或分子间重组。例如，在分子内重组的情况中，当具有相同方向的两个重组位点存在于同一分子内时，位点之间的位点特异性重组将切除侧翼为位点的DNA序列(切除反应)，而在分子间重组中，在不同分子上的两个重组识别位点之间的位点特异性重组将导致共整合(插入反应)。在这些实施方案的示例性实例中，包含与启动子可操作连接的位点特异性重组酶编码序列的转基因被用于条件性地破坏育性基因。示例性的位点特异性的重组酶包括Cre、修饰的Cre、Dre、HP、FLP-野生型(wt)、FLP-L、FLPe、Flpo或phiC31。重组酶识别位点的非限制性实例包括loxP、FRT、rax和attP/B。重组可以通过任何本领域已知的方法产生，例如Doetschman等(1987,Nature 330:576-578)的方法；Thomas等(1986,Cell 44:419-428)的方法；Cre-loxP重组系统(Sternbergh和Hamilton,1981,J.Mol,Biol.150:467-486；Lakso等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的FLP重组酶系统(O'Gorman等,1991,Science 251:1351-1355；Lyznik等,1996,Nucleic Acids Res.24(19):3784-3789)；Cre-loxP-四环素控制开关(Gossen和Bujard,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-51)；和配体调控的重组酶系统(Kellendonk等,1999,J.Mol.Biol.285:175-82)。期望地，重组酶具有高活性，例如，Cre-loxP或FLPe系统，并且具有增强的热稳定性(Rodrguez等,2000,Nature Genetics 25:139-40)。在特定的实施方案中，育性基因的至少一部分(包括其调控序列，如果适当的话)的侧翼为由Cre重组酶特异性识别的loxP靶位点或被FLP重组酶特异性识别的FRT靶位点。LoxP靶位点序列的示例性实例是5'-ATA ACTTCGTATAGCATACATTATACGAAG TTAT-3'[SEQ ID NO:1]。FRT靶位点序列的示例性实例是5'-GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGTAAGTATAGGAACTTC-3'[SEQ ID NO:2]。

在其它实施方案中，育性基因破坏物分子是通过RNA干扰(RNAi)或通过转录后基因沉默(PTGS)抑制育性基因的表达的表达产物。在这种类型的示例性实例中，表达产物是RNA分子(例如，siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA等)，所述RNA分子包含对应于育性基因的核苷酸序列的靶向区域，并且减弱或者以其他方式破坏育性基因的表达。此类育性基因的非限制性实例在表2中和本文其他处被列出。

在示例性实例中，靶向序列表现出与育性基因的核苷酸序列至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的同一性。在其它示例性实例中，靶向序列在至少低严格度条件下、更适当地在至少中等严格度条件下并且甚至更加适当地在高严格度条件下与靶基因的核苷酸序列杂交。本文提及低严格度条件包括和包含从至少约1％v/v至至少约15％v/v的甲酰胺和从至少约1M至至少约2M的盐用于在42℃杂交，以及至少约1M至至少约2M的盐用于在42℃洗涤。低严格度条件还可以包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，和(i)2xSSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS用于在室温洗涤。中等严格度条件包括和包含从至少约16％v/v至至少约30％v/v的甲酰胺和从至少约0.5M至至少约0.9M的盐用于在42℃杂交，和至少约0.5M至至少约0.9M的盐用于在42℃洗涤。中等严格度条件还可以包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，和(i)2xSSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS用于在42℃洗涤。高严格度条件包括和包含从至少约31％v/v至至少约50％v/v的甲酰胺和从至少约0.01M至至少约0.15M的盐用于在42℃杂交，并且至少约0.01M至至少约0.15M的盐用于在42℃洗涤。高严格度条件还可以包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，和(i)0.2xSSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、1％SDS用于在超过65℃的温度洗涤。期望地，靶向序列在生理条件下与育性基因的核苷酸序列杂交。

其它严格条件是本领域公知的。本领域技术人员将认识到，多种因素可被操作以优化杂交的特异性。最后的洗涤的严格度的优化可用来确保高程度的杂交。对于详细的实例，参见Ausubel等，同上，第2.10.1页至2.10.16页和Sambrook等,同上，第1.101节至第1.104节。

适当地，靶向区域与育性基因的有义链或反义链具有序列同一性。在某些实施方案中，RNA分子未被聚腺苷酸化，这可导致育性基因表达的有效降低，如例如由Waterhouse等在美国专利号6,423,885中所描述的。

通常，靶向区域的长度可以从约10个核苷酸(nt)最高至等于育性基因的长度(以核苷酸计)的长度之间变化。一般地，靶向区域的长度为至少10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25nt，通常至少约50nt，更通常至少约100nt，特别地至少约150nt，更特别地至少约200nt，甚至更特别地至少约500nt。除了育性基因的总长度之外，预期对靶向区域的总长度没有上限。但是出于实践的原因(诸如例如，靶向构建体的稳定性)，预期靶向区域的长度不应超过5000nt，特别是不应超过2500nt，并且可以限于约1000nt。

RNA分子还可以包含一个或更多个其它的靶向区域(例如，从约1个至约10个，或者从约1个至约4个，或者从约1个至约2个其它靶向区域)，所述其它靶向区域中的每个与靶基因的核苷酸序列具有序列同一性。一般地，靶向区域彼此相同或者与彼此共有至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列同一性。

RNA分子还可以包含靶向区域的反向互补物。通常，在这些实施方案中，RNA分子还包含将靶向区域与反向互补物间隔开的间隔序列。间隔序列可以包含长度为至少约100-500个核苷酸、或者可选地长度为至少约50-100个核苷酸、并且在另外的可选的方案中长度为至少约10-50个核苷酸的核苷酸序列。通常，间隔序列是非编码序列，在一些实例中间隔序列是内含子。在间隔序列是非内含子间隔序列的实施方案中，核酸序列的转录将产生形成发夹或茎环结构的RNA分子，在茎环结构中茎通过靶向序列与反向互补物的杂交形成，并且环由连接这些‘反向重复’的非内含子间隔序列形成。可选地，在间隔序列是内含子间隔序列的实施方案中，内含子/外显子剪接点序列在内含子序列的任一侧的存在促进会以其他方式形成环结构的序列的去除，并且得到的RNA将形成双链RNA(dsRNA)分子，在一个末端或两个末端具有任选的突出的3’序列。此类dsRNA转录物在本文中被称为“完全发夹”。RNA分子可以包含单个发夹或者多个发夹，所述单个发酵或多个发夹包括毗邻双链RNA序列区域存在的单链RNA的“凸出(bulge)”。

可选地，如上文所描述的dsRNA可使用包含靶向序列的反向互补物的另外的多核苷酸便利地获得，从所述另外的多核苷酸可以产生另外的RNA分子。在该实施方案中，靶向区域的反向互补物与从第二多核苷酸转录的RNA分子的靶向区域杂交。

在另一个实例中，如上文所描述的dsRNA分子使用包含双链体的第二多核苷酸制备，在所述第二多核苷酸中双链体的一条链与靶基因的核苷酸序列共有序列同一性，并且另一条链与该核苷酸序列的互补物共有序列同一性。在该实施方案中，双链体的侧翼为两个启动子，一个启动子控制链中的一条的转录，并且另一个启动子控制互补链的转录。两条链的转录产生一对RNA分子，每个RNA分子包含与另一个的区域互补的区域，从而产生抑制育性基因表达的dsRNA分子。

在另一个实例中，育性基因的PTGS使用由Glassman等在美国专利申请公开号2003/003619中描述的策略实现。在该策略中，适当的核酸序列及其反向互补物可被用于改变靠近所述适当的核酸序列及其反向互补物的任何同源的内源性靶RNA(即，包含育性基因的转录物的)的表达。适当的核酸序列及其反向互补物可与宿主中的任何内源性RNA不相关，或者可由宿主的基因组中的任何核酸序列编码，条件是核酸序列不编码任何靶mRNA或者与靶RNA基本上相似的任何序列。因此，在本发明的一些实施方案中，RNA分子还包含两个互补的RNA区域，所述两个互补的RNA区域与宿主细胞中的任何内源性RNA不相关并且靠近靶向区域。在其它实施方案中，RNA分子还包含两个互补的RNA区域，所述两个互补的RNA区域由宿主的基因组中的任何核酸序列编码，条件是该序列与育性基因的核苷酸序列不具有序列同一性，其中该区域靠近靶向区域。在以上实施方案中，互补RNA区域中的一个可位于靶向区域的上游并且另一个位于靶向区域的下游。可选地，两个互补区域均可位于靶向区域的上游或下游，或者可位于靶向区域自身内。

在一些实施方案中，RNA分子是靶向由育性基因编码的RNA的对于翻译至关重要的特定区域的反义分子。反义分子降低预定基因的表达水平的用途是本领域已知的。反义分子可以被设计为对应于从育性基因转录的全长RNA或其片段或一部分。如例如上文所描述的(参见，例如，Waterhouse等，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:13959 13964)，该基因沉默效应可通过转基因地过度产生育性基因编码序列的有义和反义RNA以使得产生大量的dsRNA来增强。

在仍然其它的实施方案中，育性基因破坏物分子是与育性基因的多肽产物免疫相互作用的抗体。在这种类型的非限制性实例中，多肽产物是由在表2中和本文其他处所列出的育性基因编码的多肽产物。用于在本发明的实践中使用的示例性抗体包括单克隆抗体、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)₂免疫球蛋白片段，以及合成的抗体，诸如但不限于单结构域抗体(DAB)、合成的稳定化的Fv片段，例如，单链Fa片段(scFv)、二硫化物稳定化的Fv片段(dsFv)、单可变区结构域(dAb)微抗体、组合抗体(combibody)和多价抗体诸如双价抗体和多价-scFv或者工程化的人类等同物。用于制备和使用基于多种抗体的构建体和片段的技术是本领域公知的。用于制备和表征抗体的方法也是本领域公知的。在示例性实例中，可使用在从噬菌体展示或核糖体展示文库(例如，从Cambridge Antibody Technology,Biolnvent,Affitech and Biosite可得)选择之后通常在大肠杆菌中表达的分离、纯化或重组的肽或蛋白质通过常规免疫(例如，多克隆血清和杂交瘤)来制备抗体，所述分离、纯化或重组的肽或蛋白质对应于育性基因的多肽产物的至少一部分，或作为对应于育性基因的多肽产物的至少一部分的重组片段。此类抗体的抗原结合区(例如互补性决定区)的知识可以被用于制备如例如上文所描述的合成的抗体。

3.2用于产生具有破坏的育性基因的非人类胚胎的系统

根据本发明，系统被用于产生具有破坏的育性基因的非人类宿主胚胎。例如，包含破坏的育性基因的非人类胚胎可以通过使1)携带可破坏的育性基因的第一动物品系(“条件性不育品系”)与2)携带包含破坏物核苷酸序列的不育性激活转基因的第二动物品系(“不育激活品系”)杂交产生，所述破坏物核苷酸序列编码破坏可破坏的育性基因的育性基因破坏物分子，从而产生包含具有破坏的育性基因的生殖细胞的转基因非人类宿主胚胎。在一些实施方案中，使第一动物品系的雌性成员与第二动物品系的雄性成员杂交。如本文使用的，第一和第二动物品系的各自的成员是非人类动物繁殖对的繁殖配偶。

在一些实施方案中，条件性不育品系的育性基因为转基因的形式(“条件性不育转基因”)，其中育性基因与启动子并且与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在重组酶的存在下允许育性基因的破坏。在这些实施方案中，不育激活转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列，并且重组酶识别位点通常位于育性基因内或邻接育性基因，并且介导育性基因的破坏。在这种类型的非限制性实例中，由不育激活品系的不育激活转基因编码的重组酶是Cre，并且在条件性不育品系的条件性不育转基因中包含的重组酶识别位点是loxP序列。在示例性的实例中，使条件性不育转基因纯合的条件性不育品系的雌性成员与不育激活转基因纯合的不育激活品系的雄性成员杂交产生具有至少一些生殖细胞具有杂合的育性基因破坏的非人类动物胚胎。在有利的实例中，条件性不育品系的育性基因位于X染色体上(即，X-连锁的育性基因)，并且使条件性不育转基因纯合的条件性不育品系的雌性成员与不育激活转基因纯合的不育激活品系的雄性成员杂交产生具有至少一些生殖细胞具有纯合的育性基因破坏的非人类动物胚胎，包括雄性胚胎。

在其它实施方案中，通过使以下(1)与(2)杂交：(1)第一动物品系，所述第一动物品系携带(a)包含第一可破坏的育性基因的第一条件性不育转基因和(b)包含破坏第二可破坏的育性基因的基因的第一不育激活转基因(“第一条件性不育激活品系”)；(2)第二动物品系，所述第二动物品系携带(a)包含第二可破坏的育性基因的第二条件性不育转基因和(b)包含破坏第一可破坏的育性基因的基因的第二不育激活转基因(“第二条件性不育激活品系”)，其中第一不育激活转基因特异性地破坏所述第二可破坏的育性基因，并且其中第二不育性激活转基因特异性地破坏第一可破坏的育性基因，从而产生包含具有破坏的育性基因的生殖细胞的非人类宿主胚胎，来产生包含破坏的育性基因的非人类宿主胚胎。除了在不育激活转基因的存在下介导第一和第二可破坏的育性基因的破坏的第一和第二条件性不育转基因的元件之外，条件性不育转基因的育性基因适当地为相同或相当的基因。在这些实施方案中，使第一条件性不育转基因和第一不育激活转基因为纯合的第一条件性不育激活品系的繁殖配偶与第二条件性不育转基因和第二不育激活转基因为纯合的第二条件性不育激活品系的繁殖配偶杂交产生具有至少一些生殖细胞具有纯合的育性基因破坏的非人类动物胚胎。在一些实施方案中，使第一动物品系的雌性成员与第二动物品系的雄性成员杂交。在其他实施方案中，使第一动物品系的雄性成员与第二动物品系的雌性成员杂交。

在一些实施方案中，第一条件性不育转基因包含与启动子并且与第一重组酶识别位点可操作连接的第一可破坏的育性基因，所述第一重组酶识别位点在第一重组酶的存在下介导第一可破坏的育性基因的破坏，并且第一不育激活转基因包含与启动子可操作连接的第二重组酶的编码序列，其中第二重组酶特异性地识别第二重组酶识别位点。第二条件性不育转基因适当地包含与启动子并且与第二重组酶识别位点可操作连接的第二可破坏的育性基因，所述第二重组酶识别位点在第二重组酶的存在下介导第二可破坏的育性基因的破坏，并且第二不育激活转基因包含与启动子可操作连接的第一重组酶的编码序列，其中第一重组酶特异性地识别第一重组酶识别位点。在这种类型的示例性实例中，由第一不育激活转基因编码的第二重组酶是FLP，第一条件性不育转基因中包含的重组酶识别位点是loxP序列，由第二不育激活转基因编码的第一重组酶是Cre，第二条件性不育转基因中包含的重组酶识别位点是Frt序列。在其它示例性实例中，由第一不育激活转基因编码的第二重组酶是Cre，第一条件性不育转基因中包含的重组酶识别位点是Frt序列，由第二不育激活转基因编码的第一重组酶是FLP，并且第二条件性不育转基因中包含的重组酶识别位点是loxP序列。

在一些实施方案中，由第一不育激活转基因编码的第二重组酶是FLP，第一条件性不育转基因中包含的靶位点是loxP序列，由第二不育激活转基因编码的第一重组酶是Cre，并且第二条件性不育转基因中包含的靶位点是Frt序列。在这些实施方案中，使第一条件性不育转基因和第一不育激活转基因为纯合的第一条件性不育激活品系的雌性成员与第二条件性不育转基因和第二不育激活转基因为纯合的第二条件性不育激活品系的雄性成员杂交，产生具有至少一些生殖细胞具有纯合的育性基因破坏的非人类动物胚胎。

在仍然其它的实施方案中，包含破坏的育性基因的非人类胚胎可以通过使以下1)与2)杂交产生：1)第一动物品系，所述第一动物品系携带可破坏的育性基因(“条件性不育品系”)；2)第二动物品系，所述第二动物品系携带包含破坏物核苷酸序列的不育激活转基因，所述破坏物核苷酸序列编码破坏可破坏的育性基因的育性基因破坏物分子(“不育激活品系”)，其中育性基因破坏物选自抑制性核酸(例如，抑制性RNA诸如有义或反义RNA，介导RNA干扰的分子诸如siRNA、shRNA、miRNA；等)、抑制性多肽(例如，抗体、多肽-结合伴侣、显性负性多肽、酶等)或抑制育性基因的活性或者育性基因的表达产物的水平或功能活性的任何其它分子。在这些实施方案中，不育激活转基因适当地包含与破坏物核苷酸序列可操作连接的表达调节元件，其中该元件条件性地抑制破坏物核苷酸序列的表达，并且条件性不育品系携带抑制该表达调节元件的活性的激活子转基因，导致破坏物核苷酸序列的表达。

因此，当条件性不育品系的繁殖配偶与不育激活品系的繁殖配偶杂交时，将产生如下胚胎：其中激活子转基因被表达，导致表达调节元件的抑制并导致破坏物核苷酸序列的表达的去抑制，产生育性基因破坏物分子，从而导致育性基因的破坏。在这些实施方案中，激活子转基因为纯合的条件性不育品系的繁殖配偶与不育激活转基因为纯合的不育激活品系的繁殖配偶的杂交产生具有至少一些生殖细胞具有纯合的育性基因破坏的非人类动物胚胎。

在一些实施方案中，在第一条件下表达调节元件抑制破坏物核苷酸序列的转录，并且在第二条件下表达调节元件的破坏可以允许或增强破坏物核苷酸序列的转录。在一些实施方案中，表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列抑制破坏物核苷酸序列的表达并且与重组酶识别位点可操作连接，其中重组酶识别位点在重组酶的存在下介导抑制子核苷酸序列的破坏。在这种类型的示例性实例中，第二繁殖配偶包含激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列。第二繁殖配偶的育性基因适当地为野生型基因。在一些实施方案中，第一繁殖配偶是雄性，并且第二繁殖配偶是雌性。

在这种类型的示例性实例中，通过使破坏物核苷酸序列与可诱导的转录调控系统可操作性地连接来条件性地表达破坏物核苷酸序列。从激活子转基因产生的反式激活子与被工程化为与破坏物核苷酸序列可操作连接的调控元件的序列特异性地相互作用，以在激活子转基因的表达产物的存在下诱导该核苷酸序列的转录。因此，在这些实施方案中，激活子转基因通常包含编码转录诱导物的核酸序列，并且表达调节元件包含转录诱导物的结合位点，所述结合位点与破坏物核苷酸序列的启动子可操作连接，由此转录诱导物的产生引起破坏物核苷酸序列的表达以及育性基因破坏物分子的水平或功能活性的增加或升高。在这种类型的代表性实例中，转录诱导物包含(a)至少一个转录激活结构域，和(b)至少一个DNA结合结构域，所述DNA结合结构域结合与破坏物核苷酸序列可操作连接的启动子或者以其他方式与所述启动子相互作用，并且DNA结合结构域与所述启动子相互作用以激活破坏物核苷酸序列的转录。在操作中，激活子转基因的转录导致转录诱导物的产生，所述转录诱导物继而经由其DNA结合结构域与破坏物核苷酸序列的启动子相互作用，并且经由其转录激活结构域与转录机制相互作用以激活破坏物核苷酸序列的转录，这导致育性基因破坏物分子的水平或功能活性的增加或升高。

转录激活结构域的非限制性实例包括HSV1-VP16的酸性反式激活结构域(TAD)(例如，氨基酸406至488，Triezenberg等,1988,Genes&Development 2:718-729；Triezenberg,1995,Current Opinions in Genetics and Development 5:190-196；或氨基酸413至490,Regier等,1993,Proc Natl Acad Sci U S A.90(3):883-887；或氨基酸411至487；或氨基酸453-499；或氨基酸413至454；或氨基酸410-452,Walker等,1993,Mol Cell Biol.13(9):5233-5244；氨基酸411至455,Nettelbeck等,1998,Gene Ther.5(12):1656-1664)、Oct-2的激活结构域(例如，氨基酸438至479,Tanaka等,1994,Mol Cell Biol.14(9):6046-6055；或氨基酸3至154,Das等,1995,Nature.374(6523):657-660)、SP1的激活结构域(例如，氨基酸340至485,Courey和Tijan,1988,Cell.55(5):887-898)、NFY的激活结构域(例如，氨基酸1至233,Li等,1992,J Biol Chem.267(13):8984-8990；van Hujisduijnen等,1990,EMBOJ.9(10):3119-3127；Sinha等,1995,Proc Natl Acad Sci U S A.92(5):1624-1628；Coustry等1995,J Biol Chem.270(1):468-475)、ITF2的激活结构域(例如，氨基酸2至452，Seipel等,1992,EMBO J.l l(13):4961-4968)、c-Myc的激活结构域(例如，氨基酸1至262,Eilers等1991,EMBO J.10(1):133-141)、CTF的激活结构域(例如，氨基酸399至499，Mermod等,1989,Cell 58(4):741-753；Das和Herr,1993,J Biol Chem 268(33):25026-25032)或P65的激活结构域(例如，氨基酸286-550)。在一些实施方案中，DNA结合结构域选自Gal4蛋白的DNA结合结构域(例如，氨基酸1至147，Chasman和Komberg,1990,Mol Cell Biol.10(6):2916-2923)、LexA蛋白的DNA结合结构域(例如，氨基酸1至81，Kim等,1991,Science10；255(5041):203-206；或氨基酸2-202；或完整的LexA蛋白例如，氨基酸1至202，Brent和Ptashne,1985,Cell 43(3Pt 2):729-736)、lac阻遏物(LacI)蛋白的DNA结合结构域(例如，Brown等,1987,Cell 49(5):603-612；Fuerst等,1989,Proc Natl Acad Sci U S A.86(8):2549-2553)、四环素阻遏物(TetR)蛋白的DNA结合结构域(例如，Gossen等,1992,Proc NatlAcad Sci U S A.89(12):5547-5551；Dingermann等,1992,EMBO J.11(4):1487-1492)或ZFHD1蛋白的DNA结合结构域(例如，Pomerantz等,1995,Science 267(5194):93-96)。将核定位信号(NLS)添加到DNA结合结构域的3’末端一般是有利的。

与破坏物核苷酸序列可操作连接的启动子适当地包含转录诱导物与其相互作用的顺式作用序列。顺式作用序列包含转录诱导物、并且特别地其DNA结合结构域的结合序列。因此，结合序列取决于表达系统所使用的转录因子的DNA结合结构域的选择，并且包括，但不限于：(A)Gal4蛋白的结合序列，诸如但不限于：如例如由Chasman和Kornberg(1990，同上)所描述的核苷酸序列：5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'[SEQ ID NO:3]；或核苷酸序列：5'-CGGAGGACTGTCCTCCG 3'[SEQ ID NO:4]；或如例如由Giniger等(1988,Proc Natl Acad SciU S A.85(2):382-386)所公开的核苷酸序列：5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3'[SEQ ID NO:5]；(B)Gal4蛋白的结合序列，诸如但不限于：核苷酸序列：5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'[SEQID NO:6]；或如例如由Brent和Ptashne(1984,Nature 312(5995):612-615)所公开的LexA操纵子；(C)lac操纵子，诸如但不限于如例如由Fuerst等(1989，同上)和Simons等(1984,Proc Natl Acad Sci U S A.81(6):1624-1628)所描述的LacI阻遏物蛋白与其结合的核苷酸序列：5'-GAATTGTGAGGCTCACAATTC-3'[SEQ ID NO:7]；(D)四环素操纵子(tet0)，诸如但不限于四环素阻遏物(TetR)蛋白与其结合的核苷酸序列：5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'[SEQ ID NO:8]；(E)ZFHD-1蛋白的结合序列，诸如但不限于：如例如由Pomeranz等(1995,同上)所描述的核苷酸序列：5'-TAATGATGGGCG-3'[SEQ ID NO:9]；(F)c-Myc蛋白的结合序列，诸如但不限于：5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3'[SEQ ID NO:10]。

在其它实施方案中，破坏物核苷酸序列的条件性表达受到被用于开启该序列的表达的重组酶系统的调控。在这种类型的非限制性实例中，重组酶系统包含插入到启动子和破坏物核苷酸序列之间的间插序列，所述间插序列抑制或者以其他方式破坏破坏物核苷酸序列从启动子的转录。适当地，间插序列包含抑制(inhibit)或者以其他方式阻抑(suppress)下游序列的转录的转录终止子。期望地，间插序列包含重组酶识别位点，所述重组酶识别位点被由激活子转基因编码的位点特异性重组酶特异性地识别，以在重组酶的存在下破坏间插序列并且从而使得破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接并且允许该序列的转录。可选地，重组酶系统包含分离的或分开的转基因，所述转基因包含破坏物核苷酸序列的上游部分和下游部分以及插入到上游部分和下游部分之间的可切除的间插序列。上游部分与启动子可操作连接，但是间插序列抑制或者以其他方式阻抑下游部分的转录，从而阻止功能性育性基因破坏物分子的表达。通过破坏物核苷酸序列的表达，位点特异性重组酶的产生切除可切除的间插序列，以从而得到允许产生功能性育性基因破坏物分子的可转录的全长破坏物核苷酸序列。

因此，在一些如上所述的有利的实施方案中，杂交将导致非人类胚胎的产生，所述非人类胚胎包含在其种系中的育性基因的破坏，在所述非人类胚胎中适当地育性基因的两个等位基因均被破坏，并且在所述非人类胚胎中能育性(例如，精子发生或精子功能)被抑制。

本发明还扩展至如上文和本文其他处广泛描述的非人类动物的繁殖对。

3.3供体多能细胞

供体多能细胞通常能够分化为生殖细胞，诸如ES细胞、epi干细胞、EG细胞和iPS细胞。在特定的实施方案中，多能细胞是ES细胞。供体多能细胞可以被遗传修饰并且在这种类型的示例性实例中包含转基因。转基因可以使用促进将转基因引入到多能细胞的基因组中的载体被引入多能细胞中(例如通过随机整合或者同源重组)，用于转基因的示例性方法在Transgenic Mouse:Methods and Protocols(Hofker,MH.,2003.Methods Mol Biol.209:1-8)、Advanced Protocols for Animal Transgenesis(2011,由S.Pease和T.L.Saunders编辑,Springer Protocols Handbooks)和Transgenic Animals,Generation and Use(1997,由L.M,Houdebine编辑,Hardwood Academic Publishers)中公开。

供体多能细胞可以是雄性多能细胞(XY)或者雌性多能细胞(XX)，或者XO多能细胞。在特定的实施方案中，供体多能细胞是雄性多能细胞。雄性(XY)、雌性(XX)和XO多能细胞可使用任何适当的技术被引入植入前宿主胚胎中。

可将来自非人类哺乳动物的一个物种的供体多能细胞引入非人类哺乳动物的不同的物种的宿主中，以产生源自供体多能细胞的生殖细胞。在这种类型的示例性实例中，供体多能细胞源自非人灵长类动物、马科动物诸如马、绵羊、山羊、兔形目动物诸如兔子、狗、猫、牛、动物园动物以及濒危或外来哺乳动物。在一些实施方案中，供体多能细胞是iPS细胞。

3.4非人类宿主胚胎

可以用于引入多能细胞的非人类宿主胚胎包括任何非人类动物物种的胚胎，所述非人类动物物种包括非人类哺乳动物，诸如非人灵长类动物和啮齿动物。根据本发明的一些实施方案，非人类宿主胚胎是啮齿动物胚胎、特别地小鼠或大鼠胚胎。一般地，非人类宿主胚胎来自与全能细胞相同的物种。但是，在一些实施方案中，非人类宿主胚胎来自与多能细胞不同的动物物种(例如，不同的哺乳动物物种)。其中引入多能细胞的非人类宿主胚胎通常是植入前非人类宿主细胞，包括为2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、16-细胞期、32-细胞期、64-细胞期胚胎的胚胎、桑椹胚或囊胚。在一些实施方案中，植入前非人类宿主胚胎选自桑椹胚前期和桑葚胚期、未密实的桑葚胚期、密实的桑葚胚期和囊胚期胚胎。在一些实施方案中，植入前非人类宿主胚胎选自小鼠胚胎的胚龄期E1、E1.5、E2、E2.5、E3和E3.5。适当地，植入前非人类宿主胚胎选自具有选自以下的发育期的宿主胚胎：参考由TheilerSpringer-Verlag,NY在Theiler(1989)The House Mouse:Atlas of Mouse Development中描述的Theiler期，Theiler期2(TS2)、TS3、TS4、TS5和TS6。在特定的实施方案中，植入前非人类宿主胚胎选自Theiler期TS3、TS4和TS5。在其它特定的实施方案中，植入前非人类宿主胚胎是桑椹胚。在仍然其它特定的实施方案中，植入前非人类宿主胚胎是囊胚。

通常，将一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个)供体多能细胞引入植入前非人类(例如，小鼠或大鼠)宿主胚胎中，所述植入前非人类宿主胚胎适当地为2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、16-细胞期、32-细胞期、64-细胞期胚胎、桑椹胚或囊胚。在一些实施方案中，宿主植入前胚胎是囊胚并且被引入的供体多能细胞的数目是6至12个细胞。在这种类型的示例性实例中，宿主胚胎是8-细胞期胚胎并且供体多能细胞的数目是2至10个细胞。

3.5多能细胞向宿主胚胎中的引入

可以使用任何适当的方法将供体多能细胞引入植入前非人类宿主胚胎中。例如，使用精细拉长的玻璃针(20-25微米内径)选择单一的供体多能细胞的组，并使用装配有用于囊胚的微操作器的倒置显微镜将其引入通过早期胚胎的胚胎透明带并进入囊胚腔(囊胚腔(blastocoel))中。每囊胚或8-细胞期胚胎注射9-10个干细胞(ES或iPS或epi干细胞)，每4-细胞期胚胎注射6-9个干细胞，并且每2-细胞期胚胎注射约6个干细胞。可以使用激光或者压电式脉冲钻孔的开口的透明带辅助干细胞注射。(参见Kraus等,2010,Genesis 48:394-399)。可选地，可使干细胞与桑椹胚聚合，或者注射到具有或不具有透明带的早期胚胎(例如2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚前期或桑椹胚)中。

3.6胚胎、嵌合动物和后代的孕育

根据标准方法学在适于胚胎的发育的条件下进行孕育胚胎。将包含供体多能细胞的非人类胚胎移植到本领域已知的假孕雌性中(参见，Manipulating the Mouse Embryo:ALaboratory Manual,第三版(A.Nagy等2002,CSHL Press,ISBN-10:0879695919；Nagy等,1990,Development 110,815-821；美国专利号7,576,259、美国专利号7,659,442、美国专利号7,294,754、Kraus等2010,Genesis 48,394-399)。简言之，在特定的啮齿动物实施方案中，使6-8周龄的能生育的雌性啮齿动物与切除输精管的或不育的啮齿动物雄性交配以诱导易接受支持人工引入的啮齿动物胚胎的激素状态(hormonalstate)。此类雌性被称为假孕。在2.5dpc，将包含最多至15个干细胞的囊胚引入(移植)到子宫角中。对于早期胚胎和桑椹胚，根据进入输卵管的胚胎期，将此类胚胎在体外培养至移植到0.5dpc或1.5dpc的假孕雌性中。

在转移后，从移植的非人类胚胎发育的嵌合非人类动物发育成型，出生取决于移植时的胚胎期和物种。通过该方法产生两种类型的嵌合非人类动物：包含通常源于非人类宿主胚胎、具有破坏的育性基因的内源性生殖细胞或配子的那些嵌合非人类动物；和包含通常源于供体多能细胞、具有功能性育性基因的生殖细胞或配子的那些嵌合非人类动物。

当使这些嵌合非人类动物与包含功能性育性基因的同类非人类动物杂交以产生后代时，包含具有破坏的育性基因的内源性生殖细胞或配子的嵌合非人类动物将具有受损的或被抑制的能育性，并且因此将不产生后代或者产生非常少的后代。但是，包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的嵌合非人类动物将具有正常的或未受损的能育性，从而增强包含源自供体多能细胞的生殖细胞或配子的第一窝后代的产生。

标准分析工具可以被用于测试精子或后代的一致性。方法包括，但不限于，测序、DNA印迹分析、SNP分析、PCR技术以及蛋白质标志物、毛色标记、同工酶分析(例如，GPI、葡萄糖磷酸异构酶同工酶分析)和使用本领域已经确立的标准方法检测存在于干细胞中的任何报告基因或转基因。

可以收集第一窝后代的配子并用于体外授精(IVF)或人工授精(AI)。从第一窝后代分离的配子还可被冷冻保存并利用本领域已知的方法贮存。可选地，可收集第一窝后代的生殖细胞、在体外或体内成熟、并用于体外受精或人工授精。

IVF方法学被良好地建立。参见，例如，Nagy等(2002,Manipulating the MouseEmbryo:A Laboratory Manual,第三版,CSHL Press)。IVF一般包括：分别从雌性和雄性收集卵母细胞和精子，用来自雄性的精子使来自雌性的卵母细胞受精，以及将所得到的受精的卵母细胞在对于使受精的卵母细胞发育为胚胎合适的条件下维持。可以在不同阶段收获胚胎。可以在收集卵母细胞用于IVF之前使雌性超数排卵。受精可以通过IVF、胞浆内精子注射或透明带钻孔来完成。参见，例如，Nagy等(2002,同上)；Byers等(2006,Theriogenology65:1716-26)；Ostermeier等(2008,PLOS One 3(7):e2792)。IVF可以是增加从单个雌性获得的胚胎数目的有用工具。

胞浆内精子注射(ICSI)可以被用于提高受精率或者实现受精。ICSI程序包括去除卵母细胞周围的卵丘细胞和通常通过玻璃移液管将精子或单倍体精细胞注射到卵母细胞中(参见，Kimura等,1995,Biol Reprod.53(4):855-62)。精细胞、精原干细胞和雄性生殖细胞可以在体外分化并且然后被用于ICSI(Marh等,2003,Biol Reprod 69(1):169-76；Movahedin等,2004,Andrologia 36(5):269-76；Ogura等,1996,J Assist ReprodGenet.13(5):4-31-4；Shinohara等,2002,Hum Reprod 17(12):3039-45；Chuma等,2005,Development 132(1):117-22)。

作为从雌性收集成熟卵母细胞用于IVF的替代方法，可以获得未成熟的卵母细胞，并允许其在体外成熟，该技术被称为“体外成熟”。在其它实施方案中，可以从雌性分离卵泡，例如，初级卵泡或生殖细胞，并在体外培养以获得可用于受精的卵母细胞。在哺乳动物中，只有一小部分未成熟的卵母细胞发育为成熟的卵母细胞；其余的退化并死亡。通过从动物分离未成熟的卵母细胞并允许它们在体外成熟，技术人员能够在短时间段内从给定的雌性获得多很多的适用于IVF的卵母细胞。已知哺乳动物卵母细胞经历体外成熟。在小鼠、牛和其它哺乳动物的情况中，体外成熟的卵母细胞已被体外受精并且当胚胎被转移到适当的子宫中时产生正常健康的后代(Schroeder等,1984,Dev.Biol.102:493；Sirard等,1988,Biol,Reprod.39:546)。体外成熟技术是本领域公知的。参见，例如，Chiu等(2003,HumanReprod.18:408-416)和O'Brien等(2003,Biol.Reprod.68:1682-1686)。

人工授精是通过人工注射或应用精子使雌性动物受精的方法。在此类程序中，在授精时雄性动物不是必需的；可使用从动物获得的贮存的精子(参见，Wolfe,1967,LabAnirn Care 17(4):426-32和Sato等,2002,J Assist Reprod Genet.19(11):523-30)。

可被用于从第一窝后代产生活的后代的其它方法包括外科手术卵母细胞取回，卵巢转移，卵巢分裂，卵巢碎片转移，卵母细胞、卵泡、精原干细胞的体外成熟，生殖细胞的体外分化和原始细胞的体外分化。

在一些实施方案中，收集雄性第一窝后代的配子。在其它实施方案中，收集雄性第一窝后代的生殖细胞或精原多能细胞。在其它实施方案中，冷冻保存配子、生殖细胞或精原多能细胞。在其它实施方案中，使用雌性第一窝后代以通过繁殖产生后代。在仍然其它的实施方案中，分离雌性第一窝后代的配子。在这种类型的示例性实例中，分离雌性第一窝后代的卵巢。在其它示例性实例中，冷冻保存雌性第一窝后代的配子或卵巢。

为了本发明可以被容易地理解并使生效，现将通过以下非限制性实施例的方式描述特别优选的实施方案。

实施例

实施例1

条件性GILZ(Tsc22d3)敲除小鼠的产生

构建靶向载体，以通过同源重组使小鼠Tsc22d3(ENSMUSG00000031431)基因的外显子4(ENSMUSE00000815383)的侧翼为loxP位点。Cre-重组酶介导的loxP位点的重组导致(例如，具有以下Vega登录号OTTMUST00000045354的转录物Tsc22d3-006的)外显子4的缺失。外显子4的CDS编码TSC22(PF01166)结构域的完整序列。靶向载体的示意图在图1中示出。

将用于在ES细胞中选择的新霉素选择盒(neo)插入到外显子4的下游。选择盒的侧翼为FRT位点以使能够被FLP介导的重组去除。将单个loxP位点插入到外显子4的上游和选择盒的下游。载体的5’和3’同源臂分别为大约8.0kb和6.0kb。

使线性化的靶向载体经电穿孔进入Bruce4ES细胞中。选择新霉素抗性克隆，并通过DNA印迹分析筛选以鉴定正确靶向的克隆。将这些克隆注射到BALB/c囊胚中，随后将所述BALB/c囊胚转移到假孕的CBB6F1代孕雌性中。使得到的嵌合体与C57BL/6雌性杂交。通过毛色对它们的后代进行选择，并通过DNA印迹分析对其进行另外的分析。通过使靶小鼠与C57BL/6FLPe-重组酶品系杂交去除新霉素盒。

实施例2

使用雌性Tsc22d3条件性敲除小鼠作为胚囊供体产生靶小鼠

用孕马血清注射C57BL/6背景的21至25日龄Tsc22d3条件性敲除的雌性小鼠。两天后用人绒膜促性腺激素注射小鼠，并使其与C57BL/6Cre-重组酶雄性交配持续24小时。六天后，从Tsc22d3条件性敲除的雌性取出第一注射囊胚。将这些囊胚用作靶BALC/c ES细胞的微注射的接受者并且将微注射的囊胚转移到假孕的CBB6F1代孕雌性中。使得到的嵌合体与BALB/c雌性杂交。预期源自囊胚细胞的具有睾丸的雄性嵌合体是不育的。

实施例3

作为囊胚供体的条件性敲除小鼠的产生

育性基因ROSA26等位基因变体A的条件性敲除体含有编码破坏物分子(例如，具有作为靶的育性基因的转录物的shRNA，针对由育性基因编码的蛋白质的抗体，等)的核苷酸序列。侧翼为LoxP(floxed)的终止盒抑制破坏物分子的表达。用于产生靶ROSA26等位基因A的示例性靶向载体在图2中示出。

ROSA26等位基因变体B含有Cre重组酶的CDS。用于产生靶ROSA26等位基因B的靶向载体的非限制性实例在图3中示出。

繁殖配偶一的ROSA26等位基因变体A是纯合的。

繁殖配偶二的ROSA26等位基因变体B是纯合的。

繁殖配偶一可以是雄性或者雌性。繁殖配偶二反之亦然。

如例如在图4中所示出的，从繁殖配偶一与繁殖配偶二的杂交得到的后代将产生具有一个ROSA26等位基因变体A和一个ROSA26等位基因变体B的胚胎。ROSA26等位基因变体B的重组酶将去除ROSA26等位基因变体A中的终止(STOP)盒，并且将从而起始破坏物分子的表达。破坏物分子现将导致靶育性基因的功能敲除。

实施例4

多能性细胞向具有靶育性基因的胚胎中的引入和第一窝后代的产生

材料&方法

用孕马血清(PMS)注射21-25日龄的C57BL/6Tsc22d3conKO/conKO雌性小鼠或雌性wt对照小鼠(在靶Bruce4C57BL/6ES-细胞的情况中BALB/c x C57BL/6白化刺鼠，并且在靶BALB/c ES-细胞的情况中C57BL/6)。两天后应用人绒膜促性腺激素的随后注射。在同一天使C57BL/6Tsc22d3conKO/conKO雌性小鼠或wtBALB/c x C57BL/6白化刺鼠小鼠(对照)分别与在ROSA26基因座中具有Cre重组酶的敲入(KI)的雄性小鼠或雄性wt小鼠(对照)(雄性对照小鼠的背景在靶BALB/c ES-细胞的情况中是C57BL/6，并且在靶Bruce4C57BL/6ES-细胞的情况中是BALB/c)交配。第二天将交配配偶分开。分开后三天收获交配得到的囊胚，并将所述囊胚用于靶BALB/c和Bruce4C57BL/6ES细胞的注射。将改造的囊胚转移到CBB6F1接受者中。大约9周后，使雄性嵌合后代在靶BALB/c细胞的情况中与雌性BALB/c小鼠交配，并且在靶Bruce4C57BL/6细胞的情况中与雌性C57BL/6小鼠交配。在10日龄时评价后代的毛色，并在21日龄时通过DNA印迹分析对后代基因分型。

结果

靶BALB/c ES-细胞系的注射

将经注射的Tsc22d3KO/KO囊胚转移到三个接受者中，并产生16个嵌合体，16个嵌合体中的11个是雄性，将11个雄性用于另外的繁殖。低百分比的5个嵌合体不产生后代。其余的6个嵌合体总共产生181只幼崽。这些动物中的146只被用于评价毛色，35只未被确定。如对源自靶BALB/c ES-细胞的动物预期的，所有146只评价的动物(100％)具有白色毛色(参见，图5)。

用DNA印迹分析对这些146只动物中的63只进行基因分型(参见，图6，DNA印迹)。31只(49％)动物被确定为wt/靶小鼠，并且32只(51％)被确定为wt/wt小鼠。

作为对照，还将相同的BALB/c ES-细胞系注射到wt BALBx C57BL/6白化囊胚中，并将所述囊胚转移到14个接受者中。这产生总共6个嵌合体，所述6个嵌合体中的5个是雄性并且1个是雌性。5个雄性嵌合体产生总共155只幼崽。这些动物中的119只被用于评价毛色。60只(50％)小鼠具有白色毛色(ES细胞衍生的)，并且59只(50％)具有刺鼠毛色(囊胚衍生的)。

靶C57BL/6Bruce4ES-细胞系的注射

将经注射的Tsc22d3KO/KO囊胚转移到两个接受者中，并产生总共3个嵌合体，所述3个嵌合体中的3个是雄性。嵌合体总共产生10只幼崽。由于Tsc22d3KO/KO囊胚(其被用于产生嵌合体)的背景是C57BL/6xBALB/c Fl，并且注射的ES细胞基于Bruce4C57BL/6背景，基于毛色的基因分型是不可能的。相反，通过DNA印迹分析对8只小鼠基因分型，所述8只小鼠中的4只(50％)被确定为wt/靶小鼠，并且4只(50％)被确定为wt/wt小鼠。这与wt/靶小鼠对wt/wt小鼠的比率完全相关，如果嵌合体的后代仅源自靶ES-细胞，这是所预期的。

作为对照，还将相同的Bruce4C57BL/6ES-细胞注射到wt BALB/c x C57BL/6白化刺鼠囊胚中，并将所述囊胚转移到11个接受者中。这产生总共13个嵌合体，所述13个嵌合体中的8个是雄性，并且5个是雌性。8个雄性嵌合体产生总共324只幼崽。这些动物中的149只被评价毛色。52只(35％)小鼠具有黑色毛色(ES细胞衍生的)，并且97只(65％)具有刺鼠毛色(囊胚衍生的)。

因此，使用Tsc22d3KO/KO囊胚作为遗传修饰的ES-细胞系的宿主显著改进了遗传修饰到后代动物的种系传递。遵照该实验，携带不同遗传修饰的8种其它ES-细胞系已经实现了种系传递的可比较的改进。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用以其全文并入本文。

本文中任何参考的引用不应该被理解为承认此类参考是作为本申请的“现有技术”可得的。

贯穿说明书，目的是描述本发明的优选实施方案，而并非将本发明限制于任何一个实施方案或者特定的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在示例的特定实施方案中可以进行多种改变和变化，而不偏离本发明的范围。意欲将所有此类改变和变化包含在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种植入前非人类宿主胚胎(例如，囊胚)，所述植入前非人类宿主胚胎包含在其种系中的破坏的育性基因。

2.根据权利要求1所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述育性基因的两个等位基因均被破坏。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述育性基因位于性染色体上。

4.根据权利要求1至3的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述性染色体是X染色体。

5.根据权利要求1至3的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述性染色体是Y染色体。

6.根据权利要求1至5的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述破坏的育性基因抑制雄性能育性。

7.根据权利要求1至6的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述育性基因调节精子的能育性。

8.根据权利要求1至7的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述育性基因调节精子发生。

9.根据权利要求1至8的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述育性基因是GILZ。

10.根据权利要求9所述的植入前非人类宿主胚胎，所述植入前非人类宿主胚胎还包含供体多能细胞，所述供体多能细胞包含缺乏破坏的育性基因。

11.根据权利要求10所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述多能细胞是雄性多能细胞。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述多能细胞是干细胞。

13.根据权利要求12所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述干细胞是胚胎干(ES)细胞。

14.根据权利要求8至13的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎，其中所述多能细胞在其基因组中包含遗传修饰。

15.一种产生非人类动物的方法，所述方法包括将根据权利要求1至14的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎引入假孕的非人类动物中，并且在适合于所述胚胎的发育的条件下孕育所述植入前非人类宿主胚胎，从而产生非人类动物。

16.一种非人类宿主胚胎，所述非人类宿主胚胎包含如权利要求1至9的任一项中限定的破坏的育性基因和如权利要求10至14的任一项中限定的供体多能细胞。

17.一种替代或代孕非人类动物，所述替代或代孕非人类动物包含根据权利要求16所述的非人类宿主胚胎。

18.一种产生嵌合非人类动物的方法，所述方法包括将根据权利要求10至14的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎引入假孕的非人类动物中，并且在适合于所述胚胎的发育的条件下孕育所述植入前非人类宿主胚胎，从而产生嵌合非人类动物。

19.一种产生非人类宿主胚胎的方法，所述非人类宿主胚胎包含破坏的育性基因，所述方法包括：使以下1)与2)杂交：1)第一动物品系，所述第一动物品系携带条件性不育转基因，所述条件性不育转基因包含可破坏的育性基因(“条件性不育品系”)；2)第二动物品系，所述第二动物品系携带不育激活转基因，所述不育激活转基因包含破坏所述可破坏的育性基因的基因(“不育激活品系”)，从而产生转基因非人类宿主胚胎，所述转基因非人类宿主胚胎包含具有破坏的育性基因的生殖细胞。

20.根据权利要求18所述的方法，其中使所述第一动物品系的雌性成员与所述第二动物品系的雄性成员杂交。

21.一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含通过育性基因破坏物分子可破坏的育性基因(“可破坏的育性基因”)，其中所述可破坏的育性基因与启动子可操作连接；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含编码所述育性基因破坏物分子的核苷酸序列(“破坏物核苷酸序列”)，其中所述破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接。

22.根据权利要求21所述的繁殖对，其中所述育性基因破坏物是重组酶并且所述可破坏的育性基因与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在所述重组酶的存在下介导所述育性基因的破坏。

23.根据权利要求21所述的繁殖对，其中所述育性基因破坏物是抑制性RNA分子，所述抑制性RNA分子适当地通过反义抑制或RNA干扰抑制所述育性基因的表达。

24.根据权利要求21所述的繁殖对，其中所述育性基因破坏物是抗体，所述抗体与所述育性基因的多肽产物免疫相互作用。

25.根据权利要求21至24的任一项所述的繁殖对，其中所述破坏物核苷酸序列是条件性地可表达的。

26.根据权利要求25所述的繁殖对，其中所述破坏物转基因包含与所述破坏物核苷酸序列可操作连接的表达调节元件，其中所述元件条件性地抑制所述破坏物核苷酸序列的表达。

27.根据权利要求26所述的繁殖对，其中在第一条件下所述表达调节元件抑制所述破坏物核苷酸序列的转录，并且在第二条件下所述表达调节元件的破坏允许或增强所述破坏物核苷酸序列的转录。

28.根据权利要求26或权利要求27所述的繁殖对，其中所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列抑制所述破坏物核苷酸序列的表达并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，其中所述重组酶识别位点在重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏，并且其中所述第一繁殖配偶包含激活子转基因，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的所述重组酶的编码序列。

29.根据权利要求21至28的任一项所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖配偶是雄性。

30.根据权利要求28或权利要求29所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶的所述激活子转基因是纯合的。

31.根据权利要求21至30的任一项所述的繁殖对，其中所述第二繁殖配偶的所述破坏物转基因是纯合的。

32.一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的转基因，所述可破坏的转基因包含可破坏的育性基因，所述可破坏的育性基因与启动子且与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在重组酶的存在下介导所述育性基因的破坏；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含编码育性基因破坏物分子的破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列与启动子可操作连接，其中所述育性基因破坏物分子包括所述重组酶。

33.根据权利要求32所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖配偶是雄性。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶的所述可破坏的转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破坏物转基因是纯合的。

35.一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含第一可破坏的转基因和第一破坏物转基因，所述第一可破坏的转基因包含与启动子且与第一重组酶识别位点可操作连接的育性基因，所述第一重组酶识别位点在第一重组酶的存在下介导所述可破坏的育性基因的破坏，所述第一破坏物转基因包含与启动子可操作连接的第二重组酶的编码序列，其中所述第二重组酶特异性地识别第二重组酶识别位点，和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含第二可破坏的转基因和第二破坏物转基因，所述第二可破坏的转基因包含与启动子且与第二重组酶识别位点可操作连接的育性基因，所述第二重组酶识别位点在所述第二重组酶的存在下介导所述可破坏的育性基因的破坏，所述第二破坏物转基因包含与启动子可操作连接的所述第一重组酶的编码序列，其中所述第一重组酶特异性地识别所述第一重组酶识别位点。

36.根据权利要求35所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶的所述第一可破坏的转基因和所述第一破坏物转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述第二可破坏的转基因和所述第二破坏物转基因是纯合的。

37.一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的育性基因和激活子转基因，所述可破坏的育性基因与启动子可操作连接，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含编码抑制性RNA分子(例如，反义RNA、siRNA、shRNA等)的破坏物核苷酸序列，所述抑制性RNA分子抑制所述可破坏的育性基因的表达，其中所述破坏物核苷酸序列与启动子且与表达调节元件可操作连接，所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列在所述重组酶的不存在下抑制所述破坏物核苷酸序列的表达并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在所述重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏。

38.根据权利要求37所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶的所述激活子转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破坏物转基因是纯合的。

39.根据权利要求37或权利要求38所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖配偶是雄性。

40.一种非人类动物的繁殖对，所述繁殖对包括：(1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破坏的育性基因和激活子转基因，所述可破坏的育性基因与启动子可操作连接，所述激活子转基因包含与启动子可操作连接的重组酶的编码序列；和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破坏物转基因，所述破坏物转基因包含破坏物核苷酸序列，所述破坏物核苷酸序列编码与所述可破坏的育性基因的多肽产物免疫相互作用的抗体，其中所述破坏物核苷酸序列与启动子并且与表达调节元件可操作连接，所述表达调节元件包含抑制子核苷酸序列(例如，转录终止子)，所述抑制子核苷酸序列在重组酶的不存在下抑制所述破坏物核苷酸序列的表达并且所述抑制子核苷酸序列与重组酶识别位点可操作连接，所述重组酶识别位点在所述重组酶的存在下介导所述抑制子核苷酸序列的破坏。

41.根据权利要求40所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶的所述激活子转基因是纯合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破坏物转基因是纯合的。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的繁殖对，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖配偶是雄性。

43.一种用于产生非人类宿主胚胎的方法，所述非人类宿主胚胎包含破坏的育性基因，所述方法包括：(a)使根据权利要求21至42的任一项所述的非人类动物的繁殖对的第一繁殖配偶与所述繁殖对的第二繁殖配偶交配；和(b)从所述繁殖对的雌性成员产生植入前非人类胚胎，所述胚胎包含在其种系中的所述育性基因的破坏。

44.根据权利要求43所述的方法，所述方法还包括在允许所述植入前非人类宿主胚胎的形成的条件下培养非人类宿主胚胎。

45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖配偶是雄性。

46.根据权利要求43至45的任一项所述的方法，所述方法还包括将如权利要求10至14的任一项中限定的供体多能细胞引入到所述植入前非人类胚胎中。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述多能细胞包含遗传修饰。

48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述多能细胞是雄性多能细胞。

49.一种产生嵌合非人类动物的方法，所述方法包括(1)移植植入前非人类胚胎，所述植入前非人类胚胎包含在其种系中的育性基因的破坏(例如，如权利要求1至9的任一项中限定的)并且所述植入前非人类胚胎还包含供体多能细胞(例如，如权利要求10至14的任一项中限定的)；和(2)在适合于所述胚胎的发育的条件下孕育(1)的非人类宿主胚胎，从而产生具有在其种系中的破坏的育性基因和遗传修饰的嵌合非人类动物。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述嵌合非人类动物是雄性嵌合非人类动物。

51.一种产生非人类动物的方法，所述非人类动物包含在其基因组中的遗传修饰，所述方法包括用在其基因组中包含其中缺乏破坏的育性基因的同类雌性非人类动物繁殖根据权利要求50所述的方法产生的雄性嵌合非人类动物，以当所述雄性嵌合非人类动物包含源自所述供体多能细胞的生殖细胞或配子时产生包含所述遗传修饰的非人类动物。

52.一种非人类动物(例如，替代或代孕非人类动物)，所述非人类动物具有移植在其中的根据权利要求1至14的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎。

53.一种嵌合非人类动物，所述嵌合非人类动物源自根据权利要求1至14的任一项所述的植入前非人类宿主胚胎。

54.一种根据权利要求51所述的方法产生的非人类动物。