CN103849634B - 转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用。具体地，发明人发现长度为1.8kb的Lcn5基因启动子序列能驱动外源基因在小鼠附睾头部（特别是中远端特定）区域表达，并由此构建了由该启动子驱动的外源Cre基因表达载体。这种转基因载体能驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异地表达，也可以驱动其他基因如CreERT2重组酶等的表达。应用这种转基因体系制备转基因小鼠，能获得很高的基因组整合率（>25%），并可准确、高效驱动外源基因在附睾头部中远端区域表达。本发明还建立了附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，本发明涉及一种转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用，特别是建立了附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。
背景技术
将外源基因导入动物机体或深入探讨基因功能需借助转基因技术，特别地，探讨基因在动物机体的功能或改良动物性状，建立新品系等，以及研究附睾中的基因对附睾发育或精子成熟的功能，需要采用转基因过表达或基因敲除技术。这些技术一方面需要转基因打靶载体；另一方面为了实现控制基因在特定组织或细胞表达，需要组织特异性启动子。
启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。因此筛选和构建由组织特性启动子驱动的外源蛋白的转基因载体具有非常重要的意义。
传统的基因敲除（knock out）技术是直接破坏胚胎干细胞（ES）中的靶基因而使之失活，打靶后该基因将在所有组织中失活，如果该基因对胚胎发育必需则会造成胚胎致死，这样就难以研究其在出生后或成年时的功能。针对此缺陷，条件性基因敲除（Conditional knock out）技术应运而生。条件性基因敲除主要利用了Cre/LoxP为代表的重组酶系统，通过组织特异性启动子或四环素/类固醇激素受体调控系统控制Cre的表达，使LoxP化的靶基因被敲除，因而避免了传统基因敲除方法引起的胚胎致死和复杂表型的缺陷，成为后基因组时代在体内研究基因功能的首选技术。建立组织特异性基因剔除小鼠的方法是首先通过同源重组建立靶基因“floxed”小鼠和通过受精卵原核注射建立组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。
目前还没有附睾头部特异表达Cre重组酶的转基因小鼠，因此本领域迫切需要筛选和开发该种工具小鼠。
发明内容
本发明的目的就是提供一种转基因构建物及在制备附睾头部特异表达Cre重组酶转基因小鼠中的应用。
本发明的另一目的是建立附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。
在本发明的第一方面，提供了一种转基因构建物，所述的构建物包括外源Cre基因以及与外源Cre基因可操作连接的启动子元件；其中，所述的启动子元件是脂质运载蛋白5（Lipocalin5）的启动子或其活性片段，并且所述启动子具有驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异表达的功能。
在另一优选例中，所述的启动子具有驱动外源Cre基因在动物附睾头部中远端特异表达的功能。
在另一优选例中，所述的动物为哺乳动物，较佳地为人、鼠、牛、羊、猪等。
在另一优选例中，所述的启动子元件选自下组：核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)，且具有驱动外源基因在动物附睾头部中特异表达的功能的多核苷酸；(c)如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸，且具有驱动外源基因在动物附睾头部特异表达功能的多核苷酸。
在另一优选例中，所述启动子元件来源于动物的脂质运载蛋白5（Lipocalin5）基因。
在另一优选例中，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述的转基因构建物还可以包括选自下组的任一基因或其组合：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、miRNA基因、生物制剂基因、或动物品质相关基因。
在另一优选例中，所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因、DsRed（红色荧光蛋白）基因。
在另一优选例中，所述的外源Cre基因具有如SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒从5’至3’依次具有下述元件：启动子元件、Cre基因的ORF 序列、和终止子序列，并且所述的启动子元件是脂质运载蛋白5（Lipocalin5）的启动子或其活性片段，所述启动子具有驱动Cre基因在动物附睾头部特异表达的功能。
在另一优选例中，所述的基因表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly(A)元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有或第一方面所述的转基因构建物，或第二方面所述的基因表达盒。
在另一优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的载体、或其染色体整合有第一方面所述的转基因构建物、或其染色体整合有第二方面所述的基因表达盒。
在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体整合有一个或多个(如1-50个，较佳地2-6个)拷贝的第一方面所述的转基因构建物或第二方面所述的基因表达盒。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、或农杆菌)、低等真核细胞(如酵母细胞)、或高等真核细胞(如动物细胞)。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为小鼠细胞。
在本发明的第五方面，提供了第一方面所述的转基因构建物、或第二方面所述的基因表达盒的用途，用于特异性调控外源Cre基因在动物附睾头部特异表达。
在另一优选例中，用于特异性调控外源Cre基因在动物附睾头部中远端特异表达。
在本发明的第六方面，提供了一种制备转基因动物的方法，包括步骤：
(a)提供转基因的动物细胞，所述动物细胞含有第三方面所述的载体、或其染色体整合有第一方面所述的转基因构建物、或其染色体整合有第二方面所述的基因表达盒；
(b)将步骤(a)所述的转基因的细胞再生为动物，从而获得转基因动物。
在另一优选例中，步骤(b)所述动物的染色体整合有第一方面所述的转基因构建物、或第二方面所述的基因表达盒。
在本发明的第七方面，提供了一种转基因动物的用途，所述的转基因动物是用第六方面所述的方法制备的，所述的转基因动物用于小鼠附睾头部区域特异敲除或过表达目标靶基因。
在本发明的第八方面，提供了一种在动物附睾头部特异性表达外源Cre基因的方法，包括步骤：
(a)提供第一方面所述的转基因构建物；
(b)将步骤(a)中的转基因构建物导入动物细胞，获得转化的动物细胞；
(c)将步骤(b)中转化的动物细胞再生成动物，从而使外源Cre基因在动物附睾头部特异性表达。
在另一优选例中，步骤(b)中所述转化的动物细胞的染色体整合有第一方面所述的转基因构建物。
在另一优选例中，所述的方法是一种在动物附睾头部中远端特异表达外源Cre基因的方法。
在本发明的第九方面，提供了一种在动物附睾头部区域特异敲除目标靶基因的方法，包括步骤：
(1)提供第一方面所述的转基因构建物；
(2)用步骤(1)的转基因构建物转化动物细胞，获得转化的动物细胞；
(3)将步骤(2)中转化的动物细胞再生成动物，从而使外源Cre基因在动物附睾头部特异性表达；
(4)将步骤(3)中获得的转基因动物与floxed化的转基因动物交配，从而可获得特异敲除目标基因的子代动物。
在另一优选例中，所述的floxed化的转基因动物是具有Loxp位点的转基因动物。
在另一优选例中，所述的动物为小鼠。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠制备技术路线。
图2显示附睾头部特异基因启动子驱动Cre重组酶转基因过表达载体构建和体外活性验证；（a）Lcn5（1.8）-Cre转基因载体示意图，骨架为pUBC转基因过表达载体，1.8kb启动子序列来自在附睾头部中远端主细胞表达的Lcn5基因；（b）Lcn5（1.8）-Cre转基因载体能在HEK 293T细胞上表达Cre重组酶mRNA，Lcn5基因受雄激素调控，需共转AR过表达载体并补充雄激素，NTC为非模板对照，AR，雄激素受体表达载体，pCAG-Cre为阳性对照；（c）Lcn5（1.8）-Cre转基因载体能驱动活性Cre重组酶表达，UBb-DsRed-emGFP为Cre重组酶活性报告载体，RFP位于两个loxP位点之间，GFP位于第二个loxP之后，当有活性Cre重组酶表达时，红色荧光减弱或消失，绿色荧光开始表达。
图3显示转基因首建鼠鉴定和建系，通过原核显微注射技术共出生38只首建鼠，通过PCR技术鉴定其中有11只转基因阳性鼠，WT为野生型小鼠。
图4显示Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶mRNA的时空表达谱；（a）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠在附睾头部特异表达Cre重组酶mRNA；（b）（c）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶mRNA在出生后30天的附睾头部开始表达，50-60天表达量达到最高，继而有所下降，NTC为非模板对照，TG为转基因小鼠，WT为野生型小鼠。
图5显示Cre重组酶在体内组织特异性和发育时间表达活性；（a）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠与Cre重组酶活性报告基因转基因小鼠mT/mG交配，检测子代双转基因小鼠GFP表达，GFP仅仅在附睾头部表达，在其它组织无GFP信号，表明Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶在该特定区域表达并具有切割活性；（b）检测不同发育时间点子代双转基因小鼠发现GFP在附睾头部亮度增加，显示Cre表达随发育时间增加而升高，活性加强。
图6显示Cre重组酶在组织和亚细胞中的定位：Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠与Cre重组酶活性报告基因小鼠mT/mG交配，检测子代双转基因小鼠红色荧光和绿色荧光表达，发现有绿色荧光表达表示有活性Cre重组酶存在；（a）、（b）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠在附睾头部中远端表达活性Cre重组酶；（c）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠在附睾头部主细胞表达活性Cre重组酶，AQP 9为主细胞marker。
图7显示Cre重组酶活性的时空特性；Aip1fl/fl转基因小鼠作为测试Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠的报告基因小鼠，Lcn5（1.8）-Cre与Aip1fl/fl转基因小鼠交配，检测子代双转基因小鼠Lcn5（1.8）-Cre;Aip1fl/flCre重组酶切割后的目的片段；（a）Aip1fl/fl转基因小鼠基因组loxP位点示意图；（b）（c）Cre重组酶在30天开始表达，在附睾头部区域能切割目标基因；WT表示野生型；Aip1-KO表示在附睾头部条件性敲除Aip1基因。
图8显示Lcn5（5.2）-Cre转基因过表达载体的表达特性，图8a显示其结构；图8b显示了来自不同line的Lcn5（5.2）-Cre转基因小鼠Cre的组织表达特性，
图9显示CreERT2在附睾头部中远端区域表达。CreERT2同样由1.8kb的Lcn5启动子驱动。Lcn5(1.8)-CreERT2转基因小鼠制备流程同Lcn5(1.8)-Cre。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了一种能够在附睾头部特异表达外源蛋白的转基因体系。具体地，发明人发现，具有1.8kb的Lcn5基因启动子能驱动外源蛋白在附睾头部的特异表达，并由此构建了由附睾头部特异基因启动子驱动的外源蛋白转基因过表达载体。这种载体能驱动多种外源蛋白，如具有识别基因组上loxp位点并行使切割活性的Cre和CreERT2重组酶等，将这种转基因载体制备转基因小鼠，转化率和整合率高达25%以上，能准确、高效驱动外源基因在附睾头部特定区域表达，在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
如本文所用，术语“本发明启动子”、“附睾头部特异表达的启动子”、“附睾头部中远端特异表达的启动子Lcn5”或“附睾头部特异表达的启动子Lcn5（1.8）”可互换使用，指鼠源性(较佳地来自于小鼠)Lcn5基因的启动子元件，本发明一种典型的启动子Lcn5序列如SEQ ID NO.:1所示。
如本文所用，术语“动物”没有特别的限制，包括(但不限于)：大鼠、小鼠、家兔、羊、牛等，较佳地为小鼠。
在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
本发明还包括与本发明的优选启动子序列(SEQ ID NO.:1)具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的核酸，所述核酸也具有特异性调控启动附睾组织表达的功能。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于小鼠的启动子Lcn5，但是来源于其它类似的物种(尤其是属于同一科或属的动物)的、与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地分离得到该启动子。
如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织的表达。所述的“附睾头部中远端组织特异性的表达”是指在本发明的启动子调控下，目的基因高度特异性和专一性地在附睾头部中远端组织中表达。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。
本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。本发明所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，可以为miRNA基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或动物改良上具有重要特性或功能的蛋白。
所述外源基因的代表性例子包括(但不限于)：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或动物品质相关基因。
所述的抗性基因选自下组：抗病毒基因、抗生素抗性基因、耐高温基因等。
所述的筛选标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(绿色荧光蛋白)基因。
所述的抗原蛋白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白(如霍乱毒素B，破伤风毒素等)、病毒类抗原蛋白(如犬细小病毒)、原生动物类抗原蛋白(阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白(如I型糖尿病的CTB–pins)、或生物制剂(如α2b干扰素，胰岛素样生长因子等)。
所述的动物品质相关基因选自下组：氨基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因或雄性不育相关基因。
本发明优选的外源基因为Cre基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
转基因构建物
本发明提供了一种转基因构建物，所述的构建物包括外源Cre基因以及与外源Cre基因可操作连接的启动子元件；所述的启动子元件是脂质运载蛋白5（Lipocalin5）的启动子或其活性片段，并且所述启动子具有驱动外源Cre基因在小鼠附睾头部特异表达的功能。
所述的启动子优选具有驱动外源Cre基因在动物附睾头部中远端特异表达的功能。所述的动物为哺乳动物，较佳地为人、鼠、牛、羊、猪等。
本发明所述的启动子选自下组：核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)，且具有驱动外源基因在动物附睾头部中特异表达的功能的多核苷酸；如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸，且具有驱动外源基因在动物附睾头部特异表达功能的多核苷酸。
本发明所述的外源Cre基因具有如SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。
基因表达盒，载体
本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下列元件：启动子、外源基因ORF序列和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQ ID NO.:1所示或与SEQ ID NO.:1所示。优选地，所述表达盒包括增强子等元件。
本发明还提供了一种包括本发明基因表达盒的重组载体，优选转基因载体为Lcn5(1.8)-Cre，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，具体见序列表。
作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的Lcn5（1.8）启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的启动子、转基因构建物、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。
在本发明的一个具体实例中，在1.8kb Lcn5启动子的启动或指导下，可以使Cre基因特异地在动物附睾组织，特别是附睾头部中表达，特别优选在附睾头部的中远端表达，而其他部分没有任何表达。
在本发明的一个具体的实施例中，为了获得在附睾头部特异表达Cre重组酶的转基因小鼠模型，可以采取了如下技术路线（图1）：
构建Lcn5（1.8）-Cre转基因表达载体；在细胞水平测试转基因表达载体的体外活性；原核显微注射；第一代首建转基因阳性小鼠鉴定和建系；RT-PCR检测F2代小鼠Cre重组酶mRNA的时空表达特性；与Cre重组酶报告基因小鼠（mT/mG）和floxed化的转基因小鼠（Aip1fl/fl）交配，确定体内Cre重组酶表达的组织特异性和切割活性。
鉴于此，本发明首先通过转基因技术获得子代小鼠38只，经过基因型鉴定，11只小鼠在其基因组上整合有Cre基因，整合率为28.9%。通过RT-PCR方法检测Cre组织表达分布，发现其mRNA仅在附睾头部特异表达，与内源性Lcn5基因表达模式一致。将Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶活性报告荧光转基因小鼠mT/mG交配，发现子代双转基因小鼠GFP仅在附睾头部中远端区段特异表达，显示Cre重组酶在附睾特定区域表达并具有切割活性，并随发育时间表达增加。为了进一步验证Cre重组酶在体内的切割活性，将Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠与floxed化的Aip1条件性基因打靶小鼠交配，Lcn5（1.8）-Cre;Aip1flox/flox小鼠的多个组织的基因组DNA的PCR结果显示，Cre重组酶能特异性在附睾头部成功介导Loxp位点的重组。本研究成功获得到了一个附睾头部特异表达Cre重组酶的转基因小鼠新品系。
附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台
本发明还提供了一种附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台及其建立方法。如本发明背景部分所述，附睾是精子成熟与储存的场所，研究附睾中基因表达与调控有助于了解精子成熟与储存的分子机制。基因敲除技术是目前研究特定基因功能最直接的方法，传统的基因敲除技术可能造成胚胎致死。目前由组织或细胞特异性基因启动子驱动Cre重组酶表达的转基因小鼠模型有上百种之多，但是还未见到有附睾头部组织特异性表达Cre或CreERT2重组酶转基因小鼠模型的报道。
为了对目的基因在附睾中实现特定时间或区域特异性敲除，在本发明的具体实施例中，发明人成功构建了由附睾头部特异基因启动子驱动的Cre重组酶转基因小鼠模型。其与Aip1转基因小鼠交配后，筛选双转基因阳性小鼠，检测发现可在附睾头部特异敲除Aip1基因，由此建立了基于Cre-Loxp重组酶系统研究附睾头部基因功能的技术平台。
因此，本发明建立的附睾头部特异表达Cre重组酶转基因小鼠可以作为工具小鼠，实现在附睾头部特异敲除或过表达目标基因，以研究其在附睾头部缺失或过表达后对精子在附睾中精子成熟的作用，为探讨雄性不育或避孕的分子机制提供新的技术手段。
驱动其它蛋白编码基因或miRNA过表达情况
由上述实施例的结果可知，1.8kb片段长度的Lcn5基因启动能准确，高效驱动外源基因在附睾特定区域表达活性蛋白，由此证明发明人构建的转基因载体及生产转基因动物的方法是稳定可靠和有效的，特别是筛选并确定了附睾头部特异基因特定长度启动子所具有的驱动外源基因在动物体内高效表达的能力。这为采用该转基因体系驱动其它蛋白编码基因在附睾头部表达提供了新的途径，因此可利用该转基因载体，构建满足不同需求的转基因动物，如在生殖道可以起抗菌作用的抗菌肽或促进精子成熟的相关基因等。
已知miRNA为一类新类型的非编码RNA，参与多种生物学进程。另外研究表明大多数miRNA的转录是受II型聚合酶驱动的，因此本发明也可利用Lcn5基因启动子驱动miRNA在附睾头部过表达，以探讨其在体内的作用。优选的办法就是找到合适的酶切位点，克隆其它编码蛋白基因的CDS序列或miRNA的初级转录本序列，插入到转基因载体1.8kb Lcn5启动子之后，替换掉Cre重组酶基因，即可实现获得目标转基因过表达载体的目的。
founder，line
如本文所用，术语“founder”是指通过原核注射的方法得到的第一代转基因小鼠，也称为首建鼠。由于构建中存在一定几率的随机性，每一只founder都是不一样的，以每一只founder起源的品系称为line（品系），不同的line之间的表达可能会有差异。
对于普通的转基因，表达的区域将取决于启动子。如果选择全身表达的启动子，如Rosa26,CAG等，将得到全身表达的转基因小鼠；如果选择一些组织特异性表达的基因的启动子，将得到组织特异性表达的转基因小鼠，如本发明在Lcn5基因的启动子下进行表达，会得到附睾头部特异表达的转基因小鼠。
转基因小鼠品系建立情况说明
1.转基因小鼠遗传背景：制备的Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠遗传背景是129品系，然后与C57B6回交一代。
2.阳性founder小鼠传代和数量：Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠成功鉴定了一个附睾特异表达Cre重组酶的转基因小鼠，目前已成功得到第3代小鼠，来自1043#founder的目标转基因小鼠生有14只雄鼠，10只雌鼠，其中转基因阳性小鼠为7雄3母。其它非目标转基因小鼠品系未作计算。
3.保种方法：
1）转基因小鼠与C57B6遗传背景小鼠回交纯化；
2）分别将一对雌雄转基因小鼠进行胚胎冷冻保存。
本发明的主要优点如下：
(1)在本发明所述的附睾头部特异表达外源Cre重组酶的转基因体系中，所用启动子能驱动外源基因在附睾头部中远端主细胞特异表达，而在全身其它组织不会有任何表达；
(2)本发明的转基因载体所用启动子启动效率很高，且专一性极强；
(3)在本发明所论述的附睾头部特异表达外源蛋白的转基因体系具体应用中，由启动子驱动的外源Cre重组酶在附睾出生后30d开始表达，其表达活性随发育而增强，40-50d表达达到最高，如与foxp化的目标基因转基因小鼠配合使用，即能在附睾头部特定区域敲除或过表达目标基因，进而可探讨目标基因对精子成熟的作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
构建Lcn5（1.8）-Cre转基因载体以及体外活性验证
1.附睾头部特异启动子驱动的Cre重组酶转基因载体所用的骨架载体为常规市售的pUBC转基因载体
首先对pUBC载体进行改造，利用Mlu Ⅰ和Avr Ⅱ双酶切，切割下167bp的UBC启动子序列，并将Avr Ⅱ酶切位点置换为Kpn Ⅰ。
以pBLCAT-5m-RABP质粒(Lareyre,Thomas et al.1999)为模板，通过引物对：lcn5-pro-S:5'ACGACGCGTCTACCTGGCCTCTCCTGCTCCT-3'（SEQ ID NO：6）和lcn5-pro-A:5'CGTGGTACCTGGGTTCAGCTCCCCACCAG 3'（SEQ ID NO：7）进行PCR反应，该引物扩增1.8kb的Lcn5（1.8）-Cre启动子序列，该1.8kb序列的全长如SEQ ID NO：1所示。分别用Mlu Ⅰ和KpnⅠ限制性内切酶对PCR产物和pUBC转基因载体进行双酶切，通过T4DNA连接酶连接并测序鉴定。
同时用Not Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶对pCAG-Cre载体进行双酶切，将切下的Cre CDS序列连接进前述连接有Lcn5启动子的pUBC载体，构建好的载体命名为Lcn5（1.8）-Cre转基因载体，该转基因载体的全长序列如SEQ ID NO：3所示。
2.体外Cre重组酶表达活性验证
为了测试Lcn5（1.8）-Cre转基因载体是否具有转录活性Cre重组酶的能力，在HEK293T细胞上进行了过表达实验。参考罗氏转染试剂Transfection Reagent的操作方法，其中以UBb-DsRed-emGFP为Cre重组酶指示载体，RFP位于两个loxP位点之间，GFP位于第二个loxP之后，当有活性Cre重组酶表达时，红色荧光减弱或消失，绿色荧光开始表达。分别共转染UBb-DsRed-emGFP和Lcn5（1.8）-Cre。72h后通过荧光显微镜观察红绿荧光的表达。
图2显示了附睾头部特异基因启动子驱动Cre重组酶转基因过表达载体构建和体外活性验证结果，具体地：（a）为Lcn5（1.8）-Cre转基因载体示意图，骨架为pUBC转基因过表达载体，1.8kb启动子序列来自在附睾头部中远端主细胞表达的Lcn5基因；（b）显示了Lcn5（1.8）-Cre转基因载体能在HEK 293T细胞上表达Cre重组酶mRNA，Lcn5基因受雄激素调控，需共转AR过表达载体并补充雄激素，NTC为非模板对照，AR，雄激素受体表达载体，pCAG-Cre为阳性对照；（c）显示Lcn5（1.8）-Cre转基因载体能驱动活性Cre重组酶表达，UBb-DsRed-emGFP为Cre重组酶活性报告载体，RFP位于两个loxP位点之间，GFP位于第二个loxP之后，当有活性Cre重组酶表达时，红色荧光减弱或消失，绿色荧光开始表达。
实施例2
转基因小鼠构建和鉴定
1.使用SgrD I和Fsp I限制性内切酶对实施例1制备的Lcn5（1.8）-Cre转基因载体进行线性化，通过原核显微方法制备转基因小鼠，转基因小鼠背景为C57BL/6(Palmiter和Brinster 1985)。
抽提鼠尾DNA，并通过引物对
Tg-Cre-S:5'GCCTGCATTACCGGTCGATGC3'（SEQ ID NO：8）和
Tg-Cre-A:5'CAGGGTGTTATAAGCAATCCC3'（SEQ ID NO：9）进行PCR扩增，检测阳性转基因小鼠并建系。
图3显示转基因首建鼠鉴定和建系，通过原核显微注射技术共出生38只首建鼠，通过PCR技术鉴定其中有11只转基因阳性鼠，WT为野生型小鼠。
实施例3
RT-PCR和定量PCR检测转基因小鼠Cre重组酶mRNA时空表达特性
采取Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠不同组织，参考TRIzol试剂(LifeTechnologies,USA)的操作方法抽提总RNA，利用ReverTra Ace-α(FSK-100,TOYOBO)反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。通过Tg-Cre-S和Tg-Cre-A（序列同上）检测Cre重组酶mRNA组织特异性表达。
另外以引物对Lcn5-CDS-S:5'TCAGCGAAGTACAAGGTCACC 3'（SEQ IDNO：10）和Lcn5-CDS-A:5'CATTGTTGTCCAAGCTCCG（SEQ ID NO：11）检测内源性Lcn5基因表达作为样品阳性控制。
设计PCR引物对cre-S:5'GACCAGGTTCGTTCACTCATGGA 3'（SEQ IDNO：12）和cre-A:5'AACATTCTCCCACCGTCAGTACG 3'（SEQ ID NO：13），通过定量PCR的方法检测Cre重组酶mRNA在附睾头部发育表达特性。
图4显示了Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶mRNA的时空表达谱；（a）：Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠在附睾头部特异表达Cre重组酶mRNA；（b），（c）：Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶mRNA在出生后30天的附睾头部开始表达，50-60天表达量达到最高，继而有所下降，NTC为非模板对照，TG为转基因小鼠，WT为野生型小鼠。
实施例4
利用Cre重组酶报告小鼠mT/mG鉴定转基因小鼠表达Cre重组酶时空特性
将Lcn5（1.8）-Cre与mT/mG转基因小鼠进行交配，筛选双阳性转基因子代小鼠。取睾丸和附睾组织进行荧光检测。另外对附睾组织进行冰冻切片，通过激光共聚焦显微镜进行观察。
图5显示了Cre重组酶在体内组织特异性和发育时间表达活性；（a）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠与Cre重组酶活性报告基因转基因小鼠mT/mG交配，检测子代双转基因小鼠GFP表达，GFP仅仅在附睾头部表达，在其它组织无GFP信号，表明Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠Cre重组酶在该特定区域表达并具有切割活性；（b）检测不同发育时间点子代双转基因小鼠发现GFP在附睾头部亮度增加，显示Cre表达随发育时间增加而升高，活性加强。
图6显示了Cre重组酶在组织和亚细胞中的定位：Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠与Cre重组酶活性报告基因小鼠mT/mG交配，检测子代双转基因小鼠红色荧光和绿色荧光表达，发现有绿色荧光表达表示有活性Cre重组酶存在；（a）、（b）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠在附睾头部中远端表达活性Cre重组酶；（c）Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠在附睾头部主细胞表达活性Cre重组酶，AQP 9作为主细胞marker。
实施例5
利用Aip1fl/fl转基因小鼠进一步测试转基因小鼠表达活性Cre重组酶的能力
将Lcn5（1.8）-Cre与Aip1fl/fl转基因小鼠进行交配，筛选双阳性转基因子代小鼠。以不同组织和不同发育阶段附睾头部组织基因组DNA为模板。通过引物对AIP1-KO-F:5'GACTGACTGCATCCCAAGGACTAG 3'（SEQ ID NO：14）和AIP1-KO-R:5'TTGCACAGAGGTGAATGACAGAG（SEQ ID NO：15）检测Cre切割后的基因组产物。
图7显示了转基因小鼠表达活性Cre重组酶的时空特性；Aip1fl/fl转基因小鼠作为测试Lcn5（1.8）-Cre转基因小鼠的报告基因小鼠，Lcn5（1.8）-Cre与Aip1fl/fl转基因小鼠交配，检测子代双转基因小鼠Lcn5（1.8）-Cre;Aip1fl/flCre重组酶切割后的目的片段；（a）Aip1fl/fl转基因小鼠基因组loxP位点示意图；（b）（c）Cre重组酶在30天开始表达，在附睾头部区域能切割目标基因；WT表示野生型；Aip1-KO表示在附睾头部条件性敲除Aip1基因。
实施例6
Lcn5（5.2）-Cre重组酶转基因小鼠Cre重组酶未表达
采用与上述构建Lcn5（1.8）-Cre转基因载体相同的策略，发明人构建了Lcn5（5.2）-Cre转基因过表达载体，见图8（a）。
其中扩增5.2kb Lcn5启动子的引物序列为：Lcn5（5.2）-S:5'ACGACGCGTCAAATGGAGAAACTGAGATAAATA 3'（SEQ ID NO：16）和Lcn5（5.2）-A：5'CGTGGTACCTGGGTTCAGCTCCCCACCAG 3'（SEQ IDNO：17）。
构建好的载体通过测序验证正确后，首先在HEK 293T细胞上与Cre重组酶红绿荧光蛋白报告载体进行共转染验证，结果能检测到该转基因载体具有Cre重组酶切割活性。
进一步，发明人通过原核注射方法构建转基因小鼠，检测鼠尾基因组DNA，得到数只阳性首建鼠，进而通过RT-PCR鉴定不同line转基因小鼠多个组织Cre重组酶mRNA表达。
图8（b）显示了来自不同line的Lcn5（5.2）-Cre转基因小鼠Cre的组织表达特性，结果发现，转基因小鼠附睾组织未检测到Cre的mRNA表达。原因可能是转基因片段在小鼠基因组中进行随机插入，因此可能会插入到一些抑制区导致转入的基因不表达；其次是5.2kb的Lcn5启动子活性不如1.8kb，未能正常驱动外源基因在体内表达。
实施例7
Lcn5（1.8）-CreERT2重组酶转基因小鼠的建立
采用与上述构建Lcn5（1.8）-Cre转基因载体类似的策略，发明人构建了Lcn5（1.8）-CreERT2转基因过表达载体。模板为市售的pCAG-CreERT2载体分别用EcoRV单酶切，将CreERT2连接进市售的pUBC转基因载体中，再将1.8kb的Lcn5启动子连接到目的载体中。
构建好的Lcn5（1.8）-CreERT2转基因载体通过测序验证正确后，首先在HEK293T细胞上与Cre重组酶红绿荧光蛋白报告载体进行共转染验证，结果能检测到该转基因载体具有Cre重组酶切割活性，并其活性能受他莫西芬（tamoxifen）诱导调控。
进一步通过原核注射方法构建转基因小鼠，检测鼠尾基因组DNA，得到数只阳性首建鼠，进而与mT/mG转基因小鼠（Cre重组酶活性报告转基因小鼠）交配，检测后代双转基因GFP表达。
图9显示了Lcn5（1.8）-CreERT2;mT/mG双转基因小鼠在附睾头部中远端特定区域检测到GFP信号，显示Lcn5（1.8）-CreERT2转基因小鼠在附睾头部中远端特定区域表达有活性的CreERT2。此转基因小鼠结果再一次证明了1.8kb片段长度的Lcn5基因启动能准确驱动外源基因在附睾特定区域表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (16)
1.一种转基因构建物，其特征在于，所述的构建物包括外源Cre基因以及与外源Cre基因可操作连接的启动子元件；其中，所述的启动子元件是脂质运载蛋白5(Lipocalin5)的启动子，并且所述启动子具有驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异表达的功能；
其中，所述启动子元件核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
2.如权利要求1所述的转基因构建物，其特征在于，所述的转基因构建物还可以包括选自下组的任一基因或其组合：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、miRNA基因、生物制剂基因、或动物品质相关基因。
3.如权利要求1所述的转基因构建物，其特征在于，所述的外源Cre基因具有如SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。
4.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒从5’至3’依次具有下述元件：启动子元件、Cre基因的ORF序列、和终止子序列，并且所述的启动子元件是脂质运载蛋白5(Lipocalin5)的启动子，所述启动子具有驱动Cre基因在动物附睾头部特异表达的功能；
其中，所述启动子元件核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述的基因表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：poly(A)元件、增强子、转运元件、或基因靶向元件。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有或权利要求1所述的转基因构建物，或权利要求4所述的基因表达盒。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的转基因构建物、或其染色体整合有权利要求4所述的基因表达盒。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的染色体整合有一个或多个拷贝的权利要求1所述的转基因构建物或权利要求4所述的基因表达盒。
10.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞、低等真核细胞、或高等真核细胞。
11.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，在所述的宿主细胞为小鼠细胞。
12.权利要求1所述的转基因构建物、或权利要求4所述的基因表达盒的用途，其特征在于，用于特异性调控外源Cre基因在动物附睾头部特异表达。
13.一种制备转基因动物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供转基因的动物细胞，所述动物细胞含有权利要求6所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的转基因构建物、或其染色体整合有权利要求4所述的基因表达盒；
(b)将步骤(a)所述的转基因的细胞再生为动物，从而获得转基因动物。
14.一种转基因动物的用途，所述的转基因动物是用权利要求13所述的方法制备的，其特征在于，所述的转基因动物用于小鼠附睾头部区域特异敲除或过表达目标靶基因。
15.一种在动物附睾头部特异性表达外源Cre基因的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供权利要求1所述的转基因构建物；
(b)将步骤(a)中的转基因构建物导入动物细胞，获得转化的动物细胞；
(c)将步骤(b)中转化的动物细胞再生成动物，从而使外源Cre基因在动物附睾头部特异性表达。
16.一种在动物附睾头部区域特异敲除目标靶基因的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供权利要求1所述的转基因构建物；
(2)用步骤(1)的转基因构建物转化动物细胞，获得转化的动物细胞；
(3)将步骤(2)中转化的动物细胞再生成动物，从而使外源Cre基因在动物附睾头部特异性表达；
(4)将步骤(3)中获得的转基因动物与floxed化的转基因动物交配，从而可获得特异敲除目标基因的子代动物。
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