CN101712946A - 构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，包括精确孕期小鼠的获取、胚胎性别鉴定、生殖结节的切取和培养、培养生殖结节的鉴定等步骤。本发明路线合理，易操作，为进一步研究阴茎尿道发育机制和外生殖器畸形的发病机制提供了有效工具。

Description

构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法

技术领域：

本发明涉及一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法。

背景技术：

尿道下裂发病因素繁多，机制复杂，遗传因素是尿道下裂发生的一个原因，但近年来环境中内分泌干扰性化学物质的增多，特别是雌激素摄入的增多被认为是尿道下裂发病率增加的一个关键因素，我们已经成功建立了雌激素诱导的尿道下裂动物模型，研究一些内分泌干扰化学物质与阴茎发育之间的关系，特别是揭示其中的机制对尿道下裂的防治至关重要，但在研究阴茎发育时目前缺乏相关的工具，动物模型研究虽然有效但不方便，小鼠阴茎的发育与人类相似，我们在研究中发现小鼠生殖结节发育在性分化期(E14.5d)前小于1mm³，适于器官培养。我们设想通过生殖结节在体外进行器官培养建立尿道体外发育模型，为进一步研究阴茎尿道发育机制和外生殖器畸形的发病机制提供有效工具。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种方法合理，易操作的构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

(1)精确孕期小鼠的获取：取8-10周龄近交系小鼠，于晚上按雌雄4∶1合笼，第二天早上分笼，分笼时观察雌鼠阴道内阴栓情况，以阴道口看见白色浆液性栓子者为交配成功，予以分开饲养，定为孕0.5d计算，交配未成功者可予以再交配；

(2)胚胎性别鉴定：采用解剖法或PCR法进行性别鉴定；

(3)生殖结节的切取和培养：

①断颈处死孕鼠，将其固定于取材板上，75％酒精消毒皮肤，剖开腹部及子宫，取出胎鼠放入培养皿中；

②解剖显微镜下寻找到生殖结节，于其根部用膜状内障剪迅速剪下，将离体生殖结节迅速转移至培养液中；

③将

-CM插入式细胞培养皿预先放入BGJB培养液中37℃浸泡30分钟，然后在6孔板中每孔加培养液1.1ml，放入

-CM板；

④将待培养的生殖结节放置于-CM板的微孔膜上，保留生殖结节表面的液膜；

⑤每块

-CM板的微孔膜上均匀放置4～5枚生殖结节；

⑥将6孔板放入CO₂培养箱中，24小时换液一次，每次换液注意调节液面，使得生殖结节一直处于气液相交界处；

⑦培养分组：将生殖结节分成加生理浓度10nM DHT的DHT组及不加DHT的无DHT组；

(4)培养生殖结节的鉴定：采用生殖结节培养前后形态和大小测量方法、生殖结节激光共聚焦三维成像方法、生殖结节冰冻切片HE染色法中至少一种进行鉴定。

步骤(2)中的解剖法包括下列步骤：小鼠胚胎腹部取大十字切口，切开后去除腹腔内容物，显示后腹腔，于肾脏下方，膀胱外上方寻找性腺，睾丸为微小球形，边缘有附睾附着，并与输精管相连，下方有睾丸引带附着，卵巢为一细线形的组织；有睾丸者为雄性胚胎，未找到睾丸或找到卵巢者为雌性。

步骤(2)中的PCR法包括下列步骤：

①PCR扩增对象：小鼠胚胎肝脏；

②常规基因组DNA提取：

③PCR检测

a、引物设计：SRY(雄性性别决定基因)：上游引物：5′-ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3′，下游引物：5′-CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3′，内参：GAPDH，上游引物：5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3′，下游引5′-ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3′。

b、反应体系：

取PCR反应专用的0.25ml薄壁EP(德国Eppendorf公司简称)管，按下列顺序加入各试剂：10×反应缓冲液2.0μl；25mmol/L  MgCl₂2μl；2.5mmol/L dNTPs 0.5μl；25pmol/μL SRY基因上下游引物各0.8μl；25pmol/μLGAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)上下游引物各0.8μl；5u/μl Taq酶0.25μl；模板DNA 1μl；加无菌去离子水11.05μl至20μl，，溶液混合均匀，4℃下离心，使溶液沉于管底；

c、扩增程序：按下列程序在PCR扩增仪上操作，94℃4min预变性，然后94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸15秒，共35次循环，最后72℃延伸5min后终止扩增；

d、称取琼脂糖1.2g，加入10倍电泳缓冲液10ml，再加入蒸馏水90ml，在电炉上加热溶解，配制成1.2％琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液2滴。

e、将电泳模板两端密封，倒入琼脂糖凝胶溶液，插入梳子，冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中；

f、加样：取样品溶液10μl，加入1/5体积加样缓冲液，混匀后，将溶液加到样品孔中，同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。一般DNA样品最好控制在0.5～1.0μg之间。

g、电泳：加入1×Tris-乙酸缓冲液(TAE缓冲液)，通电维持80V，电泳至溴酚蓝走到胶中后1/3处停止电泳；

h、染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm或300nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光，即时拍照；

④结果的判定

170bp为内参GAPDH，122bp为SRY基因，内参阳性者为扩增有效，SRY阳性为雄性，阴性为雌性。

生殖结节培养前后形态和大小测量方法包括下列步骤：

1)将6孔板直接放于解剖显微镜下观察，调节至同一放大倍数，以细胞计数板刻度为刻度标准，解剖显微镜连接相机对每个生殖结节拍照；

2)对每个生殖结节进行大小测量，测量指标包括生殖结节纵轴最大长度，生殖结节表面积；

3)对72小时生长前后数据进行统计分析。

生殖结节激光共聚焦三维成像方法依次包括下列步骤：

a、将培养后的生殖结节取出，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤；

b、用4％多聚甲醛4℃下固定1小时。

c、用PBS摇洗20分钟×5次；

d、用含1％tritonX-100(非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚)、2％脱脂奶粉、5％羊血清的PBSMT(PBS+0.1％Triton+2％脱脂牛奶)封闭，4℃下摇动过夜；

e、弃上清，标本投入PBS稀释的鼠抗人CK(细胞角蛋白)，PBS与鼠抗人CK的质量比为150∶1，4℃下摇动过夜；；

f、弃上清，PBS摇洗1小时×5次；

g、加PBS稀释的羊抗鼠IgG，PBS稀释的羊抗鼠IgG的质量比为100∶1，4℃下摇动过夜；

h、弃上清，PBS摇洗1小时×5次；

i、激光共聚焦显微扫描，三维成像：488nm氩激光激发，40×物镜，每个生殖结节标本由腹侧面向背侧面逐层扫描，沿Z轴扫描150μm，层厚2μm，每个生殖结节标本扫描75张，三维重建。

生殖结节冰冻切片HE染色法依次包括下列步骤：

A、生殖结节定位和冰冻切片

1)先在冰冻切片切片平板上放上少量的OCT包埋剂，待稍凝固，然后再将生殖结节放入OCT中包埋，切面向上，再喷上OCT包埋剂，放入冰冻切片机箱内，继续冰冻至切片温度达-19～-20℃；

2)切片：冰冻切片，切片切出后，利用组织切片与载片的温差立即贴片；

3)切片厚度设为8μm，沿生殖结节冠状面切片，含尿道全长的切片为有效片，即为通过尿道长轴的冠状面切片；所有切片用4％多聚甲醛4℃下固定30分钟后浸于PBS中，4℃下保存备用；

B、HE染色：

(1)冰冻切片固定10～30s，进入下面处理过程；(2)水洗1～2s；(3)苏木精液60℃下染色30～60s；(4)流水5～10s洗去苏木精液；(5)用1％盐酸乙醇洗1～3s；(6)水洗1～2s；(7)促蓝液返蓝处理5～10s；(8)流水冲洗15～30s；(9)0.5％曙红液染色30～60s；(10)蒸馏水洗1～2s；(11)80％乙醇处理1～2s；(12)95％乙醇处理1～2s；(13)无水乙醇处理1～2s；(14)石炭酸二甲苯处理2～3s(15)二甲苯第一次处理2～3s；(16)二甲苯第二次处理2～3s；(17)中性树胶封固。

本发明路线合理，易操作，为进一步研究阴茎尿道发育机制和外生殖器畸形的发病机制提供了有效工具。

附图说明：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是生殖结节的切取示图。

图2是胎鼠性别鉴定性腺解剖示图。

图3是胎鼠性别鉴定SRY基因PCR扩增示图。

图4是体外培养72小时前后生殖结节镜下状态图。

图5是培养基中不含DHT和含有10nM DHT生殖结节体外培养72小时前后长度和表面积的变化图。

图6是E14.5天和E17.5天生殖结节(雄)通过尿道纵轴的冠状面冰冻切片HE染色图。

图7是体外培养72小时的生殖结节(雄)通过尿道纵轴的冠状面冰冻切片HE染色图。

图8是培养72小时的生殖结节(10nM)三维激光共聚焦图。

图1中A：孕鼠；B：串珠样排列的子宫；C：小鼠胚胎；D，E：生殖结节。图2中A、B：雌性；C、D：雄性；↑：卵巢；▲：睾丸。图3中SRY、GAPDH扩增阳性者为雄性(♂)；GAPDH阳性SRY阴性者为雌性(♀)。图4中A1，A2：含10nM DHT培养72小时前后生殖结节解剖显微镜下所见；A3～A6：含10nM DHT培养前(A3)、24小时(A4)、48小时(A5)、72小时(A6)后的生殖结节倒置相差显微镜下所见。B1：培养前生殖结节解剖显微镜下所见；B2、B3：不含DHT体外培养72小时前后生殖结节倒置相差显微镜下所见。图6中A，B：E14.5天生殖结节；C，D：E17.5天生殖结节.箭头指的是尿道/尿道板。图7中A，B：培养基中含10nM DHT培养72小时的生殖结节；C，D：培养基中不含10nM DHT培养72小时的生殖结节。图8中箭头：尿道/尿道板；*：包皮隆起；三角形：尿道外口。

具体实施方式：

1材料

动物来源：8-10周龄C₅₇BL/6J近交系小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

主要实验材料：

培养器具：30mm

-CM亲水性PTFE膜器官型细胞培养皿，6孔细胞培养板。

实验器材：眼科剪、显微剪、显微镊、16mm特长尖弯膜状内障剪、、无菌操作台。纯水系统Millipore，U.S.A；5-45倍连续变倍解剖显微镜：XTZ-E，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司。

恒温CO₂培养箱：Forma Scientific，U.S.A

普通台式离心机Heraeus，U.S.A

精密天平Mettler Toledo，Switzerland

恒温摇床太仓市华美生化仪器厂

倒置相差显微镜尼康U.S.A.

高速恒温冷冻离心机：Heraeus，U.S.A

超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司

培养皿：FALCON Franklin Lakes NT，U.S.A

离心管：FALCON Franklin Lakes NT，U.S.A

普通PCR仪：Biometra T3thermocycler PCR扩增仪，德国

实时定量PCR仪(QPCR仪)：stratagene，MX3000P，U.S.A

培养液：BGJB培养液(Gibco，USA)、双氢睾酮(DHT，IL公司USA)。生殖结节培养基由BGJB培养液加牛胰岛素3U/ml、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、Herps 20mmol/L、L-抗坏血酸0.1mg/ml(Sigma-Aldrich USA)构成。称量适量双氢睾酮粉末用无水乙醇溶解至10μM，然后再稀释1000倍加入培养液使之浓度为10nM。

磷酸盐缓冲液(PBS)：每升液体含Nacl8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O₂3.44g，KH₂PO40.2g，双蒸水配制，等渗，PH值7.2，分装后高压蒸汽灭菌，4℃保存。

固定液：4％多聚甲醛组织固定液，4％多聚甲醛+10％蔗糖组织固定液，30％蔗糖液。

染色液：苏木精染液，伊红染液，safranino染液。

2方法

E14.5d雄性生殖结节的获取和培养

精确孕期小鼠的获取：

8-10周龄C₅₇BL/6J近交系小鼠，雌性小鼠40只，雄性小鼠10只，于晚上7点按雌雄4∶1合笼，第二天早上7点分笼，观察雌鼠阴道内阴栓情况。以阴道口看见白色浆液性栓子者为交配成功，予以分开饲养，定为孕0.5d计算，交配未成功者可予以再交配。

胚胎性别鉴定：

1)解剖法

小鼠胚胎腹部取大十字切口，切开后去除腹腔内容物，显示后腹腔，于肾脏下方，膀胱外上方寻找性腺，睾丸为微小球形，边缘有附睾附着，并与输精管相连，下方有睾丸引带附着，卵巢为一细线形的组织。有睾丸者为雄性胚胎，未找到睾丸或找到卵巢者为雌性。

2)PCR法

①PCR扩增对象：小鼠胚胎肝脏；

②基因组DNA提取：试剂盒内容：缓冲液GA 15ml缓冲液GB 15ml缓冲液GD 13ml漂洗液PW 15ml洗脱缓冲液TE 15ml蛋白酶K 1ml吸附柱CB350个收集管(2ml)50个

DNA提取：

1、动物组织应先打碎处理为细胞悬液，然后10,000rpm(～11,200×g)离心1分钟，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

2.加入20μl蛋白酶K溶液，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

4.加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

11、DNA定量：在紫外分光光度剂上分别检测260nm和280nm波长的吸光值，以OD₂₆₀/OD₂₈₀＞1.8为标准检验提取DNA的纯度，并按OD₂₆₀数值计算DNA浓度。

③PCR检测

PCR试剂盒：10×缓冲液(KCl 500mmol/L、Tris-HCl 100mmol/L(pH9.0)、TritonX-1001.0％)750μl；25mmol/L MgCl₂750μl；5u/L Taq酶100μl；dNTPs  2.5mmmol/L

1、引物设计：SRY：上游引物：5′-ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3′下游引物：5′-CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3′内参GAPDH上游引物：5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3′下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3′以上引物由上海生工生物工程有限公司提供。

2、反应体系：

取PCR反应专用的0.25ml薄壁EP管，按下列顺序加入各试剂。操作中，装酶的EP管始终置于冰浴中，以免活性破坏。10×Reaction buttfer(反应缓冲液)2.0μl；25mmol/L MgCl₂2μl；2.5mmol/L dNTPs 0.5μl；25pmol/μLprimer-SRY10.8μ；25pmol/μL primer-SRY20.8μl；25pmol/μLprimer-GAPDH1 0.8μl；25pmol/μL primer-GAPDH 20.8μl；5u/μl Taq酶0.25μl；模板DNA 1μl。加无菌去离子水11.05μl至20μl，手指轻弹EP管底部，使溶液混合均匀。4℃1000rpm离心30sec，使溶液沉于管底。

3、扩增程序：按下列程序在PCR扩增仪(Perkin Elmer cetus2400)上操作，94℃4min预变性，然后94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸15sec，共35次循环，最后72℃延伸5min后终止扩增。

4、称取琼脂糖1.2g，加入10倍电泳缓冲液10ml，再加入蒸馏水90ml，在电炉上加热溶解，配制成1.2％琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液2滴。

5、将电泳模板两端密封，倒入琼脂糖凝胶溶液，插入梳子，冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。

6、加样：取样品溶液10μl，加入1/5体积加样缓冲液，混匀后，将溶液加到样品孔中，同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。一般DNA样品最好控制在0.5～1.0μg之间。

7电泳：加入1×TAE缓冲液，通电维持80V，电泳至溴酚蓝走到胶中后1/3处停止电泳。

8、染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm或300nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光，即时拍照。

④结果的判定

170bp为内参GAPDH，122bp为SRY基因，内参阳性者为扩增有效，SRY阳性为雄性，阴性为雌性。

生殖结节切取和培养：

1)断颈处死孕鼠，将其固定于取材板上，75％酒精消毒皮肤。剖开腹部及子宫，取出胎鼠放入培养皿中。

2)解剖显微镜下寻找到生殖结节，于其根部用膜状内障剪迅速剪下，将离体生殖结节迅速转移至培养液中。

3)

-CM插入式细胞培养皿预先放入BGJB培养液中37℃浸泡30分钟，然后在6孔板中每孔加培养液1.1ml，放入

-CM板。

4)将待培养的生殖结节放置于-CM板的微孔膜上，注意保留生殖结节表面的液膜。

5)每块

-CM板的微孔膜上可放置4～5枚生殖结节，注意均匀分布。

6)将6孔板放入CO₂培养箱中，24小时换液一次，每次换液注意调节液面，使得生殖结节一直处于气液相交界处。

7)培养分组：加生理浓度的10nM DHT组20枚，无DHT组18枚。培养生殖结节的鉴定

生殖结节培养前后形态和大小测量

1)将6孔板直接放于解剖显微镜下观察，调节至同一放大倍数，以细胞计数板刻度为刻度标准，解剖显微镜连接尼康Coolpix s100数码相机对每个生殖结节拍照。

2)运用IPP软件对每个生殖结节进行大小测量，测量指标包括生殖结节纵轴最大长度(μm)，生殖结节表面积(mm²)。

3)所有测量数据直接导入excel表格，建立数据库，测量数据以χ±s，表示，对72小时生长前后数据用SPSS软件进行配对t(时间)检验的统计分析和作图。

生殖结节CK14(角蛋白14)整体免疫荧光染色，激光共聚焦三维成像

1、生殖结节9枚(E14.5dGT体外培养72小时，10nM DHT诱导)，取出后PBS洗3遍，每遍3分钟。

2、4％多聚甲醛固定1小时(4℃)。

3、PBS摇洗20分钟×5次。

4、PBSMT(1％tritonX-100，2％脱脂奶粉，5％羊血清)封闭，4℃摇动过夜。

5、弃上清，标本投入用PBS稀释的鼠抗人CK，PBS与鼠抗人CK的质量比为150∶1，4℃下摇动过夜；

6、弃上清，PBS摇洗1小时×5次；

7、加PBS稀释的羊抗鼠IgG，PBS稀释的羊抗鼠IgG的质量比为100∶1，4℃下摇动过夜；

8、弃上清，PBS摇洗1小时×5次。

9、激光共聚焦显微扫描，三维成像。氩激光(488nm)激发，物镜×40，每个模型由腹侧面向背侧面逐层扫描(沿Z轴扫描150um，层厚2um)，每个标本扫描75张，三维重建。

生殖结节冰冻切片HE染色

1、生殖结节定位和冰冻切片

1)先在冰冻切片切片平板上放上少量的OCT包埋剂，待稍凝固，然后再将生殖结节放入OCT中包埋，切面向上，再喷上OCT包埋剂适量，放入冰冻切片机箱内，继续冰冻5min左右，切片温度达-19～-20℃为最适宜。

2)切片：冰冻切片时，将防卷板调整到与切片刀为5°左右，且防卷板上方与刀刃在同一水平线上较理想。切片切出后，利用该组织切片与载片的温差立即贴片。

3)切片厚度设为8μm，沿生殖结节冠状面切片，含尿道全长的切片为有效片，即为通过尿道长轴的冠状面切片。所有切片用4％多聚甲醛4℃固定30分钟后浸于PBS中，4℃保存备用。

2、HE染色：

(1)冰冻切片固定10～30s；(2)稍水洗1～2s；(3)苏木精液染色(60℃)30～60s；(4)流水洗去苏木精液5～10s；(5)1％盐酸乙醇1～3s；(6)稍水洗1～2s；(7)促蓝液返蓝5～10s；(8)流水冲洗15～30s；(9)0.5％曙红液染色30～60s；(10)蒸馏水稍洗1～2s；(11)80％乙醇1～2s；(12)95％乙醇1～2s；(13)无水乙醇1～2s；(14)石炭酸二甲苯2～3s(15)二甲苯第一次处理2～3s；(16)二甲苯第二次处理2～3s；(17)中性树胶封固。

结果与讨论：

生殖结节在体外培养72小时后，DHT组发生了明显的形态变化，培养前原始的包皮隆起位于生殖结节基底部，培养72小时后生殖结节变长，还可以看到明显的包皮分化发育，向上逐渐包绕生殖结节干。而无DHT组的生殖结节生长明显受到抑制，体积的增大和包皮的发育均明显延迟于DHT组。

生殖结节在体外培养72小时后，生殖结节明显生长，DHT组的生长明显大于无DHT组，以生殖结节纵轴最大长度和表面积为生长指标，DHT组由培养前的1132.58±61.27μm，1.020±0.037mm²增长至培养后的1607.60±102.19μm，1.485±0.077mm²，纵轴长度和表面积的增加度分别为42.0％，45.6％。而无DHT组虽然比培养前体积有明显增加，但相比DHT组，其生长明显受到影响，其纵轴长度和表面积分别由培养前的1136.95±57.35μm，1.024±0.041mm2增加到了1471.22±68.46μm，1.413±0.053mm2，增加率分别为29.4％，38.1％，按照配对t检验，DHT组的生殖结节生长速度高于无DHT组，两者统计学有显著差异(t＝9.0513，6.0567，P＜0.05)。

从通过尿道纵轴的生殖结节冠状面冰冻切片的HE染色，观察生殖结节中的尿道发育，培养前的E14.5d，尿道为位于生殖结节中心偏腹侧的单层实性上皮细胞索，E17.5天生殖结节中尿道近端出现明显的管化趋势，尿道上皮细胞增生明显，形成分层的复层上皮结构，细胞呈现立方形的成熟分化表现。在10nM DHT生理剂量的睾酮存在下，体外培养3天后，生殖结节中尿道的发育形态学变化与体内同期生殖结节中的尿道变化(E17.5d))是一致的。而无DHT组中，我们发现尿道上皮尽管增生明显，但上皮细胞形态较圆，近端管化不全。

对生殖结节在10nM DHT条件下培养72小时的生殖结节进行CK14荧光染色，再进行激光共聚焦三维重建，我们可以看到生殖结节基底部有明显的包皮隆起，尿道中心出现管化，生殖结节顶端尿道外口正在形成。

器官培养是一种优于细胞培养的体外技术，其主要理由是保持结构的完整性。虽然细胞培养是利用机械分离或酶消化分离的细胞，或者是自发迁移的细胞，但器官培养是以维持见于正常组织的细胞联系为目的。最初，选择器官培养以促进组织学特征形成，但最后发现某些表型成分的表达仅见于维持细胞密切结合时。现在认识到，相互联系的细胞经连接通讯(缝隙连接)、旁分泌因子和细胞粘附分子交换信息。细胞之间发放信号是器官形成中最引人注目的，或许也是维持完全成熟的组织所需要的。因此，维持原有组织结构的完整性，可保存存在于原有组织中正确的同种和异种细胞的相互作用和维持细胞外基质的正确构型

生殖结节是哺乳动物外生殖器发育的原基，在哺乳类外生殖器形成的初期，即外生殖器的衍化胚胎发育的第三周末，后肠末端膨大，形成泄殖腔。约在胚胎的第四周，由于中胚层增殖，在尿生殖口(尿生殖窦)的头端形成的小突起，称为生殖结节。雄性发展成阴茎，雌性则形成阴蒂。被生殖结节的尾侧正中线的沟(尿道沟)隔开的皮皱，为尿道褶，它向后延伸，从两侧夹住尿生殖口。进而包围生殖结节和尿道褶，其外侧有不太明显的隆起，为生殖隆起。在雄性的尿道褶左右融合形成阴茎的尿道，还形成包皮。雌性的尿道褶夹住由尿生殖窦分化来的阴道前庭，形成小阴唇。在雄性的生殖隆起左右，在正中线融合形成阴囊，雌性的生殖隆起变化不大，人及其它高等哺乳动物中形成大阴唇。

小鼠生殖结节的发育和人类相似，由于发育周期较人类等哺乳动物短，因此便于研究和观察。在小鼠，交配后第10.5天，胚胎生殖结节开始隆起，小鼠生殖结节的发育可以分为二个阶段，从E10.5天发生至E14.5d为GT外生(outgrowth)阶段，该阶段的生长是雄激素信号非依赖性的，原始尿道上皮为生殖结节极性向外生长提供信号，其中shh、hoxa13、fgf8是诱导生殖结节生长的关键信号因子，通过控制细胞增殖和凋亡维持结节的极性外生，任何一种因子的异常都将导致生殖结节生长延迟甚至缺如。从E14.5d起生殖结节的发育进入到以分化为主的阶段，外部出现包皮的生长，内部有尿道的管化延伸。在这个阶段中最重要的就是雄激素信号对生殖结节的诱导分化，包括睾丸分泌睾酮，经5α还原酶转化为双氢睾酮，雄激素受体以及下游基因的表达，任何一个环节的异常都可将导致阴茎尿道发育异常，尿道下裂就是最常见的生殖结节先天性发育异常之一，发病率约占存活人群1/250至1/300。严重尿道下裂患儿在出生时其外生殖器外观异常，导致其父母在对他们的性别取向上形成感情和心理上的矛盾，并伴随一系列问题。70年代和80年代在欧洲尿道下裂的发病率呈不明原因的增长。来自美国两个先天性畸形监测系统的资料亦显示尿道下裂的发病率不明原因的成倍增长，美国疾病控制中心的研究特别注意到严重的、而不仅是中等度的尿道下裂发病比率在整个尿道下裂发病比率中增高，而这一比率的增高不是由于监测与报告数量的增加。

研究生殖结节的发育机制以及由于生殖结节发育异常引起的阴茎尿道发育异常的机制一直是胚胎学家和泌尿外科学家努力的目标，比如在研究尿道下裂发生机制时，有学者取尿道下裂组织或者包皮组织作为研究对象，也有取尿道下裂患者局部的成纤维细胞在体外进行基因调控方面的研究，研究虽然探讨了尿道阴茎发育中的一些机制，但一个问题没有得到重视，即阴茎尿道的发育分化是生殖结节中多种细胞相互作用的结果。生殖结节由中心的来自内胚层的原始尿道上皮索，两侧的间充质细胞，外表披覆的来自外胚层的上皮细胞组成，上皮细胞与间充质细胞间的相互影响在正常的阴茎生长分化中起着关键性作用。把各种不同类型的上皮组织与其相应的间充质组织分离开来，再重新以不同的重组以观察上皮细胞与间质细胞之间信息传递的重要性。当正常的细胞信息传递存在时，小鼠的泌尿生殖结节呈现正常的生长和分化(以小鼠的阴茎软骨存在为指标)，而相对应的当把正在发育中的上皮组织去除时(如外胚层源的表皮组织和内胚层源的尿道上皮组织)，则严重影响小鼠泌尿生殖结节的生长，因此在研究阴茎尿道发育时要充分考虑到多种细胞之间的相互作用以及它们存在的空间关系，单单就某一类细胞进行研究很难得出科学的结论。

我们在研究中发现，小鼠生殖结节在胚胎14.5天时体积大约在0.6-0.8mm³，位于会阴部脐血管根部的下方，胎尾根部的前方，生殖结节与胎尾之间可见原始肛门。生殖结节基底部可见原始的待发育的包皮隆起，生殖结节腹侧面可见尚未闭合的裂缝状尿道沟。就生殖结节的体积而言无疑是很适合器官培养的。器官培养有利于维持生殖结节内部细胞的三维结构，在此基础上研究阴茎尿道分化更具科学性和可信度。一般来讲，要维持器官型植块正常的三维结构，使之按照近似于在体时的生长发育规律进行生长和分化，在培养过程中必须注意两个基本原则：第一，提供充足的营养和O₂，并及时排除代谢废物。这是维持器官型植块生存和正常生长的首要条件。否则，失去了在体时循环系统供应的器官型植块将发生内部坏死。第二，要抑制细胞从植块向外迁移。尽可能防止器官型植块内的细胞在培养过程中发生迁移，这是维持器官型植块三维结构的重要条件。胚胎器官培养与成体器官培养存在着明显的差异。胚胎器官的能量主要来源是糖酵解，故培养时可不必另外补充O₂。另外，由于胚胎早期的器官原基体积都比较小，故可将整个器官进行培养。因此，在合适的条件下，一方面胚胎器官能存活几个月，器官体积可以增大，器官原基在体外生长都会发生类似于体内的生长发育过程，表现出相似的自主分化特征；另一方面胚胎器官的细胞生长活跃，迁移能力强，体外培养时，细胞极易从植块迁移出来。为维持植块的三维结构，应尽量减少细胞迁移。

离体器官失去了体循环供应养分后，其营养的获取不同于体内，它是通过培养液中营养物质的渗透和气体扩散实现的，植块器官过大，气体营养无法弥散至器官内部可导致植块组织内部缺氧坏死，因此对于较大的器官只能取一小块植块进行培养，如体外进行前列腺、睾丸、脑组织、肠道的器官型培养，只能将待培养组织切成小块进行培养

一般来讲要使器官型植块在体外培养时获得充足的气体交换和营养渗透，植块体积须小于2mm×2mm×2mm，E14.5天的生殖结节体积远小于此，属于胚胎器官，其代谢以无氧酵解为主，对氧气的要求不高，因此我们将切下的生殖结节完整放入37℃CO₂培养箱内培养。生殖结节的取材非常重要，操作时要尽可能将损伤降低到最小。取材的刀剪应十分锋利，通常采用眼科手术中的白内障刀来切取植块。切取时植块须放入培养液中，动作要既迅速又轻柔。唯有迅速切下的生殖结节其创面才最平整，组织结构才最完整。体外培养时营养成分和气体易于弥散，代谢产物容易清除，从而保证生殖结节的正常存活。

我们在培养中发现生殖结节在生长过程中不断有细胞从基底部向外弥散，这种细胞的向外迁移其实是器官培养的一个共同生长特征，就是在培养过程中，器官内部的细胞能够向外迁移。一般来讲使用不同的培养方法和条件，培养不同来源的植块，所迁移出来的细胞数量有很大差异。胚胎组织基于其发育分化特性，细胞的迁移要比成体组织的细胞弥散得多。如果这种迁移太甚，植块就有可能失去其特定的三维结构和功能。要抑制培养器官植块内细胞向外迁移，其措施有三项：①将器官植块置于难以牢固私附的支持物(如琼脂)表面，或利用网格状支持物减少植块的附着面，从而抑制或减少细胞的迁移；②利用琼脂能限制植块内细胞外迁，又不影响营养物质供应的特性，将器官型植块置于琼脂溶液中片刻取出或向植块上滴加琼脂液，待琼脂凝固后即形成包裹植块的表面琼脂薄膜。不过此法较少应用；③经常移动植块到新鲜的支持物上面，更换附着面，也能限制细胞迁移。我们在本研究中选用了Millicell-CM型Biopore插入式组织培养皿作为生殖结节体外器官培养的支持物，该装置是近年来新出现的专门用于三维组织结构精密研究的一个特殊器具。又名组织培养小室，Transwell小室等。其中的PICMORG50又名亲水性PTFE膜器官型组织培养皿，含有透明的Biopore膜，该膜具有高度的亲水性和生物相容性，孔径0.4μm，气体和营养物质可自由交换和扩散，该插入式培养皿呈类圆柱形，上小下大，上部外径30mm，底部外径31.5mm，内径27mm，膜面积4.2cm²，高5mm，插入板为站立式，底部有3个支撑底座，因此当置于6孔细胞培养板培养孔中时，Biopore微孔膜与6孔板底面有一段距离，当培养孔中加培养液1.1ml，培养液液面与微孔膜持平，此时培养于微孔膜上的生殖结节正好处于培养液和富含CO₂气体的交界处，利于气体交换和营养扩散。我们在研究中注意到当生殖结节放置于微孔膜上后，由于表面张力的作用，培养液迅速在生殖结节周围形成一层液膜，这样使得营养的扩散更加均匀，Biopore微孔膜具有高度的生物相容性，为避免细胞过分向外迁移，取材尤为重要，光滑的切面细胞很少迁移，而切面毛糙很容易导致细胞大量迁移，影响培养生殖结节形态。

器官培养一般都采用无血清的合成培养基，它除了含有基本营养成分外还可以根据体外培养物的生长特性添加多种有关的上涨因子和其它成分，营养物质全面而成分清楚，既能维持体外培养物的正常生存和生长，有可以消除由于添加天然培养基所造成的不确定因素对培养结果的干扰。本研究我们选择了BGJb(Fitton-Jackson改良型)无血清培养基，去除了血清中激素等复杂成分对生殖结节的影响，可有效的观察实验条件下生殖结节离体培养的生长状况。BGJb无血清培养基中富含氨基酸、维生素和微量元素，不含碳酸氢钠，含L-谷氨酰胺，是一种专门用于胚胎软骨细胞培养的改良型培养液，我们考虑到小鼠阴茎含有软骨的特点，因此有助于生殖结节的生长。在培养基中加入L-抗坏血酸和牛胰岛素，有助于生殖结节的生长和形态的维持。胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，利于体外培养的胚胎器官的存活、生长和发育。根据培养器官的不同，在培养基中加入一定量相应的激素能更好地维持体外培养器官植块的生长发育及器官功能。激素依赖性器官在体外仍保持对激素的敏感性和反应性，例如前列腺、子宫和睾丸等

糖皮质激素能够促进乳腺上皮细胞生长与增殖，维持体外培养的乳腺腺泡结构及其分化。催乳素和生长激素可使体外培养的静止期乳腺产生和分泌乳汁。此外，垂体激素(生长激素、催乳激素等)、雌激素、孕激素、前列腺素等对体外生长的器官组织都有不同的效应。我们在培养基中加入了生理剂量的雄激素-10nM双氢睾酮(DHT)，研究表明，在存在生理剂量雄激素条件下，生殖结节的生长分化要明显优于不含雄激素的培养组。生殖结节在体外培养72小时后，DHT组发生了明显的形态变化，培养前原始的包皮隆起位于生殖结节基底部，培养72小时后生殖结节变长，还可以看到明显的包皮分化发育，向上逐渐包绕生殖结节干。而无DHT组的生殖结节生长明显受到抑制，体积的增大和包皮的发育均明显延迟于DHT组。这与体内生殖结节发育的雄激素依赖性是一致的。我们在显微镜下对生殖结节的生长进行了监控，显微摄影后测量其培养前后的大小，对其生长进行量化比较。生殖结节在体外培养72小时后，生殖结节明显生长，DHT组的生长明显大于无DHT组，以生殖结节纵轴最大长度和表面积为生长指标，DHT组生殖结节纵轴长度和表面积的增加度分别为42.0％，45.6％。而无DHT组增加率分别为29.4％，38.1％，按照配对t检验，DHT组的生殖结节生长速度高于无DHT组，两者统计学有显著差异。

对于一个器官培养的成功与否，我们观察的指标包括形态和功能的变化。生殖结节在雄激素诱导下形态发生了明显变化，体积明显增大，另外一个重要的观察评价指标就是生殖结节内部尿道发育情况。在体内，尿道的发育经历了实性原始尿道上皮索到管化空腔尿道的变化。在体外，我们对培养前后的生殖结节进行了冰冻切片以期观察尿道管化、上皮增生的情况。经尿道长轴的含尿道全长的冠状面切片是唯一能同时观察全长尿道发育情况的手段，由于生殖结节体积微小，质地极脆，尿道位于生殖结节中心靠近腹侧面，尿道的厚度只有40-80μm，因此切片需要精确的定位，在本实验中我们制作了离体生殖结节的冰冻切片：使用进口包埋剂OCT包埋标本，预冻部分OCT于载物台，用刀削平，有利于生殖结节放置与方向控制；要求标本温度恰当，包埋后迅速将标本置于液氮蒸气上，在30秒内将包埋标本固化，然后在冰冻切片室低温箱内复温约3min，使标本的温度与低温箱的温度相同(标本温度过热切片组织易被挤压，组织结构重叠：温度太低时，切片组织易脆裂)；选择适当的切片角度，包埋前标好生殖结节纵轴方向，使切片方向与生殖结节纵轴方向一致，切片刀要求锋利，太钝容易造成组织破碎，高速切削可能会取得良好结果，但对含尿道上皮部分，仍需要低速，速度太快，切片厚度不均匀(我们采用8um)，还会造成上皮间充质分离，这一方法简单易行，但对冰冻切片机要求较高。为了防止脱片，除了预先在载片上涂上粘附剂(铬明矾液)或硅化玻片外，用吹风机常温下立即将切片吹干

我们在切片中最长碰到的问题就是组织中的冰晶造成组织破碎或者组合字结构不清。常用的防冰晶法有3种：(1)高渗透压脱水法：将新鲜取材的组织固定后迅速置于2O％～3O％的蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，待组织块沉底后，取出，PBS冲洗后用OCT胶包埋切片；经高渗蔗糖脱水后去除了组织中的大部分水分，可有效减少冰晶的形成。(3)低温骤冷法：将组织块置人低温环境中，使组织骤然降温。本实验室采用的是液氮骤冷，即将新鲜取材的组织或培养后的新鲜标本迅速置于液氮罐内10～30S，取出，OCT胶包埋后置于低温切片机内待其复温至-20℃左右即可切片。

我们从通过尿道纵轴的生殖结节冠状面冰冻切片的HE染色可以观察到生殖结节中全长的尿道发育，在培养前，即E14.5d生殖结节中，尿道呈单层实性上皮细胞索，在基底部有开始管化的分叉迹象，培养72小时后DHT组中尿道近端出现明显的管化趋势，尿道上皮细胞增生明显，形成分层的复层上皮结构，细胞呈现立方形的成熟分化表现，该变化与体内同期发育即E17.5d的生殖结节中的尿道变化是一致的。而无DHT组中，我们发现尿道上皮尽管增生明显，但近端管化不全，上皮细胞成熟性差，形态较圆。研究表明在体外，尿道发育也保留了体内的雄激素依赖性的特征。

近年来，尿道下裂等男性外生殖器发育畸形的发病率在逐渐上升，环境中有毒污染物质特别是一些内分泌干扰化学物质(EDCs)的增多被认为是罪魁祸首，一些能干扰内分泌的化学物质导致尿道下裂的动物模型已经构建成功，进一步阐明其机制对于尿道下裂等外生殖器发育畸形的防治至关重要，但阴茎和尿道的发育深藏于子宫内，不易观察，另外机体复杂的内分泌环境也很难阐明其机制，特别在临床研究中，阴茎尿道发育对一些物质短期毒性暴露的影响很难评估，而生殖结节体外器官培养就为这些研究提供了一个方便的工具，没有下丘脑垂体肾上腺轴的影响，体外环境相对简单，这就为研究一些可疑致畸物质的短期毒性作用提供了方便，也利于阐明一些内分泌干扰物质对阴茎尿道发育的直接影响。

Claims (5)

1.一种构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

(1)精确孕期小鼠的获取：取8-10周龄近交系小鼠，于晚上按雌雄4∶1合笼，第二天早上分笼，分笼时观察雌鼠阴道内阴栓情况，以阴道口看见白色浆液性栓子者为交配成功，予以分开饲养，定为孕0.5d计算，交配未成功者可予以再交配；

(2)胚胎性别鉴定：采用解剖法或PCR法进行性别鉴定；

(3)生殖结节的切取和培养：

①断颈处死孕鼠，将其固定于取材板上，75％酒精消毒皮肤，剖开腹部及子宫，取出胎鼠放入培养皿中；

②解剖显微镜下寻找到生殖结节，于其根部用膜状内障剪迅速剪下，将离体生殖结节迅速转移至培养液中；

③将

-CM插入式细胞培养皿预先放入BGJB培养液中37℃浸泡30分钟，然后在6孔板中每孔加培养液1.1m1，放入

-CM板；

④将待培养的生殖结节放置于-CM板的微孔膜上，保留生殖结节表面的液膜；

⑤每块

-CM板的微孔膜上均匀放置4～5枚生殖结节；

⑥将6孔板放入CO₂培养箱中，24小时换液一次，每次换液注意调节液面，使得生殖结节一直处于气液相交界处；

⑦培养分组：将生殖结节分成加生理浓度10nM DHT的DHT组及不加DHT的无DHT组；

(4)培养生殖结节的鉴定：采用生殖结节培养前后形态和大小测量方法、生殖结节激光共聚焦三维成像方法、生殖结节冰冻切片HE染色法中至少一种进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：步骤(2)中的解剖法包括下列步骤：小鼠胚胎腹部取大十字切口，切开后去除腹腔内容物，显示后腹腔，于肾脏下方，膀胱外上方寻找性腺，睾丸为微小球形，边缘有附睾附着，并与输精管相连，下方有睾丸引带附着，卵巢为一细线形的组织；有睾丸者为雄性胚胎，未找到睾丸或找到卵巢者为雌性。

3.根据权利要求1所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：步骤(2)中的PCR法包括下列步骤：

①PCR扩增对象：小鼠胚胎肝脏；

②常规提取基因组DNA

③PCR检测

a、引物设计：SRY：上游引物：5′-ATCGGAGGGCTAAAGTGTCA-3′，下游引物：5′-CCAGTCTTGCCTGTATGTGATG-3′，内参：GAPDH，上游引物：5′-GCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3′，下游引5′-ATGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3′。

b、反应体系：

取PCR反应专用的0.25ml薄壁管，按下列顺序加入各试剂：10×反应缓冲液2.0μl；25mmol/L MgCl2₂μl；2.5mmol/L dNTPs 0.5μl；25pmol/μL SRY基因上下游引物各0.8μl；25pmol/μL甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因上下游引物各0.8μl；5u/μl Taq酶0.25μl；模板DNA 1μl；加无菌去离子水11.05μl至20μl，，溶液混合均匀，4℃下离心，使溶液沉于管底；

c、扩增程序：按下列程序在PCR扩增仪上操作，94℃4min预变性，然后94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸15秒，共35次循环，最后72℃延伸5min后终止扩增；

d、称取琼脂糖1.2g，加入10倍电泳缓冲液10ml，再加入蒸馏水90ml，在电炉上加热溶解，配制成1.2％琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液2滴；

e、将电泳模板两端密封，倒入琼脂糖凝胶溶液，插入梳子，冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中；

f、加样：取样品溶液10μl，加入1/5体积加样缓冲液，混匀后，将溶液加到样品孔中，同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。一般DNA样品最好控制在0.5～1.0μg之间。

g、电泳：加入1×Tris-乙酸缓冲液，通电维持80V，电泳至溴酚蓝走到胶中后1/3处停止电泳；

h、染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm或300nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光，即时拍照；

④结果的判定

170bp为内参GAPDH，122bp为SRY基因，内参阳性者为扩增有效，SRY阳性为雄性，阴性为雌性。

4.根据权利要求1、2或3所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：生殖结节培养前后形态和大小测量方法包括下列步骤：

1)将6孔板直接放于解剖显微镜下观察，调节至同一放大倍数，以细胞计数板刻度为刻度标准，解剖显微镜连接相机对每个生殖结节拍照；

2)对每个生殖结节进行大小测量，测量指标包括生殖结节纵轴最大长度，生殖结节表面积；

3)对72小时生长前后数据进行统计分析。

5.根据权利要求1、2或3所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：生殖结节激光共聚焦三维成像方法依次包括下列步骤：

a、将培养后的生殖结节取出，PBS洗涤；

b、用4％多聚甲醛4℃下固定1小时。

c、用PBS摇洗20分钟×5次；

d、用含1％tritonX-100、2％脱脂奶粉、5％羊血清的PBSMT封闭，4℃下摇动过夜；

e、弃上清，标本投入用PBS稀释的鼠抗人CK，PBS与鼠抗人CK的质量比为150∶1，4℃下摇动过夜；

f、弃上清，PBS摇洗1小时×5次；

g、加PBS稀释的羊抗鼠IgG，PBS稀释的羊抗鼠IgG的质量比为100∶1，4℃下摇动过夜；

h、弃上清，PBS摇洗1小时×5次；

i、激光共聚焦显微扫描，三维成像：488nm氩激光激发，40×物镜，每个生殖结节标本由腹侧面向背侧面逐层扫描，沿Z轴扫描150μm，层厚2μm，每个生殖结节标本扫描75张，三维重建。

6、根据权利要求1、2或3所述的构建生殖结节器官培养尿道体外发育模型的方法，其特征是：生殖结节冰冻切片HE染色法依次包括下列步骤：

A、生殖结节定位和冰冻切片

1)先在冰冻切片切片平板上放上少量的OCT包埋剂，待稍凝固，然后再将生殖结节放入OCT(一种冷冻包埋剂)中包埋，切面向上，再喷上OCT包埋剂，放入冰冻切片机箱内，继续冰冻至切片温度达-19～-20℃；

2)切片：冰冻切片，切片切出后，利用组织切片与载片的温差立即贴片；

3)切片厚度设为8μm，沿生殖结节冠状面切片，含尿道全长的切片为有效片，即为通过尿道长轴的冠状面切片；所有切片用4％多聚甲醛4℃下固定30分钟后浸于PBS中，4℃下保存备用；

B、HE染色：

(1)冰冻切片固定10～30s，进入下面处理过程；(2)水洗1～2s；(3)苏木精液60℃下染色30～60s；(4)流水5～10s洗去苏木精液；(5)用1％盐酸乙醇洗1～3s；(6)水洗1～2s；(7)促蓝液返蓝处理5～10s；(8)流水冲洗15～30s；(9)0.5％曙红液染色30～60s；(10)蒸馏水洗1～2s；(11)80％乙醇处理1～2s；(12)95％乙醇处理1～2s；(13)无水乙醇处理1～2s；(14)石炭酸二甲苯处理2～3s(15)二甲苯第一次处理2～3s；(16)二甲苯第二次处理2～3s；(17)中性树胶封固。

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