CN113654889A - 一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法 - Google Patents

一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，该方法基于软骨梯度结构异性的分层切削并联合动态力学分析仪在等渗透压条件下测量软骨不同层次压缩模量的检测，通过设计梯度渗透压缓冲液，消除了软骨内部组织液渗透压带来的影响，实现了组织从高渗环境到等渗环境的逐步过渡，避免了软骨纤维变性导致力学性能受到影响。

Description

一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及到一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法。
背景技术
在关节中相连骨的表面，覆有一层关节软骨，或为透明软骨，或为纤维软骨。人一生中社会活动都离不开关节软骨的正常功能，关节软骨能将作用力均匀分布使承重面扩大，这样不但能最大限度的承受力学负荷，还能保护关节软骨不易受损伤。关节软骨是一种特殊的肌肉骨骼组织，具有分配机械负荷和降低关节摩擦力的作用。在关节软骨组织中，II型胶原纤维形成一个紧密的、高度互联的网络，主导着细胞外基质的超微结构。软骨的胶原蛋白网络具有特征性结构，即在关节表面附近形成一组切向的原纤维，在组织更深的区域过渡到整体的径向排列。嵌在纤维网络中的是带负电荷的蛋白聚糖，这些亲水分子吸引带正电荷的反离子，以保持整体的电中性，从而建立一个渗透梯度，吸引组织液进入组织。软骨的健康功能不仅依赖于生化组成，还依赖于组成细胞外基质的初级结构蛋白的组织。此外，软骨从表面到深层的生化成分性质并不是均一的，有研究表明，软骨中的流体分数约为80％，并从表面到深层逐渐减少。蛋白多糖占干重的20～30％，它们的浓度在关节表层附近最低，在中部最高。固定电荷密度定义为蛋白多糖网络中固定负电荷数除以自由水含量，在深部区域最高。胶原蛋白占关节组织干重的70％，其浓度在浅层和深层最高。
在日常生活中，运动而导致的碰撞、摔倒等造成的关节损伤非常普遍，尤其是膝关节软骨的损伤，由于关节软骨中细胞的再生能力极其有限，一旦损伤，自身很难修复，所以对关节软骨动力学特性进行准确的认识是至关重要的。由于关节软骨具有上述的特殊结构，因此不同空间层次对整体力学的作用也有差异，认清这种差异性对于后续关节软骨的仿生或治疗具有重要意义。
当前对软骨力学分析主要采用万能力学测试机，主要测试软骨压缩力学性能。即取部分或完整的关节软骨，固定于压力机平台上，压头向下施加压力，机器记录应力-应变曲线，计算得到关节软骨的整体模量。之后检测仪器更加先进，采用动态力学分析系统(DMA)可以获得更加精确的结果。动态力学行为是指材料在振动条件下，即在交变应力作用下做出的力学响应，即力学性能(模量、内耗)与温度、频率的关系。测定材料在一定温度范围内动态力学性能的变化就是动态力学分析，DMA的力分辨率可达0.00001N，应变分辨率可达1nm，极大的提高了结果精确性。但这些方法只能测得软骨整体力学性质，无法研究软骨各个层次对整体力学的影响。
除此之外，近年来采用三维有限元研究关节受力分析也有许多报导。有限元法是将连续的弹性体分割成有限个单元，以其离散体来代替原连续体，在研究每个单元性质的基础上，获得满足边界条件的整个弹性体的位移和应力场，因此三维有限元法能够对复杂的结构、形态、载荷和材料力学性能进行分析比较。三维有限元法的优势之一可以计算机模拟将关节分割不同层次，计算不同层次受力情况。但有限元法需要确定软骨成分及结构的复杂参数，数据的精确性直接影响结果准确性。
此外，关节囊内由于含有高渗性关节囊液或滑膜液，在软骨表面会有少量高渗性液体残留，而软骨内部则为等渗的生理环境。渗透压左右软骨组织内在应力来源之一，在软骨行使作用过程中有重要功能，测量软骨力学时必须减少高渗液体带来的影响，而在以往的测量方法中并没有将此部分考虑在内。
因此，当前缺乏一种有效的方法，能够在消除高渗液体环境下，准确检测关节软骨不同分层结构力学性质。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，可以克服上述问题。
为达上述目的，本发明提供了一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，包括以下步骤：
(1)取材
选取新鲜屠宰或处死猪的关节样本，连续用内径6-8mm打孔器钻取4-5个圆柱体软骨-骨块；打磨至底面光滑并且高度一致，使用生理盐水冲洗3-6次；
(2)组织平衡
将经过步骤(1)处理后的软骨-骨块依次浸泡于高渗缓冲液和等渗缓冲液中，分别浸泡20-30min；
(3)包埋
将浸泡后的软骨-骨块吸去水分，于包埋剂中室温浸泡3-5h，静置0.5-1h；
(4)切片
将静置后的软骨-骨块进行切片，首先切片至出现软骨表组织，再切去梯度厚度的切片，将剩余的软骨-骨块置于等渗缓冲液中冲洗；
(5)检测
将冲洗后的软骨-骨块置于DMA载物平台上，使用压缩模具，校准机器后，压缩模式下测试压缩模量，随后分析压缩模量大小的差异性，统计分析并得出结论。
进一步地，步骤(1)关节样本整体外形均匀，无骨赘增生物，软骨表面完整光滑无破损。
进一步地，步骤(2)中的高渗缓冲液通过以下方法制得：称取16g NaCl，0.4g KCI，1g NaN3，2.88g Na2HPO4和0.48g KH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，即得。
进一步地，步骤(2)中的等渗缓冲液通过以下方法制得：称取8g NaCl，0.2g KCl，1g NaN3，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，即得。
进一步地，高渗缓冲液和等渗缓冲液的温度均为3-5℃。
进一步地，步骤(3)静置后的软骨-骨块还包括以下步骤：于冰冻切片机样品托上涂抹包埋剂，将静置后的软骨-骨块与样品托粘连。
进一步地，步骤(4)中的梯度厚度包括100μm、200μm、300μm、400μm及以上厚度。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明通过设计梯度渗透压缓冲液，消除了软骨内部组织液渗透压带来的影响，实现了组织从高渗环境到等渗环境的逐步过渡，避免了软骨纤维变性导致力学性能受到影响；
2、本发明提供的检测方法，可以有效地检测关节软骨不同分层结构力学性质，具有准确性高、结果数据可靠、目的性强、可重复性好、易于操作等特点。
附图说明
图1为实施例1的检测结果示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，包括以下步骤：
(1)取材
选取新鲜屠宰或处死猪的关节样本，该关节样本整体外形均匀，无骨赘增生物，软骨表面完整光滑无破损；连续用内径6mm打孔器钻取4个圆柱体软骨-骨块；打磨至底面光滑并且高度一致，约为5mm，使用生理盐水冲洗3次后于4℃环境下暂存；
(2)组织平衡
配置高渗缓冲液：称取16g NaCl，0.4g KCI，1g NaN3，2.88g Na2HPO4和0.48gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L；
配置等渗缓冲液：称取8g NaCl，0.2g KCl，1g NaN3，1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L；
将暂存的软骨-骨块取出置于4℃高渗缓冲液中浸泡30min，再置于4℃等渗缓冲液中浸泡30min；
(3)包埋
将浸于4℃等渗缓冲液的骨块取出用纱布吸去多余的水分，移至塑料包埋盒，保持软骨面朝向下的状态，加入OCT包埋剂于室温下浸泡4h；将包埋盒置于托物台上30min，可观察到OCT包埋剂逐渐变白硬化；在冰冻切片机样品托上涂少量OCT包埋剂，将包埋好的组织取下与样品托粘连；
(4)切片
将样品托固定于恒温冰冻切片机上，小心地将刀架底座沿着滑槽向样品方向移动，直到刀片快要接触到样本，将刀架锁定在该位置上，使用控制旋钮调整样本方向与刀片切面平行；连续切去2μm厚度切片并置于显微镜下观察，直至可观察到切片出现软骨表组织，此时说明软骨最表层已经暴露；再分别切除100μm、200μm、300μm的组织，剩余的软骨-骨块分别标记为-100组、-200组和-300组，软骨最表层已经暴露并且不继续切除组织的标记为control组；将control组、-100组、-200组和-300组均置于4℃等渗缓冲液中保存；
(5)检测
将软骨-骨块置于DMA载物平台上，选择大小合适的压缩模具，校准机器后，压缩模式下分别测试control组、-100组、-200组和-300组的压缩模量。
由图1可知，control组与-100组的应力应变曲线斜率相近，-200组与-300组的斜率依次降低，说明压缩模量发生了显著改变。因此也可以得出以下结论，保持完整的表层水平排列的纤维层对软骨的整体力学性能有重要作用，当表层纤维结构被完全去除后，软骨整体力学性能有了显著变化，弹性模量明显降低。
实施例2
本实施例提供了一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，包括以下步骤：
(1)取材
选取新鲜屠宰或处死猪的关节样本，该关节样本整体外形均匀，无骨赘增生物，软骨表面完整光滑无破损；连续用内径7mm打孔器钻取4个圆柱体软骨-骨块；打磨至底面光滑并且高度一致，约为6mm，使用生理盐水冲洗4次后于4℃环境下暂存；
(2)组织平衡
配置高渗缓冲液：称取16g NaCl，0.4g KCI，1g NaN3，2.88g Na2HPO4和0.48gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L；
配置等渗缓冲液：称取8g NaCl，0.2g KCl，1g NaN3，1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L；
将暂存的软骨-骨块取出置于4℃高渗缓冲液中浸泡30min，再置于4℃等渗缓冲液中浸泡30min；
(3)包埋
将浸于4℃等渗缓冲液的骨块取出用纱布吸去多余的水分，移至塑料包埋盒，保持软骨面朝向下的状态，加入OCT包埋剂于室温下浸泡3h；将包埋盒置于托物台上45min，可观察到OCT包埋剂逐渐变白硬化；在冰冻切片机样品托上涂少量OCT包埋剂，将包埋好的组织取下与样品托粘连；
(4)切片
将样品托固定于恒温冰冻切片机上，小心地将刀架底座沿着滑槽向样品方向移动，直到刀片快要接触到样本，将刀架锁定在该位置上，使用控制旋钮调整样本方向与刀片切面平行；连续切去2μm厚度切片并置于显微镜下观察，直至可观察到切片出现软骨表组织，此时说明软骨最表层已经暴露；再分别切除150μm、300μm、450μm的组织，剩余的软骨-骨块分别标记为-150组、-300组和-450组，软骨最表层已经暴露并且不继续切除组织的标记为control组；将control组、-150组、-300组和-450组均置于4℃等渗缓冲液中保存；
(5)检测
将软骨-骨块置于DMA载物平台上，选择大小合适的压缩模具，校准机器后，压缩模式下分别测试control组、-150组、-300组和-450组的压缩模量。
实施例3
本实施例提供了一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，包括以下步骤：
(1)取材
选取新鲜屠宰或处死猪的关节样本，该关节样本整体外形均匀，无骨赘增生物，软骨表面完整光滑无破损；连续用内径8mm打孔器钻取5个圆柱体软骨-骨块；打磨至底面光滑并且高度一致，约为6mm，使用生理盐水冲洗5次后于4℃环境下暂存；
(2)组织平衡
配置高渗缓冲液：称取16g NaCl，0.4g KCI，1g NaN3，2.88g Na2HPO4和0.48gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L；
配置等渗缓冲液：称取8g NaCl，0.2g KCl，1g NaN3，1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L；
将暂存的软骨-骨块取出置于4℃高渗缓冲液中浸泡30min，再置于4℃等渗缓冲液中浸泡30min；
(3)包埋
将浸于4℃等渗缓冲液的骨块取出用纱布吸去多余的水分，移至塑料包埋盒，保持软骨面朝向下的状态，加入OCT包埋剂于室温下浸泡5h；将包埋盒置于托物台上30min，可观察到OCT包埋剂逐渐变白硬化；在冰冻切片机样品托上涂少量OCT包埋剂，将包埋好的组织取下与样品托粘连；
(4)切片
将样品托固定于恒温冰冻切片机上，小心地将刀架底座沿着滑槽向样品方向移动，直到刀片快要接触到样本，将刀架锁定在该位置上，使用控制旋钮调整样本方向与刀片切面平行；连续切去2μm厚度切片并至于显微镜下观察，直至可观察到切片出现软骨表组织，此时说明软骨最表层已经暴露；再分别切除200μm、400μm、600μm的组织，剩余的软骨-骨块分别标记为-200组、-400组和-600组，软骨最表层已经暴露并且不继续切除组织的标记为control组；将control组、-200组、-400组和-600组均置于4℃等渗缓冲液中保存；
(5)检测
将软骨-骨块置于DMA载物平台上，选择大小合适的压缩模具，校准机器后，压缩模式下分别测试control组、-200组、-400组和-600组的压缩模量。
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (7)

1.一种检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取材
选取新鲜屠宰或处死猪的关节样本，连续用内径6-8mm打孔器钻取4-5个圆柱体软骨-骨块；打磨至底面光滑并且高度一致，使用生理盐水冲洗3-6次；
(2)组织平衡
将经过步骤(1)处理后的软骨-骨块依次浸泡于高渗缓冲液和等渗缓冲液中，分别浸泡20-30min；
(3)包埋
将浸泡后的软骨-骨块吸去水分，于包埋剂中室温浸泡3-5h，静置0.5-1h；
(4)切片
将静置后的软骨-骨块进行切片，首先切片至出现软骨表组织，再切去梯度厚度的切片，将剩余的软骨-骨块置于等渗缓冲液中冲洗；
(5)检测
将冲洗后的软骨-骨块置于DMA载物平台上，使用压缩模具，校准机器后，压缩模式下测试压缩模量，随后分析压缩模量大小的差异性，统计分析并得出结论。
2.如权利要求1所述的检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，步骤(1)所述关节样本整体外形均匀，无骨赘增生物，软骨表面完整光滑无破损。
3.如权利要求1所述的检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，步骤(2)所述高渗缓冲液通过以下方法制得：称取16g NaCl，0.4g KCI，1g NaN3，2.88g Na2HPO4和0.48g KH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，即得。
4.如权利要求1所述的检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，步骤(2)所述等渗缓冲液通过以下方法制得：称取8g NaCl，0.2g KCl，1g NaN3，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，即得。
5.如权利要求1所述的检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，所述高渗缓冲液和等渗缓冲液的温度均为3-5℃。
6.如权利要求1所述的检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，所述步骤(3)静置后的软骨-骨块还包括以下步骤：于冰冻切片机样品托上涂抹包埋剂，将静置后的软骨-骨块与样品托粘连。
7.如权利要求1所述的检测关节软骨不同分层结构力学性质的方法，其特征在于，步骤(4)所述梯度厚度包括100μm、200μm、300μm、400μm及以上厚度。
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许刚: "缺损关节软骨棘轮实验及冲击响应的数值研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

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